Nghiên cứu tăng cường khả năng chịu mặn bằng chuyển gen Coda trên mô hình cây xoan ta ( Melia Azedarach L.)

i Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN TH HIỀN NGHIÊN CƢ́ U TĂNG CƢỜ NG KHẢ NĂNG CHỊ U MẶ N BẰ NG CHUYỂ N GEN CODA TRÊN MÔ HÌ NH CÂY XOAN TA (MELIA AZEDARACH L.) Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 02 01 ii Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜ I CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệ u và kế t quả nghiên cƣ́ u trong luậ n văn là trung thƣ̣ c v chƣa đƣc s dng đ bảo v mt hc v no. Tc giả luận văn Nguyễ n Thị Hiề n iii Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜ I CẢ M ƠN Để hoà n thnh luậ n văn ny, tôi xin trân trọ ng cả m ơn PGS. TS. Chu Hoà ng Hà – Ph Vin trƣởng Vin Công ngh Sinh hc, Trƣở ng phò ng Công nghệ tế bà o thƣ̣ c vậ t – Việ n Công nghệ Sinh họ c – Việ n Khoa hc và Công ngh Vit Nam. Đ tận tnh hƣng dẫ n, ch bảo v gip đ tôi trong suố t quá trình thực hin và hon chnh luận văn. Qua đây, tôi cũ ng xin bà y tỏ lò ng biế t ơn sâu sắ c tớ i tậ p thể cá n bộ phò ng Công nghệ Tế bà o thƣ̣ c vậ t – Việ n công nghệ sinh họ c , đ nhit tnh gip đ, góp ý v đng viên tôi trong thời gian thực tập tại phòng. Tôi cũ ng xin đƣợ c trân trọ ng cả m ơn Ths Bù i Văn Thắ ng -Trƣờ ng Đạ i họ c Lâm nghiệ p đ c nhiều đng gp gip tôi hoà n thà nh luậ n văn nà y. Tôi xin cả m ơn sƣ̣ giú p đỡ và tạ o điề u kiệ n vô cù ng quý bá u củ a Ban Giá m hiệ u, cc thy cc cô trong khoa Khoa hc Sự sng , phòng Sau đạ i họ c Trƣờ ng Đạ i hc khoa hc – Đạ i họ c Thá i Nguyên để tôi có thể hoà n thà nh tố t khó a họ c. Cuố i cù ng tôi xin by tỏ lòng biết ơn đến nhƣ̃ ng ngƣờ i thân trong gia đì nh và bạn b , đồ ng nghiệ p đã tạ o điề u kiệ n , quan tâm, gip đ, chia sẻ, đng viên và khch l tôi trong sut qu trnh hc tập , thƣ̣ c hiệ n nghiên cƣ́ u đề tà i và thƣ̣ c hiệ n thnh công luận văn ny. Tc giả luận văn Nguyễ n Thị Hiề n iv Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC MỞ ĐẦ U 1 1. Đt vn đề 1 2. Mc tiêu nghiên cƣ́ u 2 3. Ni dung nghiên cƣ́ u 3 Chƣơng 1 TNG QUAN TI LIU 4 1.1. Gii thiu về cây Xoan ta (Melia azedarach L.) 4 1.1.1. Nguồn gc v phân b của cây Xoan ta 4 1.1.2. Đc đim sinh hc 4 1.1.3. Gi tr s dng 5 1.1.4. Tình hình nghiên cứu ứng dng công ngh sinh hc đ cải tiến ging Xoan ta 6 1.2. Cơ chế chng chu cc điều kin bt li của môi trƣờng ở thực vật 6 1.2.1. Cơ chế chu mn của thực vật 8 1.2.2. Vai trò của glycine betain đi vi tnh chng chu ở thực vật 12 1.2.3. Cơ chế sinh tổng hp glycine betaine 13 1.2.4. Nguồn gc v đc đim của gen codA 15 1.3. S dng gen codA trong cải tạo ging cây trồng 15 Chƣơng 2 VẬT LIU V PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1. Vật liu nghiên cƣ́ u 19 2.1.1. Vật liu 19 2.1.2. Ha cht 20 2.1.3. Môi trƣờ ng nuôi cấy 21 2.1.4. Thiết b - Máy móc 22 2.2. Phƣơng php nghiên cƣ́ u 22 2.2.1. Thiết kế cu trc vector chuyn gen pBI121 mang gen codA 22 2.2.2. Tạo chủng vi khun Agrobacterium tumefaciens mang vector chuyể n gen 29 2.2.3. Tạo cây Xoan ta chuyn