3. Nội dung nghiên cƣ́u
2.2.2. Tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang vector chuyển gen
2.2.2.1. Biến nạp vector chuyển gen vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens bằng phương pháp xung điện
Kỹ thuật xung điện (electroporation) đƣợc sử dụng để đƣa các phân tử phân cực vào trong tế bào chủ qua màng tế bào. Trong phƣơng pháp này, một xung điện cao thế trong khoảnh khắc (vài phần nghìn giây) có khả năng làm rối loạn cấu trúc màng phospholipid kép, tạo ra các lỗ thủng tạm thời cho phép các phân tử DNA ngoại lai từ môi trƣờng bên ngoài xâm nhập vào bên trong tế bào.
Quy trình biến nạp bằng phƣơng pháp xung điện nhƣ sau:
- Bƣớc 1: Lấy tế bào khả biến từ tủ - 800C (ống chứa 50 µl tế bào) và rã đông
trong đá 10-15 phút.
- Bƣớc 2: Bổ sung 5 µl vector tái tổ hợp vào và đảo nhẹ. - Bƣớc 3: Chuyển hỗn hợp vào cuvet.
- Bƣớc 4: Xung điện ở điều kiện 2,5kV, 25µF, 200Ω. Đặt ngay vào đá, sau 5 phút bổ sung 400µl LB lỏng.
- Bƣớc 5: Chuyển hỗn hợp từ cuvet sang ống eppendorf 1,5 ml. Ủ ở 28oC, lắc
200 v/p, trong 1 giờ.
- Bƣớc 6: Cấy trải 100 µl dung dịch vi khuẩn trên môi trƣờng LB đặc có bổ sung 50 mg/l kanamycin và 50 mg/l rifamycine.
30
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.2.2.2. Sàng lọc dòng Agrobacterium tumefaciens mang vector tái tổ hợp bằng nuôi cấy trên môi trường có kháng sinh, tách chiết plasmid và PCR
Các khuẩn lạc mọc trên môi trƣờng LB đặc chọn lọc (50 mg/l kanamycin và
50 mg/l rifamycine) có thể là những dòng tế bào mang vector tái tổ hợp. Chọn ngẫu
nhiên 8 dòng khuẩn lạc to, tròn đều, riêng rẽ nuôi trong môi trƣờng LB lỏng có bổ sung kháng sinh (50 mg/l kanamycin và 50 mg/l rifamycine) để thu tế bào tách chiết plasmid kiểm tra.
* Tách chiết plasmid
Quy trình tách theo Sambrook và Rusell [37] nhƣ đã trình bày ở mục (2.4.1.6.)
* Tiến hành phản ứng PCR
Để chọn đƣợc các dòng Agrobacterium tumefaciens mang gen vector
pBI121-codA, chúng tôi tiến hành kiểm tra bằng PCR tƣơng tƣ̣ nhƣ mô tả ở mục
2.4.1.8 với khuôn là DNA plasmid vƣ̀a tách đƣợc.