Tách dòng và giải trình tự gen mã hóa độc tố tiêu chảy và độc tó gây nôn của chủng Bacillus cereus phân lập tại Việt Nam (LV thạc sĩ)Tách dòng và giải trình tự gen mã hóa độc tố tiêu chảy và độc tó gây nôn của chủng Bacillus cereus phân lập tại Việt Nam (LV thạc sĩ)Tách dòng và giải trình tự gen mã hóa độc tố tiêu chảy và độc tó gây nôn của chủng Bacillus cereus phân lập tại Việt Nam (LV thạc sĩ)Tách dòng và giải trình tự gen mã hóa độc tố tiêu chảy và độc tó gây nôn của chủng Bacillus cereus phân lập tại Việt Nam (LV thạc sĩ)Tách dòng và giải trình tự gen mã hóa độc tố tiêu chảy và độc tó gây nôn của chủng Bacillus cereus phân lập tại Việt Nam (LV thạc sĩ)Tách dòng và giải trình tự gen mã hóa độc tố tiêu chảy và độc tó gây nôn của chủng Bacillus cereus phân lập tại Việt Nam (LV thạc sĩ)Tách dòng và giải trình tự gen mã hóa độc tố tiêu chảy và độc tó gây nôn của chủng Bacillus cereus phân lập tại Việt Nam (LV thạc sĩ)Tách dòng và giải trình tự gen mã hóa độc tố tiêu chảy và độc tó gây nôn của chủng Bacillus cereus phân lập tại Việt Nam (LV thạc sĩ)Tách dòng và giải trình tự gen mã hóa độc tố tiêu chảy và độc tó gây nôn của chủng Bacillus cereus phân lập tại Việt Nam (LV thạc sĩ)Tách dòng và giải trình tự gen mã hóa độc tố tiêu chảy và độc tó gây nôn của chủng Bacillus cereus phân lập tại Việt Nam (LV thạc sĩ)
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ĐINH THỊ NGA TÁCH DÕNG VÀ GIẢI TRÌNH TỰ GEN MÃ HÓA ĐỘC TỐ TIÊU CHẢY VÀ ĐỘC TỐ NÔN CỦA CHỦNG BACILLUS CEREUS PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2015 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ĐINH THỊ NGA TÁCH DÕNG VÀ GIẢI TRÌNH TỰ GEN MÃ HÓA ĐỘC TỐ TIÊU CHẢY VÀ ĐỘC TỐ NÔN CỦA CHỦNG BACILLUS CEREUS PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM Chuyên ngành: Vi sinh vật Mã số: 60420103 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: T.S Phùng Tôn Quyền Hà Nội - 2015 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn thạc sĩ nhận nhiều giúp đỡ quý báu, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới giúp đỡ Lời đầu tiên, xin bày tỏ biết ơn sâu sắc tới TS Phùng Tôn Quyền người thầy hướng cho ý tưởng khoa học, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho hoàn thành luận án Tôi xin cảm ơn tất thầy cô giáo Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam chia sẻ, động viên, giúp vượt qua khó khăn để hoàn thành tốt công việc nghiên cứu Cuối cùng, xin tỏ lòng biết ơn đến gia đình bè bạn, người bên tôi, động viên, góp ý tạo điều kiện tốt cho suốt thời gian học tập nghiên cứu Hà Nội, ngày tháng 12 năm 2015 Học viên Đinh Thị Nga Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Lời cam đoan Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu số kết cộng tác với đồng khác Các số liệu kết trình bày luận văn trung thực Hà Nội, ngày tháng 12 năm 2015 Tác giả Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn MỤC LỤC Lời cảm ơn Lời cam đoan Danh mục hình Danh mục bảng MỞ ĐẦU TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái niệm ngộ độc thực phẩm nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm 1.1.1 Khái niệm ngộ độc thực phẩm (Food poisoning) 1.1.2 Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm 1.2 Tổng quan Bacillus cereus 1.2.1 Lịch sử nghiên cứu Bacillus cereus 1.2.2 Đặc điểm hình thái 1.2.3 Đặc điểm nuôi cấy 1.2.4 Đặc điểm sinh trưởng 1.2.5 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá 10 1.2.6 Đặc điểm huyết học 11 1.2.7 Đặc điểm phân loại 12 1.3 Các nhân tố gây độc Bacillus cereus 12 1.3.1 Các loại độc tố ruột (enterotoxin) 12 1.3.2 Độc tố gây nôn (cereulide) 16 1.3.3 Những bệnh gây Bacillus cereus, không liên quan tới ngộ độc thực phẩm 18 1.4 Ngộ độc thực phẩm Bacillus cereus 19 1.4.1 Nguồn gốc lây nhiễm B cereus 19 1.4.2 Cơ chế gây ngộ độc thực phẩm Bacillus cereus 20 1.4.3 Liều lượng gây ngộ độc 21 1.4.4 Triệu chứng 22 1.5 Biện pháp phòng ngừa lây nhiễm phát triển Bacillus cereus thực phẩm 23 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 1.5.1 Phương pháp xử lý nhiệt độ cao 23 1.5.2 Phương pháp xử lý nhiệt độ thấp 24 1.5.3 Sử dụng chất bảo quản 25 1.5.4 Thực điều kiện vệ sinh tốt GHP (good hygienic practices) thực hành sản xuất tốt GMP (good manufacturing practices) [45] 25 1.6 Một số phương pháp nghiên cứu để nhận biết Bacillus cereus 26 1.6.1 Phương pháp dựa đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa 26 1.6.2 Phương pháp dựa đặc điểm huyết học 28 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 31 2.1 Vật liệu 31 2.1.1 Sinh phẩm 31 2.1.2 Hóa chất thiết bị 31 2.2 Phương pháp nghiên cứu 34 2.2.1 Phương pháp phân lập 34 2.2.2 Phương pháp tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn 34 2.2.3 Phương pháp tách DNA tổng số 34 2.2.4 Phương pháp tinh plasmid E coli 35 2.2.5 Phương pháp PCR khuếch đại gen 36 2.2.6.Phương pháp điện di gel agarose 36 2.2.7 Phương pháp tách dòng gen nhe, hblA, bcet 36 2.2.8 Phương pháp xác định trình tự nucleotit đoạn gen tách dòng 37 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 3.1 Phân lâ ̣p Bacillus cereus môi trường MYP 39 3.2 Phát gen mã hóa độc tố của Bacillus cereus bằ ng phản ứng PCR 39 3.3 Tách dòng và đọc trình tự gen bceT, nhe hblA 41 3.3.1 Tách dòng gen bceT, nhe và hblA 41 3.3.2 Đo ̣c trin ̀ h tự gen má hóa các đô ̣c tố 44 KẾT LUẬN 47 KIẾN NGHỊ 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ Bp Base pair Bc Bacillus cereus CFU Colony Forming Unit dH2O Deion water DNA Deoxyribonucleotide acid dNTP deoxyribo Nucleotide 5’- Triphosphate ĐC Đối chứng E coli Escherichia coli EDTA Ethylene diamine tetra- acetic acid 10 EtBr Ethidium Bromide 11 kDa Kilo Dalton 12 OD Optical density - mật độ quang học 13 PCR Polymerase Chain Reaction - phản ứng chuỗi 14 SDS Sodium dodecyl sulphate 15 Sol Solution 16 TE Tris EDTA 17 X-gal 5- bromo- Cloro- indolyl β- d galactoside Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Danh mục hình Hình 1.1: Tế bào (A) bào tử (B) B cereus Hình 1.2: Khuẩn lạc B cereus môi trường thạch huyết Hình 1.3 : Kháng nguyên tiêm mao B cereus 11 Hình 1.4 Cấu trúc hoá học cereulide [24] 17 Hình 3.1 Hình thái khuẩn lạc Bcereus môi trường MYP sau 12 giờ nuôi 39 Hình 3.2 Điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen độc tố của gen bceT (0,7 bp), nhe (1.4 kb) hblA (319 bp) 40 Hình 3.3 Biến nạp vector tái tổ hợp vào vi Khuẩn E.coli DH5α 41 Hình 3.4 Điê ̣n di sản phẩ m cắ t DNA plasmid các dòng khuẩ n la ̣c trắ ng gel 1% agarose 42 Hình 3.5 Điê ̣n di sản phẩ m PCR của các dòng khuẩ n la ̣c trắ ng gel 1% agarose 43 Hình 3.6 So sánh trình tự amino acid protrein BCET vói trình tự BAA041341 ngân hàng gen quốc tế 44 Hình 3.7 So sánh trình tự amino acid protrein NHE vói trình tự DQ153257.1 ngân hàng gen quốc tế 45 Hình 3.8 So sánh trình tự amino acid protrein HBL vói trình tự EEK50059.1 ngân hàng gen quốc tế 46 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Danh mục bảng Bảng 1.1 Một số đặc điểm phân biệt loài nhóm chi Bacillus 10 Bảng 1.2 Đặc điểm số độc tố ruột Bacillus cereus 13 Bảng 2.2: Các thiết bị sử dụng trình nghiên cứu 32 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Bacillus cereus thuô ̣c nhóm chi Bacillus vi khuẩn hình que , Gram dương và sinh bảo tử B cereus thường xuấ t hiê ̣n đấ t , sữa nguyên liê ̣u, các sản phẩ m từ sữa và các loa ̣i ngũ cố c B cereus có khả liên quan đế n các bê ̣nh về đường ruô ̣t gây nôn và tiêu chảy nhờ khả sản sinh loại enterotoxin đó có tổ hơ ̣p hemolysin BL (HBL), nonhemolytic enterotoxin (NHE) enterotoxic protein là enterotoxin T (BCET) cytotoxin K (Beecher, Wong, 1994) Ngoài , B cereus có khả sản sinh loại độc tố chịu nhiệt n on-riposome peptide synthetase (NRPS-cereulide) (Agata et al., 1995) Ở nước ta theo báo cáo từ y tế, có khoảng 38 trung tâm y tế có khả kiểm nghiệm loài vi khuẩn này, khoảng 60% tình thành có lực kiểm nghiệm Tuy nhiên phương pháp xét nghiệm dựa phương pháp đếm tổng số khuẩn lạc môi trường thạch dinh dưỡng kết hợp với xét nghiệm hóa sinh khác Phương pháp có nhược điểm thời gian lâu, nhiều ngày vài tuần độ xác không cao.Trong năm gần đây, phương pháp xét nghiệm vi sinh vật dựa nguyên tắc di truyền phân tử miễn dịch học thiết lập như: lai phân tử, PCR (Polymerase Chain Reaction), Elisa cho kết khả quan với độ xác cao, thời gian rút ngắn xuồng vài giờ, không đòi hỏi nhiều máy móc thiết bị khả động cao Những phương pháp mở cho ngành vi hóa sinh học nói riêng ngành công nghệ thực phẩm đại xuất phát từ tính cấp thiết tiến hành đề tài: “Tách dòng giải trình tự gen mã hóa độc tố tiêu chảy độc tó gây nôn chủng Bacillus cereus phân lập Việt Nam” Với mục đích tạo nguồn gen cho sản xuất nguyên liệu chế tạo kit phát độc tố vi khuẩn B cereus sau 3.3 Tách dòng và đọc trình tự gen bceT, nhe hblA 3.3.1 Tách dòng gen bceT, nhe và hblA */ Gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pGEM: Ba chủng sử dụng để tách dòng HN1.1, HN7.9 HN19.4 Sản phẩ m PCR gen bceT, nhe hblA