Môi trƣờng nuôi cấy

3. Nội dung nghiên cƣ́u

2.1.3. Môi trƣờng nuôi cấy

- Môi trường nuôi cấy vi khuẩn LB:

Bảng 2.3. Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn

Tên môi trƣờng Thành phần môi trƣờng

LB đặc Yeast extract 5g/l; Trypton 10g/l; NaCl 10g/l;

agar 16g/l, pH = 7,0

LB lỏng Yeast extract 5g/l; Trypton 10g/l; NaCl 10g/l; pH = 7,0

- Môi trường nuôi và chọn lọc cây xoan ta chuyển gen:

Bảng 2.4. Môi trƣờng nuôi và chọn lọc cây Xoan ta chuyển gen

Môi trƣờng Ký hiệu Thành phần môi trƣờng

Gieo hạt tạo cây mầm

SRM

MS + 30 g/l sucrose + 8,0 g/l agar, pH = 5,8.

Tiền nuôi cấy PreM MS + 1,0 mg/l BAP + 0,2 mg/l NAA + 30g/l

sucrose + 8,0 g/l agar, pH = 5,8.

Đồng nuôi cấy CCM MS + 0,5 mg/l BAP + 0,1mg/l Kinetin + 200 µM

AS+ 30g/l sucrose + 8,0 g/l agar, pH = 5,8.

Tái sinh chồi

chọn lọc SM

MS + 0,5 mg/l BAP + 0,1mg/l Kinetin + 30g/l sucrose + 8,0 g/l agar + 150 mg/l kanamycin + 300mg/l cefotaxime, pH = 5,8.

Chọn lọc cây chuyển gen

(Ra rễ)

PSM MS + 0,3mg/l IBA + 20 g/l sucrose + 8,0 g/l agar +

22

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Bảng 2.5. Thành phần các loại môi trƣờng gây nhiễm mặn nhân tạo

Công thƣ́c Ký hiệu Thành phần môi trƣờng

Công thƣ́c 1 CT1 MS + 0,5 mg/l BAP + 0,1mg/l Kinetin + 30g/l

sucrose + 100 mM NaCl + 7.5 g/l agar, pH = 5,8.

Công thƣ́c 2 CT2 MS + 0,5 mg/l BAP + 0,1mg/l Kinetin + 30g/l

sucrose + 150 mM NaCl + 7.5 g/l agar, pH = 5,8.

Công thƣ́c 3 CT3 MS + 0,5 mg/l BAP + 0,1mg/l Kinetin + 30g/l

sucrose + 200 mM NaCl + 7.5 g/l agar, pH = 5,8.

2.1.4. Thiết bị - Máy móc

- Các thiết bị dùng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật và chuyển gen: box cấy vô trùng, bình nuôi cây, dàn nuôi cấy, nồi khử trùng, máy nuôi lắc, máy đo pH, máy đo OD.

- Các thiết bị dùng trong sinh học phân tử: pipetman, máy soi gel (Bio-Rad), máy chụp ảnh điện di (Amersham Pharmacia Biotech), máy li tâm (Ependorf), bộ điện di (Bio-Rad), máy hút chân không (Savant), máy PCR System 9700 (Appied Biosystem, Mỹ), bể ổn nhiệt, máy biến nạp bằng xung điện (Gel Pluser), máy voltex,... cùng các trang thiết bị khác của Phòng Công nghệ tế bào thực vật và Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học.

2.2. Phƣơng pháp nghiên cƣ́u

2.2.1. Thiết kế cấu trúc vector chuyển gen pBI121 mang gen codA

2.2.1.1. Nhân gen codA bằng PCR

PCR (Polymerase Chain Reaction) là phƣơng pháp nhân nhanh một đoạn DNA mong muốn trong ống nghiệm dƣới sự xúc tác của enzyme DNA polymerase.

