Tạo cây Xoan ta chuyển gen mang gen codA

3. Nội dung nghiên cƣ́u

2.2.3. Tạo cây Xoan ta chuyển gen mang gen codA

2.2.3.1. Chuyển gen codA vào cây xoan ta bằng Agrobacterium tumefaciens

* Tạo dịch huyền phù Agrobacterium tumefaciens mang vector pBI121-codA

Lấy một khuẩn lạc tròn đều, đƣ́ng riêng biệt phát triển tốt trên đĩa khuẩn giữ chủng cấy vào 10 ml môi trƣờng LB lỏng có bổ sung 50 mg/l kanamycin và 50 mg/l

rifamycine, nuôi lắc 200 v/p, ở nhiệt độ 28oC qua đêm (14 – 16h). Lấy 5 ml dịch

khuẩn chuyển sang 50 ml môi trƣờng LB lỏng không bổ sung kháng sinh để nuôi

phục hồi khuẩn trong 5 giờ. Ly tâm tốc độ 5.000 v/p trong 10 phút ở 4oC và hòa tan

khuẩn trong dung dịch (1/2 MS lỏng bổ sung 200 µM AS, pH 5,8). Sử dụng vi

khuẩn A. tumefaciens có mật độ tế bào (OD600=0,5) để biến nạp.

* Tạo nguyên liệu chuyển gen

Hạt Xoan ta đƣợc khử trùng bằng cồn 70% trong 2 phút, tiếp theo khử trùng bằng Javen 60% trong 20 phút, rửa sạch bằng nƣớc cất vô trùng 5 lần, thấm khô và cấy lên môi trƣờng SRM. Nuôi dƣới điều kiện dàn đèn phòng nuôi cấy, sau 2 tuần hạt tái sinh thành cây mầm. Cắt lấy phần lá mầm (cắt bỏ 2 đầu lá mầm) và thân

31

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

mầm (cắt thành đoạn dài 1 cm) tiền nuôi cấy 2 ngày trên môi trƣờng PreM để làm vật liệu chuyển gen.

* Nhiễm khuẩn và đồng nuôi cấy

Ngâm mẫu tr ong dịch huyền phù vi khuẩn đã bổ sung 200µM AS, thời gian nhiễm khuẩn 30 phút, cƣ́ 5 phút lắc nhẹ để giúp vi khuẩn dễ dàng xâm nhập vào thể nhận gen. Sau đó đặt lên giấy thấm vô trùng thấm khô và cấy trên môi trƣờng đồng nuôi cấy (CCM). Đồng thời cũng tiến hành cấy 10 mẫu làm đ ối chứng không lây

nhiễm vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens trên môi trƣờng đồng nuôi cấy. Đặt

trong tối 48h.

* Tái sinh và chọn lọc chồi chuyển gen

Sau 2 ngày đồng nuôi cấy, các mẫu Xoan biến nạp đƣợc đem rƣ̉a khuẩn bằng

dung dịch H2O + 500 mg/l cefotaxime trong 15 phút. Sau đó đặt lên giấy thấm, thấm

khô và cấy chuyển sang môi trƣờng tái sinh chồi chọn lọc (SM). Sau 4 tuần nuôi cấy, tiếp tục chuyển các cụm chồi tái sinh sang môi trƣờng tái sinh chồi chọn lọc mới (SM) trong 4 tuần.

* Tạo cây chuyển gen hoàn chỉnh (ra rễ)

Sau 2 lần chọn lọc trên môi trƣờng có 150 mg/l kanamycin (SM), tách các chồi đơn ra khỏi cụm chồi và cấy chuyển sang môi trƣờng tạo cây chuyển gen hoàn chỉnh (PSM). Nuôi 2 -3 tuần dƣới điều kiện dàn đèn, các chồi ra rễ đƣợc là các chồi chuyển gen (Chồi đối chứng không chuyển gen không ra rễ đƣợc trên môi trƣờng PSM).

2.2.3.2. Trồng, chăm sóc cây chuyển gen ngoài nhà lư ới và kiểm tra sự có mặt gen codA

Các dòng xoan chuyển gen sau khi chọn lọc tạo cây chuyển gen hoàn chỉnh trên môi trƣờng PSM đƣợc huấn luyện để thích nghi với điều kiện tự nhiên trong 2 tuần ở nhiệt độ môi trƣờng. Sau đó, đƣợc đƣa ra trồng trong nhà lƣới để đánh giá khả năng sinh trƣởng, phát triển và phát sinh hình thái.