chúng đươ ̣c gắ n trực tiế p vào vector pGEM bằ ng enzyme T4 - ligaza 4oC ta ̣o vector tái tổ hợp */ Biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn E coli DH5α: Tiến hành biến nạp hai vector tái tổ hợp vào tế bào E coli chủng DH5α theo phương pháp số c nhiê ̣t và cấ y trải môi trường LBA có bổ sung Ampicillin và X -gal ở 37oC Sau 14 - 16 giờ thấ y xuấ t hiê ̣n các khuẩ n lạc xanh trắng xen kẽ Những khuẩ n la ̣c màu trắ ng là những khuẩ n lạc có khả mang gen bceT, nhe hblA (Hình 3.3) Hình 3.3 Biến nạp vector tái tổ hợp vào vi Khuẩn E.coli DH5α Cấ y các khuẩ n la ̣c trắ ng vào môi trường LB lỏng để tách DNA plasmid Tiến hành tách DNA plasmid kiểm tra plasmid tái tổ hợp điện di gel agarose 1% Để biế t đươ ̣c plasmid tái tổ hơ ̣p có mang gen mong muố n hay không, lựa cho ̣n mô ̣t số dòng plasmid kiể m tra sự có mă ̣t của gen bceT, nhe hblA bằ ng phương pháp cắ t bằ ng enzyme giới ̣n EcoRI và phương pháp PCR */ Kiểm tra có mặt gen bceT, nhe hblA dòng plasmid tái tổ hợp: 41 Do vector tách dòng pGEM có chứa vị trí cắt enzyme EcoRI tiếp giáp với vùng đa cắt nối (vùng cho phép cài gắn đoạn gen cần tách dòng) nên sử dụng enzyme EcoRI để kiểm tra đảm bảo trình tách dòng thực thành công với vector tái tổ hợp Sản phẩm cắt điện di gel agarose 1% kb kb kb 3.0 3.0 1.4 1.5 0.7 0.7 0.5 A kb B kb B 3.0 0.5 0.3 0.3 C Hình 3.4 Điêṇ di sản phẩ m cắ t DNA plasmid các dòng khuẩ n la ̣c trắ ng gel 1% agarose A: Các dòng pGEM-Teasy-bceT, B: Các dòng pGEM-Teasy-nhe, C: Các dòng pGEM-Teasy-hblA DNA plasmid của các dòng khuẩ n la ̣c trắ ng sau cắ t bằ ng enzyme giới ̣n EcoRI ta ̣o băng, băng vector tách dòng pGEM có kić h thước khoảng 3,9 kb, băng có kić h thước gen độc tố bceT (0,7 bp), nhe (1.4 kb) hblA (319 bp) tương ứng với sản phẩ m PCR của gen Điều chứng tỏ đoạn gen gắn vào vector tách dòng pGEM thành công 42 Để kết luận xác plasmid tái tổ hợp có mang đoạn gen bceT, nhe hblA hay không tiến hành chạy PCR với khuôn DNA plasmid tái tổ hợp sử dụng cặp mồi đặc hiệu gen bceT, nhe hblA */ Kiểm tra có mặt gen bceT, nhe hblA vector tái tổ hợp phản ứng PCR: Phản ứng PCR kiểm tra thực sử dụng DNA plasmid tái tổ hợp làm khuôn cặp mồi đặc hiệu Sản phẩm PCR kiểm tra điện di gel agarose 1% Kết thể qua hình 3.5 kb 10 11 kb 1.7˜ 1.5 0.9˜ 0.6˜ 0.7 0.5 Hình 3.5 Điêṇ di sản phẩ m PCR của các dòng khuẩ n lạc trắng gel 1% agarose 1-3: Các dòng pGEM-Teasy-bceT 5-8: Các dòng pGEM-Teasy-hblA 9,10: Các dòng pGEM-Teasy-nhe 4,11: Thang DNA chuẩ n (Fermentas) Kết thu có băng với kích thước gen độc tố bceT (0,7 bp), nhe (1.4 kb) hblA (319 bp) giống với sản phẩm PCR với DNA tách từ chủng HN1.1, HN7.9 HN19.4 Từ kết thu trên, bước đầu kết luận tách dòng thành công gen bceT, nhe hblA chủng HN1.1, HN7.9 HN19.4 vector pGEM Tuy nhiên, để kiểm tra xác gen tách dòng gen bceT, nhe hblA hay không, tiến hành đọc trình tự đoạn gen so sánh với trình tự gen đăng ký Ngân hàng Gen Quốc tế phần mềm chuyên dụng 43 3.3.2 Đọc trình tự gen má hóa các độc tố 3.3.3.1 