Kỹ thuật tổng hợp nhân tạo DNA cũng tuân theo các nguyên tắc nhƣ tái bản DN A

trong tế bào sinh vật. Thành phần phản ứng PCR gồm có: DNA khuôn cần nhân bản,

mồi xuôi và mồi ngƣợc, Taq DNA polymerase, dNTPs (ATP, TTP, CTP và GTP),

23

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Bảng 2.6. Thành phần phản ứng PCR nhân gen codA

TT Thành phần Thể tích (µl)

1 Nƣớc khử ion 14,5

2 Đệm PCR 10X 2,5

3 MgCl2 (25mM) 2,5

4 dNTPs (10 mM) 2

5 Mồi F: TP-XbaI 1

6 Mồi R: CMYC-sacI 1

7 Plasmid khuôn 1

8 Taq polymerase (5u/µl) 0,5

Tổng thể tích 25 µl

Phản ứng PCR nhân gen codA bằng cặp mồi F: TP-XbaI và R: Cmyc-SacI

thực hiện theo chu kỳ nhiệt độ nhƣ sau: 940C/3 phút; 30 chu kì [940C/1 phút,

410C/50 giây, 720C/1 phút 30 giây]; 720C/10 phút và bảo quản 40C/∞.

2.2.1.2. Phương pháp điện di trên gel agarose

Các bƣớc tiến hành:

- Bƣớc 1: Chuẩn bị gel: cho 1g agarose vào 100 ml dung dịch đệm TAE 1X.

Đun sôi đến khi agarose tan hoàn toàn. Để cho agarose nguội xuống khoảng 55-60oC,

đổ dung dịch vào khuôn gel điện di đã cài sẵn răng lƣợc. Sau 15 – 20 phút, khi gel agarose đã đông cứng, gỡ lƣợc ra khỏi bản gel vào đặt bản gel vào bể điện di. Đổ đệm TAE 1X vào bể sao cho ngập bản gel 3 – 5mm.

- Bƣớc 2: Tra mẫu vào giếng theo tỷ lệ Vmẫu : Vdye = 5:1.

- Bƣớc 3: Điện di ở hiệu điện thế từ 110V. Quan sát sự di chuyển bằng màu của bromophenol blue để kiểm soát quá trình điện di.

- Bƣớc 4: Nhuộm DNA bằng dung dịch nhuộm ethidium bromide (EtBr). Bản gel đƣợc lấy ra khỏi khay điện di và đƣa vào dung dịch EtBr trong thời gian khoảng 15-20 phút.

24

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

2.2.1.3. Tinh sạch sản phẩm PCR

Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch theo bộ Kít Gen Jet TM gel Extraction của hãng Fermentas (Mỹ). Quy trình nhƣ sau:

- Bƣớc 1: Bổ sung dung dịch Gel Binding Buffer (GB) vào ống theo tỉ lệ:

Vmẫu : VGB = 1:1.

- Bƣớc 2: Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột liên kết DNA (Binding column), ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch.

- Bƣớc 3: Bổ sung 700µl Washing Buffer lên cột liên kết DNA, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch. Lặp lại bƣớc này thêm 1 lần.

- Bƣớc 4: Làm khô cột bằng ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 1 phút, chuyển cột sang ống Eppendorf 1,5ml mới.

- Bƣớc 5: Thêm 50µl Elution Buffer vào chính giữa cột, ủ ít nhất 1 phút ở nhiệt độ phòng.

- Bƣớc 6: Ly tâm ở 13000 vòng/phút trong 1 phút để thu dịch chứa DNA. - Bƣớc 7: Sản phẩm tich sạch đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1% .

- Bƣớc 8: Bảo quản DNA tinh sạch ở -200C hoặc sử dụng luôn.