Chọn 12 dòng Xoan ta chuyển gen và dòng đối chứng (không chuyển gen) để tách DNA tổng số làm khuôn kiểm tra PCR.

32

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn * Tách chiết DNA theo quy trình như sau:

- Bƣớc 1: Chuẩn bị dung dịch đệm chiết EB và ủ ở 65oC có thành phần nhƣ sau:

Bảng 2.11. Thành phần dung dịch tách chiết DNA

Hóa chất Nồng độ sử dụng Nồng độ cuối 100 ml buffer EB

CTAB 2 % 2 g

PVP 2 % 2 g

NaCl 1,4 M 5 M 28 ml

EDTA, pH 8,0 20 m M 0,5 M, pH 8,0 4 ml

Tris HCl, pH 8,0 100 mM 1 M, pH 8,0 10 L

- Bƣớc 2: Nghiền 200mg lá trong nitơ lỏng, sau đó bổ sung 800µl đệm chiết

EB. Trộn đều và đặt ngay vào bể 65oC ủ ít nhất 1 giờ, 10 phút đảo một lần.

- Bƣớc 3: Bổ sung 800µl chloroform : isoamyl alcohol (24:1) lắc và đảo mạnh trong 5 phút và ly tâm 13000 v/p trong 15 phút.

- Bƣớc 4: Chuyển pha trên sang ống eppendorf 1,5ml mới. Bổ sung 2 lần thể

tích ethanol 100% để tủa DNA ở -20oC qua đêm.

- Bƣớc 5: Ly tâm 13000 v/p trong 15 phút, thu tủa DNA và rửa bằng 500µl ethanol 70% 2 lần.

- Bƣớc 6: DNA đƣợc làm khô và hòa tan hoàn toàn trong 30µl nƣớc khử ion. - Bƣớc 7: Điện di kiểm tra trên gel agarose 1%.

* PCR với cặp mồi đặc hiệu TP-XbaI và Cmyc-SacI

Để kiểm tra sự có mặt của gen codA trong các dòng Xoan ta chuyển gen,

chúng tôi sử dụng DNA tổng số tách ở phần trên làm khuôn để thực hiện phản ứng

33

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Bảng 2.12. Thành phần phản ứng PCR kiểm tra DNA tổng số.

TT Thành phần Thể tích (µl)

1 Nƣớc khử ion 9,5

2 Đệm PCR 10X 2

3 MgCl2 (25mM) 2

4 dNTPs (10 mM) 2

5 Mồi F: TP-XbaI 1

6 Mồi R: CMYC-Rsac 1

7 DNA tổng số 2

8 Taq DNA polymerase (5u/µl) 0,5

Tổng thể tích 20 µl

Phản ứng PCR nhân gen codA bằng cặp mồi F: TP-XbaI và R: Cmyc-SacI

thực hiện theo chu kỳ nhiệt độ nhƣ sau: 940C/3 phút; 35 chu kì [940C/1 phút,

550C/50 giây, 720C/1 phút 30 giây]; 720C/10 phút và bảo quản 40C/∞.

Điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 1%, nhuộm, soi gel và chụp ảnh.

2.2.3.3. Phương pháp nhiễm mặn nhân tạo trong phòng thí nghiệm.

Sau khi tạo đƣợc cây chuyển gen hoà n chỉnh trên môi trƣờng PSM, chúng tôi chọn các dòng Xoan ta dƣơng tính v ới PCR để đánh giá khả năng chịu mặn . Các dòng Xoan ta chuyển gen đƣợc cắt nhỏ các đoạn thân và cấy lên môi trƣờng tái sinh có bổ sung các nồng độ muối khác nhau (bảng 2.4) để kiểm tra khả năng tái sinh, sinh trƣởng, phát triển và khả năng chịu muối.