Gen mã hóa độc tố BCET DNA plasmid của các dòng khuẩ n la ̣c trắ ng đươ ̣c tinh sa ̣ch và đo ̣c triǹ h tự Trình tự nucleotid gen bcet chủng HN1.1 có 10 vị trí thay đổi HN7.9 có 13 vị trí thay đổ i so với triǹ h tự đã công bố ngân hàng gen (Mã số D17312) với độ tương đồng 98% Sau dich ̣ mã lý thuyế t , trình tự protein đươ ̣c so sánh với các trình tự ngân hàng gen quố c tế Kế t quả cho thấ y trin ̀ h tự protein có 221 acid amin đó , HN1.1 có vị trí thay đổi (163: Q thành R, 175: A thành T, 222: F thành I) (98%) HN7.9 có vị trí thay đổ i (52: A thành T, 175: A thành T, 222: F thành I) (98%) so với triǹ h tự có mã số BAA04134.1 (hinh 3.6) 10 20 30 40 50 60 | | | | | | | | | | | | BAA04134.1 RIGRSLGIHLILATQKPSGVVDDQIWSNSKFKLALKVQNTSDSNEILKTPDAAEITLPGR HN1.1 RIGRSLGIHLILATQKPSGVVDDQIWSNSKFKLALKVQNTSDSNEILKTPDAAEITLPGR HN7.9 RIGRSLGIHLILATQKPSGVVDDQIWSNSKFKLALKVQNTSDSNEILKTPDTAEITLPGR 70 80 90 100 110 120 | | | | | | | | | | | | BAA04134.1 AYLQVGNNEIYELFQSAWSGADYVENKEDKEHLDATIYAINDLGQYEILSEDLSGLGSSK HN1.1 AYLQVGNNEIYELFQSAWSGADYVENKEDKEHLDATIYAINDLGQYEILSEDLSGLGSSK HN7.9 AYLQVGNNEIYELFQSAWSGADYVENKEDKEHLDATIYAINDLGQYEILSEDLSGLGSSK 130 140 150 160 170 180 | | | | | | | | | | | | BAA04134.1 EVISVPSELDAVIDYIHDYAEINEIEALARPWLPPLPESVYLQDLHAIQFKEAWAKEKKP HN1.1 EVISVPSELDAVIDYIHDYAEINEIEALARPWLPPLPESVYLRDLHAIQFKEAWTKEKKP HN7.9 EVISVPSELDAVIDYIHDYAEINEIEALARPWLPPLPESVYLQDLHAIQFKEAWTKEKKP 190 200 210 220 | | | | | | | | BAA04134.1 LQATVGLLDQPELQSQTPLTLDISKDGHVAVFSSPGYGKSTF HN1.1 LQATIGLLDQPELQSQTPLTLDISKDGHVAVFSSPGYGKSTI HN7.9 LQATVGLLDQPELQSQTPLTLDISKDGHVAVFSSPGYGKSTI Hình 3.6 So sánh trình tự amino acid protrein BCET vói trình tự BAA041341 ngân hàng gen quốc tế 3.3.3.2 Gen mã hóa độc tố NHE DNA plasmid của các dòng khuẩ n la ̣c trắ ng đươ ̣c tinh sa ̣ch và đo ̣c triǹ h tự Trình tự nucleotid gen bcet chủng HN 7.9 có 51 vị trí thay đổi so với 44 trình tự công bố ngân hàng gen quốc tế (Mã số DQ153257.1) có độ tương đồ ng 93% Trình tự dịch mã lý thuyết so sánh với trình tự protein có mã số ACO 28519.1 Kế t quả cho thấ y HN 7.9 có đoạn gen dịch mã có 278 acid amin với đô ̣ tương đồ ng 97%, đó có vị trí thay đổ i (28: T thành S , 71: N thành K , 133: T thành A ; 137: V thành S , 174: N thành D; 180: D thành N, 198: A thành S) (hình 3.7) 10 20 30 40 50 60 | | | | | | | | | | | | ACO28519.1 MQKRFYKKCLLTLMIAGVATSNAFPLHTFAAEQNVKVLQENAKDYSLGPAGFQDVMAQTT HN7.9 MQKRFYKKCLLTLMIAGVATSNAFPLHSFAAEQNVKVLQENAKDYSLGPAGFQDVMAQTT 70 80 90 100 110 120 | | | | | | | | | | | | ACO28519.1 HN7.9 SSIFAMDSYANLIQNQQETDLSKISSINSEFKGNMMQHQRDAKINAAYWLDRMKPQIMKT SSIFAMDSYAKLIQNQQETDLSKISSINSEFKGNMMQHQRDAKINAAYWLDRMKPQIMKT 130 140 150 160 170 180 | | | | | | | | | | | | ACO28519.1 DQNIINYNNTFQTYYNVMLIAIDQKDSVKLKADLEKLYADIVKNQNEVDVLLGNLKAFRD HN7.9 DQNIINYNNTFQAYYNSMLIAIDQKDSVKLKADLEKLYADIVKNQNEVDVLLGDLKAFRN 190 200 210 220 230 240 | | | | | | | | | | | | ACO28519.1 RMAKDTNSFKEDTNQLTAILASTNAGIPALEQQINTYNDSIKKSNDMVIAGGVLCVALIT HN7.9 