gen mang gen codA 30 Chƣơng 3 KẾT QUẢ V THẢO LUẬN 34 3.1. Kết quả nhân dòng gen codA từ vector tch dòng pBluesript II SK - codA 34 v Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.2. Kết quả thiết kế cu trc vector v tạo chủng vi khun mang vector chuyn gen 35 3.2.1. Kết quả thiết kế cu trc vector chuyn gen pBI121- codA 35 3.2.2. Kết quả biến nạp vector ti tổ hp (pBI121-codA) vào E. coli DH5α 36 3.2.3. Kết quả sng lc dòng vi khun E. coli DH5α mang vector ti tổ hp 37 3.2.4. Kết quả biến nạp vector chuyn gen (pBI121-codA) vào A. tumefaciens 39 3.2.5. Kết quả sng lc dòng A. tumefaciens mang vector chuyn gen 40 3.3. Kết quả tạo dòng Xoan ta mang cu trc gen codA 42 3.3.1. Kết quả chuyn gen v ti sinh chồi Xoan ta chuyn gen 42 3.3.2. Kết quả tạo cây chuyn gen hon chnh (ra rễ) 45 3.3.3. Kế t quả ra cây v kim tra cây chuyn gen ngoi nh lƣi 46 3.3.4. Kế t quả đá nh giá sơ b cc dòng Xoan ta chuyể n gen trên môi trƣờ ng mui . 47 KẾT LUẬN V KIẾN NGHỊ 51 TI LIU THAM KHẢO 52 PH LC 57 vi Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤ C CÁ C CHƢ̃ VIẾ T TẮ T AS bp BAP C:I Acetosyrigone Cp base (base pair) 6-benzyl adenin purine Chloroform : Isoamyl alcolhol CodA DNA Gen mã hóa Choline oxydase Deoxyribonucleic acid dNTPs Gus Deoxynucleotide triphosphate β-Glucuronidase gene = Gen m ho β- Glucuronidase E. coli EDTA Escherichia coli Ethylene Diamin Tetra Acetate IBA Indole 3 - butyric acid kb LB MS kilo base (1 kb = 1000 base) Luria – Bertani Murashige and Skoog OD PCR Mật đ quang hc (Optical density) Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi polymerase SDS T-DNA TAE Ti-Plasmid TE WT Sodium doecyl sulphate Transfer – DNA = DNA chuyn Tris base – Acetic acid – EDTA Tumor inducing plasmid = Plasmid gây khi u thực vật Tris-EDTA Cây không chuyn gen vii Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤ C BẢ NG Bảng 2.1. Trnh tự cc mồi nhân gen codA 20 Bảng 2.2. Thnh phn dung dch tch plasmid 20 Bảng 2.3. Môi trƣờng nuôi cy vi khun 21 Bảng 2.4. Môi trƣờ ng nuôi và chn lc cây Xoan ta chuyn gen 21 Bảng 2.5. Thnh phn cc loại môi trƣờng gây nhiễm mn nhân tạo 22 Bảng 2.6. Thnh phn phản ứng PCR nhân gen codA 23 Bảng 2.7. Thnh phn phản ứng xƣ̉ lý enzyme giớ i hạ n 24 Bảng 2.8. Thnh phn phản ứng ghép ni gen codA vi vector pBI121 26 Bảng 2.9. Thnh phn phản ứng PCR kiể m tra plasmid 28 Bảng 2.10. Thnh phn phản ứng cắt plasmid ti tổ hp bằ ng enzyme giớ i hạ n 29 Bảng 2.11. Thnh phn dung dịch tá ch chiế t DNA 32 Bảng 2.12. Thnh phn phản ứng PCR kim tra DNA tổng s. 33 Bảng 3.1. Kết quả ti sinh chồi Xoan ta chuyn gen sau hai ln chn lc 42 Bảng 3.3. Khả năng chịu mặ n củ a cc dòng Xoan ta chuyể n gen codA. 48 viii Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤ C CÁ C HÌ NH Hnh 1.1. Rừng, cây Xoan ta trƣởng thnh 4 Hình 1.2. Dạng hoa v quả xoan 5 Hnh 1.3. Chu trnh sinh tổng hp GB ở thực vật 14 Hình 1.4. Chu trình sinh tổng hp GB ở vi khun E.coli 14 Hình 3.1. Hnh ảnh đin di sản phm PCR nhân gen codA từ vector tách dòng 35 Hình 3.2. Hnh