2.2.1.4. Phương pháp thiết kế cấu trúc vector chuyển gen và tạo chủng vi khuẩn mang vector

* Cắt sản phẩm PCR gen codA bằng enzyme giới hạn

Cặp mồi dùng để nhân gen codA có vị trí nhận biết của cặp enzyme giới hạn

XbaI và SacI và ở đầu 5’ của mồi. Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch đƣợc xử lý bằng

cặp enzyme XbaI và SacI sẽ thu đƣợc gen codA có 2 đầu dính (đầu sole). Thành

phần phản ứng cắt enzyme giới hạn nhƣ sau:

Bảng 2.7. Thành phần phản ứng xƣ̉ lý enzyme giới hạn

TT Thành phần Thể tích (µl)

1 Nƣớc khử ion 7,5

2 Đệm PCR 10X 1,5

3 Enzyme SacI 0,5

4 Enzyme XbaI 0,5

5 Sản phẩm PCR gen codA tinh sạch 5

25

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Phản ứng cắt đƣợc ủ ở 370C, 4 giờ. Kết quả cắt đƣợc kiểm tra bằng điện di

trên gel agarose 1%. Băng DNA có kích thƣớc tƣơng ứng với kích thƣớc của gen

codA đƣợc thu nhận bằng kỹ thuật thôi gel. Quy trình thôi gel nhƣ sau:

- Bƣớc 1: Cắt mảnh gel có chứa đoạn gen codA cho vào ống eppendorf 2ml.

- Bƣớc 2: Bổ sung dung dịch Gel Binding Buffer (GB) vào ống theo tỉ lệ: Vmẫu : VGB = 1:1.

- Bƣớc 3: Ủ ở 60oC ít nhất 10 phút, cứ 2-3 phút đảo một lần để gel tan hoàn toàn.

- Bƣớc 4: Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột liên kết DNA (Binding column), ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch.

- Bƣớc 5: Bổ sung 700µl Washing Buffer lên cột liên kết DNA, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch. Lặp lại bƣớc này thêm 1 lần.

- Bƣớc 6: Làm khô cột bằng ly tâm ở 13000 v/p trong 1 phút, chuyển cột sang ống Eppendorf 1,5ml mới.

- Bƣớc 7: Thêm 50µl Elution Buffer vào chính giữa cột, ủ ít nhất 1 phút ở nhiệt độ phòng.

- Bƣớc 8: Ly tâm ở 13000 v/p trong 1 phút để thu dịch chứa DNA. - Bƣớc 9: Sản phẩm thôi gel đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1% .

- Bƣớc 10. Bảo quản DNA sạch ở -20oC hoặc sử dụng luôn.

* Phản ứng ghép nối tạo vector tái tổ hợp

Vector chuyển gen pBI121 cũng đƣợc xử lý bằng cặp enzyme giới hạn SacI

và XbaI để loại bỏ gen gus và tạo ra 2 đầu dính tƣơng ứng với gen codA đã cắt ở

trên. Vector pBI121 sau khi xử lý cũng đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose và thu nhận lại bằng kỹ thuật thôi gel.

Gen codA đƣợc ghép nối vào vector pBI121 tạo thành vector tái tổ hợp nhờ

26

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Bảng 2.8. Thành phần phản ứng ghép nối gen codA với vector pBI121 TT Thành phần phản ứng Thể tích (µl)

1 Nƣớc khử ion 6

2 Vector pBI121 mở vòng 5

3 Gen codA 5

4 T4 DNA ligase đệm 10X 2

5 T4 DNA ligase 2

Tổng thể tích (µl) 20

Tiến hành:

- Bƣớc1: Trộn các thành phần theo thứ tự bảng 2.8 vào ống eppendorf 0,2 ml. - Bƣớc 2:Đảo nhẹ hỗn hợp phản ứng.

- Bƣớc 3: Quay nhanh để thu hết dịch trên thành ống xuống đáy.

- Bƣớc 4: Ủ hỗn hợp dung dịch phản ứng ở 220C trong 2 giờ.

2.2.1.5. Biến nạp vector tái tổ hợp vào E. coli DH5α

Tế bào vi khuẩn E. coli sau khi đƣợc xử lý với CaCl2 sẽ trở nên khả biến,

tức có khả năng thu nhận DNA plasmid. Tế bào vi khuẩn đƣợc đƣa từ tủ - 80oC

ra sẽ đƣợc đặt trên đá, sau đó, sốc nhiệt bằng cách cho vào bể ổn nhiệt ở 42oC.