RMAKDTNSFKEDTNQLTSILASTNAGIPALEQQINTYNDSIKKSNDMVIAGGVLCVALIT 250 260 270 | | | | | | | ACO28519.1 CLAGGPMIAVAKKDIANAEREIANLKDRISGAQAEVAI HN7.9 CLAGGPMIAVAKKDIANAEREIANLKDRISGAQAEVAI Hình 3.7 So sánh trình tự amino acid protrein NHE vói trình tự DQ153257.1 ngân hàng gen quốc tế 3.3.3.3 Gen mã hóa độc tố HBL Trình tự nucleotid gen HBL chủng HN 1.1 HN19.4 cho thấ y có vị trí biến đổi với độ tương đồng 99% so với triǹ h tự mang mã số L 20441.1 ngân hàng gen quố c tế Tuy nhiên nucleotid biế n đổ i này không ảnh hưởng đến dịch mã tạo acid amin Trình tự acid amin sau dịch mã có 106 acid amin với đô ̣ tương đồ ng 100% so với trình tự EEK50059.1 (hình 3.8) 45 10 20 30 40 50 60 | | | | | | | | | | | | EEK50059.1 ADVDADQKRLEEVLGSVNYYKQLESDGFNVMKGAILGLPIIGGIIVGVARDNLGKLEPLL HN1.1 ADVDADQKRLEEVLGSVNYYKQLESDGFNVMKGAILGLPIIGGIIVGVARDNLGKLEPLL HN19.4 ADVDADQKRLEEVLGSVNYYKQLESDGFNVMKGAILGLPIIGGIIVGVARDNLGKLEPLL 70 80 90 100 | | | | | | | | | EEK50059.1 AELRQTVDYKVTLNRVVGVAYSNINEMHKALDDAINALTYMSTQWH HN1.1 AELRQTVDYKVTLNRVVGVAYSNINEMHKALDDAINALTYMSTQWH HN19.4 AELRQTVDYKVTLNRVVGVAYSNINEMHKALDDAINALTYMSTQWH Hình 3.8 So sánh trình tự amino acid protrein HBL vói trình tự EEK50059.1 ngân hàng gen quốc tế B cereus phân bố rấ t rô ̣ng raĩ thực phẩ m , nhiên không phải tấ t cả chủng B cereus gây tiêu chảy (5), khả gây tiê u chảy cũng khác phu ̣ thuô ̣c đă ̣c tính di truyề n Kế t quả phân tích và so sánh trình tự gen bceT, nhe hblA cho thấ y các gen này phân bố rô ̣ng raĩ các loài thuô ̣c nhóm Bacillus cereus với trình tự nucleotid khác t uy nhiên trình tự acid amin của các protein này la ̣i tương đố i giố ng với đô ̣ tương đồ ng 95%, đă ̣c biê ̣t đố i với loài Bacillus thuringiensis Điề u này cũng đã đươ ̣c Asano và công sự công bố trước (3) Điề u này cho thấ y g en mã hóa các đô ̣c tố này không mang tin ́ h đă ̣c hiê ̣u loài và cũng tồ n ta ̣i bô ̣ gen của các loài nhóm Bacillus cereus Sự có mă ̣t của các gen này không quyế t đinh ̣ khả gây ngộ độc thực phẩm chủng B cereus Độc tố HBL đô ̣c tố NHE là tổ hơ ̣p đô ̣c tố đươ ̣c cấ u thành bởi đô ̣c tố thành phầ n (HBL bao gồ m L1, L2 B; NHE bao gồ m A, B và C) đó có thành phần liên kế t (binding protein) thành phần phân hủy (lytic protein) gen mã hóa cho tổ hơ ̣p NHE cũng gen mã hóa tổ hơ ̣p HBL đề u nằ m operon Tính gây đô ̣c tế bào của NHE phu ̣ thuô ̣c vào thành phầ n C (thành phần liên kết) (6) đó , sự biể u hiê ̣n của protein đô ̣c tố HBL phu ̣ thuô ̣c v có mặt tất gen mã hóa cho độc tố thành phần (4,7) 46 KẾT LUẬN - Đã phân lập 43 chủng vi khuẩn Bc từ mẫu thực phẩm thu thập số quán ăn vỉa hè địa bàn Hà Nội - Đã tách xác định khả mang gen độc tố nhe, bcet, hbl chủng Bc phân lập - Đã tách dòng gen nhe, bcet, hbl chủng HN1.1, HN7.9 HN19.4 so sánh với trình tự gen ngân hàng gen quốc tế Dịch mã lý thuyết trình tự amino acid cho thấy: + Với gen bcet: HN1.1 có vị trí thay đổi (163: Q thành R , 175: A thành T , 222: F thành I) (98%) HN7.9 có vị trí thay đổi (52: A thành T, 175: A thành T, 222: F thành I) (98%) so với triǹ h tự có mã số BAA04134.1 + Với gen nhe: HN7.9 có độ tương đồng 97% với trình tự amino acid số CO28519.1 ngân hàng gen Trong đo,́ có vị trí thay đổi(28: T thành S, 71: N thành K, 133: T thành A; 137: V thành S, 174: N thành D; 180: D thành N, 198: A thành S) + Với gen hbl, sau dịch mã lý thuyết có độ tương đồng 100% với trình tự amino acid có mã số EEK50059.1 ngân hàng gen quốc tế 47 KIẾN NGHỊ Các chủng Bc phân lập có khả gen độc tố có độ tương đồng không cao với chủng công bố ngân hàng gen điều mở hướng nghiên cứu chủng Bc phân lập Việt Nam Vì cần tạo điều kiện để tiếp tục triển khai nghiên cứu sâu phục vụ mục địch vệ sinh an toàn thực phẩm, y tế hay khoa học 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Ngô Đình Bính, Nguyễn Xuân Cảnh, Phạm Kiều Thuý, Nguyễn Thị Ánh Nguyệt, Nguyễn Đình Tuấn, Nguyễn Thanh Hạnh 2005 Nghiên cứu số đặc tính vi khuẩn Bacillus cereus phân lập Việt Nam Báo cáo khoa học Hội nghị Vệ sinh an toàn thực phẩm, tháng 112005, trang 120- 125 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty 2003 Vi sinh vật học Nhà xuất Giáo Dục Trần Đáng 2002 Công tác truyền thông đạo tuyến hoạt động bảo đảm chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm Nhà xuất Thanh Niên Lƣơng Đức Phẩm 2002 Vi sinh vật học an toàn vệ sinh thực phẩm Nhà xuất Nông Nghiệp Khuất Hữu Thanh 2003 Cơ sở di truyền phân tử kỹ thuật gen Nhà xuất khoa học kỹ thuật Tài liệu tiếng Anh Agaisse, H., Gominet, M., Okstad, O.A., Kolsto, A.B., and Lereclus, D 1999 PlcR is a pleiotropic regulator of extracellular virulence factor gene expression in Bacillus thuringiensis Molecular Microbiology 32(5), 1043-1053 Agata, N., Mori, M., Ohta, M., Suwan, S et al 1994 A novel dodecadepsipeptide, cereulide, isolated from Bacillus cereus causes vacuole formation in Hep-2 cells, FEMS Microbiol Lett.121, 31-34 Agata, N., Ohta, M., Arakawa, Y., and Mori, M 1995a The bceT gene of Bacillus cereus encodes an enterotoxic protein Microbiology 141(4), 983-988 Agata, N., Ohta, M., Mori, M., Isobe, M 1995b A novel dodecadepsipeptide, cereulide, is an emetic toxin of Bacillus cereus FEMS Microbiology Letters 129:17-20 49 10 Anderson, M., Mikkola, R., Helin, J., Anderson, M.C., SalkinojaSalonen, M.1998 A novel sensitive bioassay for detection of Bacillus cereus emetic toxin and relaed depsipeptide ionophores Appl Environ Microbiol 64, 1338- 1343 11 Anderson, M.A., Jaackelainen E.L Shaheen, R., Pirhonen, T., et al.2004 Sperm bioassay for rapid detection of cereulide producing Bacillus cereus in food and related environments Int J Food Microbiol,94, 175- 183 12 Andersson, A., Granum, P.E., and Ronner, U 1998 The adhesion of Bacillus cereus spores to epithelial cells might be an additional virulence mechanism International Journal of Food Microbiology 39(1-2), 93-99 13 Andersson, A., Ronner, U and Granum, P E 1995 What problem does the food industry have the spore- forming pathogens Bacillus cereus and