ảnh đin di sản phm tinh sạch gen codA từ sản phm PCR 35 Hnh 3.3. Hnh ảnh đin di gen codA và vector pBI121-gus cắt bằng cp enzyme gii hạn XbaI và SacI 36 Hnh 3.4. Hnh ảnh đin di sản phm thôi gel gen codA v vector pBI12 mở vòng 36 Hnh 3.5. Hnh ảnh khun lạc vi khun E. coli DH5α đƣc biến nạp plasmid tá i tổ hợ p mc trên môi trƣờng LB bổ sung 50 mg/l kanamycin 37 Hnh 3.6. Hnh ảnh plasmid ti tổ hp tch từ vi khun E. coli 38 Hnh 3.7. Hnh ảnh đin di sản phm PCR nhân gen codA từ plasmid ti tổ hp. 39 Hnh 3.8. Hnh ảnh đin di plasmid ti tổ hp pBI121-codA cắt bằng XbaI và I. 39 Hnh 3.9. Khun lạc Agrobacterium tumefacies EHA101 biến nạp vector pBI121-codA mc trên môi trƣờng LB bổ sung 50 mg/l kanaSacmycin, 50 mg/l rifamycin 40 Hình 3.10. Hnh ảnh đin di plasmid ti tổ hp (pBI121- codA) tch chiết từ A. tumefaciens . 41 Hình 3.11. Hnh ảnh đin di sản phm PCR nhân codA từ plasmid ti tổ hp tch từ A. tumefaciens. 41 Hnh 3.12. Mẫ u Xoan ta lây nhiễ m trong dịch huyề n phù A. tumefacien 43 Hnh 3.13. Mẫ u Xoan ta trên môi trƣờng đồng nuôi cy CCM 43 Hnh 3.14. Mảnh l chuyn gen trên môi trƣờng SM sau 1 tun nuôi cy 43 Hnh 3.15. Đoạ n thân chuyn gen trên môi trƣờng SM sau 1 tun nuôi 43 Hnh 3.16. Chồi ti sinh từ đoạn thân chuyn gen trên môi trƣờng SM ln 1 sau 2 tun nuôi cy 43 Hnh 3.17. Chồi ti sinh từ đoạn thân chuyn gen trên môi trƣờng SM ln 1 sau 3 tun nuôi cy 43 ix Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Hnh 3.18. Chồi ti sinh từ mảnh l chuyn gen trên môi trƣờng SM ln 1 sau 4 tun nuôi cy 44 Hnh 3.19. Chồi ti sinh từ đoạn thân chuyn gen trên môi trƣờng SM ln 1 sau 4 tun nuôi cy 44 Hnh 3.20. Chồi Xoan ta chuyn gen ti sinh trên môi trƣờng SM ln 2 sau 4 tun nuôi cy. 44 Hnh 3.21 Mảnh l không chuyn gen (ĐC) trên môi trƣờng SM sau 4 tun nuôi cy . 44 Hnh 3.22. Đoạn thân không chuyn gen (ĐC) trên môi trƣờng SM sau 4 tun nuôi cy 44 Hình 3.23. Hnh ảnh chồi Xoan ta chuyn gen ra rễ trên môi trƣờng PSM 45 Hình 3.24. Hnh ảnh chồi Xoan ta không chuyn gen (ĐC) trên môi trƣờng PSM 46 Hnh 3.25. Hnh ảnh cây xoan ta chuyể n gen trồ ng trong nhà lƣớ i. 46 Hnh 3.26. Hnh ảnh đin di sản phm PCR nhân gen codA từ DNA genome tch chiết từ cây Xoan ta chuyn gen v cây không chuyn gen 47 Hnh 3.27. Đồ th sinh trƣởng của cc 3 dòng Xoan ta chuyn gen v đi chứng trên môi trƣờng ti sinh c cc nồng đ NaCl khc nhau 49 Hình 3.28. Sinh trƣởng của dòng Xoan ta XT20 chuyn gen codA v dòng WT không chuyn gen trên môi trƣờng ti sinh c nồng đ NaCl khc nhau 50 1 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦ U 1. Đt vn đề Trên thế gii, các nghiên cứu nâng cao tính chng chu đi vi cc điều kin bt li từ môi trƣờng (hạn hán, nhiễm mn, nhit đ cao, nhit đ thp…) đ v đang đƣc tiến hành trên nhiều đi tƣng cây trồng khác nhau. Trong lâm nghip, loi cây đƣc s dng nhƣ l mt loại cây mô hình cho các nghiên cứu trên thế gii l cây dƣơng (Populus sp.). Tuy nhiên, hạn chế duy nht của loi cây ny đ l kh sinh trƣởng trong điều kin khí hậu của Vit Nam. Vì vậy, vic tìm kiếm mt loài cây dễ thích ứng và phổ biến