34

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Chƣơng 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả nhân dòng gen codA từ vector tách dòng pBluesript II SK - codA

Vector tách dòng pBluesript II SK mang gen codA tổng hợp nhân tạo bởi hãng

Epoch Life Science, Inc, Mỹ, đƣợc dùng làm khuôn để tiến hành phản ứng PCR nhân gen codA với thành phần phản ứng và chu trình nhiệt nhƣ đã trình bày ở mục (2.2.1.1.).

Tuy nhiên, gen codA gắn trong cấu trúc vector không tồn tại điểm cắt của hai enzyme

giới hạn quan tâm là XbaI và SacI. Do đó, trƣớc khi có thể sử dụng gen codA vào ghép

nối với vector chuyển gen pBI121 tạo vector chuyển gen mang gen codA cần thực hiện

phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu chứa vị trí nhận biết của hai enzyme giới hạn XbaI

và SacI. Dựa vào trình tự gen codA đƣợc tổng hợp chúng tôi đã thiết kế cặp mồi TP-

XbaI (5’-GCTCTAGAATGGCACAAATTAACA-3’) có điểm cắt của enzyme XbaI

(TCTAGA) và CMYC-SacI (5’-CGAGCTCTCAATTCAGATCCTCTTC-3’) có điểm

cắt của enzyme SacI (GAGCTC). Nhƣ vậy, nếu phản ứng PCR xảy ra đặc hiệu theo

tính toán lý thuyết sản phẩm thu đƣợc là băng DNA duy nhất có kích thƣớc khoảng 1,9

kb đã chứa trình tự nhận biết của enzmye XbaI ở đầu 5’ và SacI ở đầu 3’.

Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. Kết quả thu đƣợc cho thấy phản ứng PCR xảy ra đặc hiệu chỉ thu đƣợc một băng DNA duy nhất có kích thƣớc khoảng 1,9 kb so với thang DNA chuẩn 1kb, kích thƣớc phân đoạn DNA

này phù hợp với kích thƣớc của gen codA gắn thêm đoạn tp và cmyc theo tính toán lý

thuyết. Điều này chứng tỏ đã nhân thành công gen codA bằng kỹ thuật PCR. Sản

phẩm PCR thu đƣợc sau phản ứng khuếch đại gen có các tạp chất nhƣ mồi, đệm PCR, các dNTPs,...còn dƣ thừa và có thể chứa các sản phẩm phụ nên nếu sử dụng trực tiếp có thể ảnh hƣởng không tốt đến phản ứng tiếp ghép nối với vector pBI121. Vì vậy,

cần tiến hành tinh sạch thu gen codA. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR theo Bộ kít

của của hãng Fermentas (Mỹ) đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1% (hình 3.2). Kết quả cho thấy chỉ có một băng vạch rõ nét duy nhất có kích thƣớc khoảng 1,9 kb chứng tỏ gen không bị đứt gãy trong quá trình tinh sạch. Nhƣ vậy, có thể kết luận đã

35

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Hình 3.1. Hình ảnh điện di sản phẩm

PCR nhân gen codA từ vector tách

dòng pBluesript II SK- codA

M: DNA 1 kb; giếng 1: gen codA

Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm

tinh sạch gen codA từ sản phẩm PCR

M: DNA 1 kb; giếng 1: gen codA

3.2. Kết quả thiết kế cấu trúc vector và tạo chủng vi khuẩn mang vector chuyển gen 3.2.1. Kết quả thiết kế cấu trúc vector chuyển gen pBI121- codA

Vector pBI121 có kích thƣớc khoảng 13 kb, đoạn T-DNA chứa gen chỉ thị

(gen gus) và gen chọn lọc kháng sinh kanamycin (gen nptII), thỏa mãn yêu cầu của

một vector chuyển gen. Gen gus nằm trên vector pBI121 đƣợc kết nối với vùng

khởi động (35S promoter) bằng enzyme XbaI và với vùng kết thúc (NOS teminator)

bằng enzyme SacI. Trình tự nhận biết của hai enzyme này cũng có ở hai đầu đoạn

codA đã đƣợc nhân bản bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu TP-XbaI và

CMYC-SacI. Do đó, chúng tôi tiến hành phản ứng cắt để loại bỏ gen gus ra khỏi

vector pBI121 và gen codA đã tinh sạch bằng cặp enzyme cắt giới hạn XbaI và SacI.