Lúc này, trên bề mặt thành tế bào sẽ xuất hiện các lỗ nhỏ đủ để cho DNA plasmid đi vào. Sau khi plasmid đi vào trong tế bào, thành tế bào sẽ trở về trạng thái nguyên vẹn ban đầu.

Các bƣớc tiến hành:

- Bƣớc 1: Lấy tế bào khả biến từ tủ -80oC, sau đó làm tan tế bào khả biến bằng

cách đặt trong đá 20-25 phút.

- Bƣớc 2: Bổ sung 5µl vector tái tổ hợp vào ống đựng tế bào khả biến và đảo nhẹ. Đặt hỗn hợp trong đá 15 phút.

- Bƣớc 3: Sốc nhiệt ở 42oC trong 1 phút, sau đó đặt ngay vào đá trong 3 phút.

- Bƣớc 4: Bổ sung 500µl môi trƣờng LB lỏng vào hỗn hợp, nuôi lắc 220 v/p ở

27

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

2.2.1.6. Sàng lọc dòng vi khuẩn E. coli DH5α mang vector tái tổ hợp

Sử dụng que cấy trải 100µl dịch khuẩn (mục 2.2.1.5) lên đĩa môi trƣờng LB

đặc có chứa kháng sinh kanamycin hàm lƣợng 50 mg/l. Nuôi qua đêm ở 37oC. Các

khuẩn lạc trắng mọc trên môi trƣờng chọn lọc có thể là những dòng tế bào mang vector tái tổ hợp. Chọn khuẩn lạc màu trắng to, tròn nuôi trong môi trƣờng LB lỏng có bổ sung kháng sinh để tách plasmid kiểm tra.

2.2.1.7. Tách chiết plasmid từ vi khuẩn E. coli

Quy trình tách chiết plasmid theo Sambrook và Rusell nhƣ sau:

- Bƣớc 1: Dùng tăm vô trùng lấy 2 khuẩn lạc riêng rẽ cho vào 2 ống chứa 4ml LB lỏng, 4µl kanamycin 50 mg/l. Mỗi ống chứa một khuẩn lạc đem nuôi thành

1 dòng. Nuôi trong máy lắc, tốc độ 220 v/p ở 37oC, qua đêm.

- Bƣớc 2: Ly tâm 2ml dịch vi khuẩn nuôi cấy qua đêm 10000 v/p trong 2 phút, loại bỏ dịch trong, thu lấy cặn tế bào.

- Bƣớc 3: Hòa tan cặn trong 100 l dung dịch sol I bằng voltex, ủ ở nhiệt độ

phòng trong 10 phút.

- Bƣớc 4: Thêm 200 l dung dịch sol II, đảo nhẹ, ủ trên đá 3 phút.

- Bƣớc 5: Thêm 150 l dung dịch sol III, trộn đều, ủ trên đá 5 phút.

- Bƣớc 6: Ly tâm hỗn hợp ở 4oC, 13000 v/p trong 15 phút, hút phần dung

dịch trong phía trên chuyển sang ống 1,5 ml mới.

- Bƣớc 7: Bổ sung dung dịch Chloroform : Isoamyl theo tỷ lệ 24:1, đảo nhẹ. - Bƣớc 8: Ly tâm hỗn hợp ở nhiệt độ thƣờng, 13000 v/p trong 5 phút, hút dung dịch trong ở pha trên chuyển sang ống 1,5 ml mới.

- Bƣớc 9: Bổ sung 0,6 đến 1 thể tích isopropanol 100%, ủ 20 phút trong đá.

- Bƣớc 10: Ly tâm ở 4oC, 13000 v/p trong 20 phút, loại bỏ dịch trong, thu lấy

tủa DNA.

- Bƣớc 11: Rửa tủa bằng cách bổ sung 0,5ml cồn 70% lạnh rồi ly tâm 13000

v/p ở 4oC trong 5 phút. Loại bỏ dịch, thu cặn.