đ làm cây mô hình cho các nghiên cứu theo hƣng quan tâm trên đi tƣng cây lâm nghip trở nên cn thiết. Cây Xoan ta đƣc đnh giá là mt trong những cây trồng quan trng trong chiến lƣc phát trin lâm nghip ở nƣc ta. Hơn nữa, những kết quả nghiên cứu bƣc đu trong vic xây dựng phƣơng php chuyn gen ở đi tƣng cây xoan ta là rt có trin vng [3], [4], [8], [9], [23], [36], [37], cho phép các nhà khoa hc có th tiến hành các nghiên cứu cải thin ging, đc bit là nâng cao tính chng chu của loài cây này và có th s dng nhƣ mt mô hình cho các loài cây lâm nghip đc hữu của Vit Nam. Những tc đng bt li từ môi trƣờng nhƣ: hạn hán, ngập mn, ngập úng, nhit đ cực đoan đ tc đng mạnh mẽ đến sự sinh trƣởng và phát trin của các loài cây trồng. Cũng nhƣ cc loài sinh vật khác, khi gp cc điều kin bt li từ môi trƣờng, thực vật có khả năng sinh ra cc cơ chế thch nghi khc nhau đ có th tồn tại, sinh trƣởng và phát trin bnh thƣờng. Cơ chế thƣờng gp nht khi cây gp các điều kin bt li về nƣc đ l tăng cƣờng khả năng duy tr sức căng của các mô, tế bào thông qua vic tăng cƣờng tổng hp các cht nhƣ cc loại đƣờng tan, các loại acid amin,… đ tăng p sut thm thu. Glycine betaine và proline là hai trong s những cht trao đổi đƣc quan tâm do sự tích lũy hm lƣng cao các hp cht này khi cây gp cc điều kin bt li từ môi trƣờng, đc bit là những yếu t liên quan đến áp sut thm thu ni bào. Ở mt s loài thực vật bậc cao, glycine betaine đƣc tổng hp thông qua mt chuỗi gồm hai phản ứng từ choline đƣc chuyn hóa thành betaine aldehyde nhờ [...]... lý do trên , tôi tiên hanh thƣc hiên đê tai ́ ́ ̀ ̃ ́ ̀ ̣ ̣ ̀ ̀ Nghiên cưu ́ tăng cương kha năng chị u măn băng chuyên gen codA trên mô hì nh cây xoan ta ̀ ̉ ̣ ̀ ̉ (Melia azedarach L.) 2 Mục tiêu nghiên cƣu ́ - Thiết kế đƣợc vector mang gen codA, nhằm mục đích tạo giống cây trồng có khả năng chống chịu tốt các điều kiện bất lợi của môi trƣờng; - Tạo đƣợc mô t số dòng cây Xoan ta chuyển... ́ gen codA ở các dòng cây Xoan ta chuyển gen; - Đánh giá khả năng chịu mặn, sinh trƣởng và phát triển của các dòng cây Xoan ta chuyển gen bằng phƣơng pháp nhiễm mặn nhân tạo Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 4 Chƣơng 1 TÔNG QUAN TAI LIÊU ̉ ̀ ̣ 1.1 Giới thiệu về cây Xoan ta (Melia azedarach L.) 1.1.1 Nguồn gốc và phân bố của cây Xoan ta Cây Xoan ta. .. chuyên gen codA tăng cƣơng ́ ́ ̉ ̀ khả năng chịu lạnh , nhiêt đô cao va măn [15], [28], cây cai be (Brassica juncea) ̣ ̣ ̀ ̣ ̉ ̣ chuyên gen codA có khả năng chị u măn , hạn tốt hơn cây đối chứng không chuyển ̉ ̣ gen [24], cây lúa chuyên gen codA tăng cƣơng kh ả năng chị u lanh , mặn [28], cây ̉ ̀ ̣ Salanum lycopersium chuyên gen codA cũng tăng cƣờng kh ả năng chị u la nh va ̉ ̣ ̀ măn và cây. .. tƣơng tự Nghĩa là, cây chuyển gen codA có khả năng chống chịu đƣợc các điều kiện bất lợi từ môi trƣờng: mặn, lạnh, hạn và nhiệt độ cao [19] Ngoài ra, không dừng lại ở cây mô hình A thaliana, nhiều tác giả đã nghiên cứu chuyển gen codA vào mô t số loài cây trồng nhƣ: cây hồng Nhật bản (Diospyros kaki), cây cải