Kết quả cắt đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1% (hình 3.3).Khi xử lý bởi cặp

enzyme XbaI và SacI, vector pBI121-gus sẽ bị cắt thành hai băng: một băng là gen

gus có kích thƣớc khoảng 1,8 kb và một băng là vector pBI121 mở vòng có kích

thƣớc khoảng 11,2 kb.

Vector pBI121 mở vòng và gen codA có 2 đầu dính sau khi cắt đƣợc thu lại

bằng thôi gel. Sản phẩm thôi gel đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1%

36

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

(hình3.4). Kết quả này cho thấy rằng đã tinh sạch thành công vector pBI121 mở

vòng và gen codA có 2 đầu dính.

Hình 3.3. Hình ảnh điện di gen codA và

vector pBI121-gus cắt bằng cặp

enzyme giới hạn XbaI và SacI

M: DNA 1 kb; giếng 1: gen codA;

giếng 2: vector pBI121-gus.

Hình 3.4. Hình ảnh điện di sản

phẩm thôi gel gen codA và vector

pBI12 mở vòng

M: DNA 1 kb; giếng 1: gen codA;

giếng 2: vector pBI121 mở vòng.

Khi xử lý vector pBI121-gus và gen codA bằng cùng một cặp enzyme giới

hạn sẽ tạo ra các đầu nối tƣơng đồng. Do đó, trộn lẫn vector pBI121 và gen codA

trong dung dịch đệm bổ sung enzyme nối T4 DNA ligase (mục 2.2.1.4) sẽ tạo ra các

phân tử vector tái tổ hợp (pBI121-codA).

3.2.2. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp (pBI121-codA) vào E. coli DH5α

Vector tái tổ hợp pBI 121-codA đƣợc biến nạp vào vi khuẩn E. coli DH5α

theo phƣơng pháp sốc nhiệt ở 420C trong 60 giây (Cohen và cộng sƣ̣ , 1972). Sau

khi biến nạp dịch vi khuẩn đƣợc cấy trải trên môi trƣờng LB đặc có bổ sung kháng

sinh chọn lọc kanamycin 50mg/l, nuôi qua đêm ở 370C. Kết quả biến nạp đƣợc thể

hiện ở hình 3.5 cho thấy có nhiều khuẩn lạc mọc trên môi trƣờng có kháng sinh kanamycin, bƣớc đầu có thể khẳng định đã biến nạp thành công vector tái tổ hợp vào

tế bào vi khuẩn E. coli DH5α.

1 M 2 1,9 kb 1,8 kb 11,2 kb 1,9 kb 11,2 kb 1 M 2

37

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Hình 3.5. Hình ảnh khuẩn lạc vi khuẩn E. coli DH5α đƣợc biến nạp plasmid tái tổ hợp mọc trên môi trƣờng LB bổ sung 50 mg/l kanamycin

3.2.3. Kết quả sàng lọc dòng vi khuẩn E. coli DH5α mang vector tái tổ hợp

Các khuẩn lạc phát triển trên môi trƣờng chọn lọc 50 mg/l kanamycin có thể là các khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp. Tuy nhiên, để khẳng định chắc chắn rằng

dòng khuẩn lạc mang đúng vector tái tổ hợp (pBI121-codA) cần kiểm tra bằng

phƣơng pháp tách chiết plasmid làm khuôn cho phản ứng PCR nhân gen với cặp mồi đặc hiệu và cắt enzyme giới hạn.

3.2.3.1. Kết quả tách chiết plasmid từ vi khuẩn E. coli

Chọn ngẫu nhiên 2 dòng khuẩn lạc trên môi trƣờng có kháng sinh chọn lọc , nuôi lỏng trong 5 ml môi trƣờng LB lỏng có bổ sung 50 mg/l kanamycin, lắc 200

vòng/phút qua đêm, ở 370C. Sau đó, tiến hành tách plasmid theo phƣơng pháp của

Sambrook và Russel [37] có cải tiến nhƣ mục (2.2.1.7.). Sản phẩm tách chiết đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8% (hình 3.6) cho thấy plasmid tái tổ hợp đều có băng vạch rõ nét và không bị đứt gẫy. Kết quả này cho thấy đã tách thành công plasmid tái tổ hợp từ 2 dòng khuẩn lạc.