- Bƣớc 12: Đông khô tủa và hòa tan tủa trong 20-30l nƣớc hoặc TE có bổ

28

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

- Bƣớc 13: Điện di kiểm tra sản phẩm tách plasmid trên gel agarose 0,8%.

2.2.1.8. Kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng PCR và sử dụng enzyme giới hạn

Để chọn lọc đƣợc các plasmid mang đúng đoạn gen quan tâm, chúng tôi tiến

hành phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu F: TP-XbaI và R: Cmyc-SacI và cắt kiểm

tra bằng cặp enzyme giới hạn SacI và XbaI.

* Kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng PCR

Bảng 2.9. Thành phần phản ứng PCR kiểm tra plasmid

TT Thành phần Thể tích (µl)

1 Nƣớc khử ion 14,5

2 MgCl2 (25mM) 2,5

3 Đệm PCR 10X 2,5

4 dNTPs (10 mM) 2

5 Mồi F: TP-XbaI 1

6 Mồi R: Cmyc -SacI 1

7 Plasmid tái tổ hợp 1

8 Polymerase 0,5

Tổng thể tích 25 µl

Phản ứng PCR nhân gen codA bằng cặp mồi F: TP-XbaI và R: Cmyc-SacI

thực hiện theo chu kỳ nhiệt độ nhƣ sau: 940C/3 phút; 35 chu kì [940C/1 phút,

550C/50 giây, 720C/1 phút 30 giây]; 720C/10 phút và bảo quản 40C/∞.

Điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 1%, nhuộm, soi gel và chụp ảnh.

* Cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn

Vector tái tổ hợp pBI121codA có vị trí nhận biết của cặp enzyme giới hạn

XbaI và SacI ngay sát vị trí của gen codA nên sau khi xử lý vector tái tổ hợp bằng

cặp enzyme giới hạn này, vector sẽ bị cắt thành 2 băng DNA: một băng là vector

29

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

Bảng 2.10.Thành phần phản ứng cắt plasmid tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn

TT Thành phần Thể tích (µl)

1 Nƣớc khử ion 3

2 Plasmid tái tổ hợp 3

3 Đệm PCR 10X 1

4 Enzyme XbaI 1

5 Enzyme SacI 1

Tổng thể tích 10

Phản ứng đƣợc ủ ở 37oC trong 3 giờ. Điện di kiểm tra sản phẩm cắt trên gel

agarose 1%, nhuộm, soi gel và chụp ảnh.

2.2.2. Tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang vector chuyển gen

2.2.2.1. Biến nạp vector chuyển gen vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens bằng phương pháp xung điện

Kỹ thuật xung điện (electroporation) đƣợc sử dụng để đƣa các phân tử phân cực vào trong tế bào chủ qua màng tế bào. Trong phƣơng pháp này, một xung điện cao thế trong khoảnh khắc (vài phần nghìn giây) có khả năng làm rối loạn cấu trúc màng phospholipid kép, tạo ra các lỗ thủng tạm thời cho phép các phân tử DNA ngoại lai từ môi trƣờng bên ngoài xâm nhập vào bên trong tế bào.

Quy trình biến nạp bằng phƣơng pháp xung điện nhƣ sau:

- Bƣớc 1: Lấy tế bào khả biến từ tủ - 800C (ống chứa 50 µl tế bào) và rã đông

trong đá 10-15 phút.

- Bƣớc 2: Bổ sung 5 µl vector tái tổ hợp vào và đảo nhẹ. - Bƣớc 3: Chuyển hỗn hợp vào cuvet.

- Bƣớc 4: Xung điện ở điều kiện 2,5kV, 25µF, 200Ω. Đặt ngay vào đá, sau 5 phút bổ sung 400µl LB lỏng.

- Bƣớc 5: Chuyển hỗn hợp từ cuvet sang ống eppendorf 1,5 ml. Ủ ở 28oC, lắc

200 v/p, trong 1 giờ.

- Bƣớc 6: Cấy trải 100 µl dung dịch vi khuẩn trên môi trƣờng LB đặc có bổ