bẹ, cây cà chua, cây bạch đàn, cây ngô, cây đậu tƣơng, cây thuốc lá, [19],... thích hợp với cây Xoan ta Cây Xoan ta có hệ rễ ngang khá phát triển, thƣờng ăn nông và lan rộng, rễ cọc ăn sâu Xoan ta thƣờng phân cành sớm, khả năng đâm chồi mạnh nên có thể lợi dụng tái sinh chồi đƣợc [1] 1.1.3 Giá trị sử dụng Xoan ta là loài cây thân gỗ lớn, đa ta c dụng, cây Xoan ta có thể đƣợc trồng rừng để lấy gỗ lớn hay trồng để che bóng và phòng hộ Gỗ xoan ta thuộc nhóm... nhất mô t công trình công bố về chuyển gen GFP vào cây Xoan ta, ở Việt Nam có 5 công trình công bố về chuyển gen vào cây Xoan ta: Chuyển gen gus và bar [8]; Chuyển gen 4Cl [37]; Chuyển gen GA20 [3], [4] Ở Việt Nam, trong những năm gần đây cây Xoan ta đƣợc đánh giá là mô t trong những cây trồng quan trọng trong 6/9 vùng sinh thái lâm nghiệp trọng điểm [7] Mô t số trung tâm nghiên. .. sinh trong điều kiện môi trƣờng bất lợi [38] 1.3 Sử dụng gen codA trong cải tạo giống cây trồng tăng cƣờng khả năng chống chịu điều kiện bất lợi của môi trƣờng Nhiều nghiên cứu chủ yếu tập trung vào tạo dòng và phân lập các gen liên quan đến sinh tổng hợp glycine betaine nhƣ: CMO, BADH, codA từ những cơ thể sinh vật có khả năng tích lũy glycine betaine mô t cách tự nhiên Gen mã hóa cho CMO và... Xoan ta chuyển gen mang gen codA có khả năng chịu mặn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3 3 Nội dung nghiên cƣu ́ - Nhân dòng gen codA từ vector tách dòng pBluesript II SK và thiết kế cấu trúc mang gen codA đƣợc điều khiển bởi promoter 35S - Nghiên cứu tạo cây Xoan ta chuyển gen mang cấu trúc gen codA; - Trông, chăm soc câ y chuyên gen ngoai nha lƣơi... Tình hình nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học để cải tiến giống Xoan ta Cây Xoan ta là loài cây đa ta c dụng, có giá trị cao Trên thế giới và ở Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu về đặc điểm lâm sinh học, công dụng của chúng đối với con ngƣời và môi trƣờng sinh thái Tuy nhiên, các nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học để cải tiến chất lƣợng giống Xoan ta lại... đƣợc chứng minh là có khả năng chống chịu tốt với điều kiện stress Khả năng Loài Gen Sự tích lũy GB Cơ quan chống (cơ quan) đích chịu bất Tài liệu tham khảo lợi Arabipopsis codA thaliana Arabipopsis codA codA thaliana codA kaki codA globulus) Lạnh Nồng độ chƣa xác trọng lƣợng khô codA codA codA 0.82 µmol g-1 trọng lƣợng tƣơi (lá) 0.1-0.3 µmol g-1 trọng lƣợng tƣơi (lá) 1991a Lục lạp . cây Xoan ta Cây Xoan ta có tên khoa hc (Melia azedarach L. ) thuc h Xoan (Meliaceae) hay còn gi l h Dái ngựa, b Bồ hòn (Sapindales), ngành Ngc lan (Magnoliophyta). H Xoan có khoảng. đây: (1 ). Glycine betaine (l dẫn xut methyl ha nhm nitơ của amino acid); (2 ). Proline và ectoine (amino acid); (3 ). Polyols và trehalose (l mt hp cht polyme không phải đƣờng); (4 ). . nhƣ̃ ng l do trên , tôi tiế n hà nh thƣ̣ c hiệ n đề ta i Nghiên cứ u tăng cườ ng khả năng chị u mặ n bằ ng chuyể n gen codA trên mô hì nh cây xoan ta (Melia azedarach L. ) . 2.