38

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Hình 3.6. Hình ảnh plasmid tái tổ hợp tách từ vi khuẩn E. coli điện di trên gel agarose 0,8%. M: DNA 1 kb; giếng 1 và 2: plasmid tái tổ hợp

3.2.3.2. Kết quả kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng PCR và cắt enzyme giới hạn

Để khẳng định đoạn xen trong vector tái tổ hợp đúng là gen codA chúng tôi

tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu nhƣ mô tả ở mục (2.2.1.8.).Theo lí

thuyết chỉ những plasmid tái tổ hợp chứa đoạn xen gen codA mới tạo ra sản phẩm

có kích thƣớc khoảng 1,9 kb. Kết quả điện di sản phẩm PCR (hình 3.7) cho thấy chỉ có một băng vạch rõ nét duy nhất có kích thƣớc khoảng 1,9 kb so với thang DNA

chuẩn 1kb, kích thƣớc phân đoạn DNA này phù hợp với kích thƣớc gen codA gắn

thêm đoạn tp và cmyc theo lí thuyết. Nhƣ vậy, có thể khẳng định rằng 2 dòng khuẩn

lạc lựa chọn ngẫu nhiên đều chứa vector tái tổ hợp gắn đoạn xen đúng kích thƣớc mong muốn. Tuy nhiên, để có thể khẳng định một cách chắc chắn đoạn xen là gen quan tâm cần thực hiện thêm phản ứng cắt plasmid tái tổ hợp bằng cặp enzyme cắt

giới hạn XbaI và SacI.

Theo lý thuyết, trong sản phẩm của phản ứng cắt thành công sẽ thu đƣợc hai phân đoạn DNA có kích thƣớc khoảng 1,9 kb và khoảng 11,2 kb. Trong đó, phân đoạn có kích thƣớc khoảng 11,2 kb là của vector pBI121 và phân đoạn còn lại là

của gen codA. Sản phẩm sau cắt bằng XbaI và SacI đƣợc điện di kiểm tra trên gel

agarose 1% (hình 3.8) cho thấy 2 mẫu plasmid đều phân thành hai băng có kích

M 1 2

10 kb

39

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

thƣớc đúng nhƣ tính toán lý thuyết. Điều này chứng tỏ rằng đã tạo đƣợc vector tái tổ

hợp pBI121-codA và có thể sử dụng chúng cho các thí nghiệm tiếp theo.

Hình 3.7. Hình ảnh điện di sản phẩm

PCR nhân gen codA từ plasmid tái tổ hợp.

M: Thang DNA 1 kb; giếng 1 và 2:

sản phẩm PCR nhân gen codA

Hình 3.8. Hình ảnh điện di plasmid

tái tổ hợp pBI121-codA cắt bằng XbaI và SacI.

M: Thang DNA 1 kb; giếng 1và 2: Plasmid tái tổ hợp dòng 1,2 sau khi cắt

bằng XbaIvà SacI.

3.2.4. Kết quả biến nạp vector chuyển gen (pBI121-codA) vào Agrobacterium tumefaciens

Có nhiều phƣơng pháp để biến nạp vector vào tế bào vi khuẩn nhƣ phƣơng pháp sốc nhiệt, phƣơng pháp xung điện, ... Tuy nhiên, để biến nạp vector tái tổ hợp

có kích thƣớc > 10 kb vào tế bào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens thì phƣơng

pháp xung điện đƣợc sử dụng phổ biến hơn cả. Đây là phƣơng pháp biến nạp có hiệu quả khá cao, thời gian thí nghiệm ngắn . Sau khi biến nạp, dịch vi khuẩn đƣợc

cấy trải trên môi trƣờng LB đặc chứa kháng sinh chọn lọc, nuôi ở 280C trong 2

ngày. Kết quả biến nạp đƣợc thể hiện ở hình 3.9.

M 1 2 10 kb 11,2 kb 1,9 kb 2 kb M 1 2 2 kb 1,9 kb

40

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Hình 3.9. Khuẩn lạc Agrobacterium tumefacies EHA101 biến nạp vector pBI121-

codA mọc trên môi trƣờng LB bổ sung 50 mg/l kanamycin, 50 mg/l rifamycin

Tiến hành chọn lọc c ác dòng khuẩn lạc Agrobacterium tumefaciens chứa