Clostridium perfringens? International Journal of Food Microbiology 28, 145- 155 14 AOAC 1995 Differentiation of members of Bacillus cereus group: Microbiological method Sec 17.8.02, Method 983.26 In Official Methods of Analysis of AOAC International, 16th ed., P.A Cunniff (Ed.), 54-55 AOAC International, Gaithersburg, MD 15 Ash, C., and M.D Collins 1992 Comparative analysis of 23S ribosomal RNA gene sequences of Bacillus antharacis and emetic Bacillus cereus determined by PCR direct sequencing FESM Microbiol Lett 73, 75- 80 16 Banerjee, C., C.I Bustamante, R Wharton, E Talley, and J C.Wade 1988 Bacillus infections in patients with cancer Arch Intern Med 148, 343- 346 17 Beecher, D.J and Macmillan, J D 1991 Characterization of the components of hemolysin BL from Bacillus cereus Infection and Immunity 59(5), 1778-84 50 18 Beecher, D.J., Olesen, T.W., Somers, E.B., Wong, A.C.L 2000 Evidence for contribution of tripatite hemolysin BL, phosphatidyleholine preferring phospholipase C, and collagenase to verulence of Bacillus cereus endophthalmitis Infect Immun 68, 5269- 5276 19 Beecher, D.J., Schoeni, J.L., and Lee Wong, A.C 1995 Enterotoxic activity of hemolysin BL from Bacillus cereus Infection and Immunity 63(11), 4423-4428 20 Christiansson, A., Bertilsson, J and Svensson, B 1999 Bacillus cereus spores in raw milk: factors affecting the contamination of milk during the grazing period Journal of Dairy Science 82, 305- 314 21 Clavel, T., Carlin, F., Lairon, D., Nguyen- The, C., Schmitt, P 2004 Survival of Bacillus cereus spores and vegetative cells in acid media simulating human stomach Journal of Applied Microbiology 97(1): 214- 219 22 Corry, D Roberts, and F.A Skiner (ed.) Isolation and indenfication methods for food poisoning organisms Academic Press, London 23 Drobniewski, F A 1993 Bacillus cereus and related species Clin Microbiol Rev 6, 324- 338 24 Ehling- Schulz, M., Fricker, M., Scherer, S., 2004 Identification of emetic toxin producing Bacillus cereus strains by a novel molecular assay FEMS Microbiol Lett 232,189- 195 26 Ehling- Schulz, M., Vukov, N., Schulz, A., Shaleen, R., Anderson, M., Martlbauer, E., and Scherer, S., 2005 Indentification and partial characterization of the nonribosomal peptide synthetase gene responsible for cereulide production in emetic Bacillus cereus Appl Enviro Microbiol 71(1), 105- 113 27 Fernandez, A., Ocio, M J., Fernandez P S., Rodrigo, M and Martinez, A 1999 Application of non- linear regression analysis to the estimation of kinetic parameters for two enterotoxigenic strains of Bacillus cereus spores Food Microbiology 16, 607- 613 51 28 Finlay, W.J., Logan, N.A., Sutherland, A.D 2000 Bacillus cereus produces most emetic toxin at lower tempertures Lett Appl Microbiol 31, 385- 389 29 Gaviria Rivera, A.M., Granum, P.E and Priest, F.G 2000 Common occurrence of enterotoxin genes and enterotoxicity in Bacillus thuringiensis FEMS Microbiology Letter 190, 151- 155 30 Granum, P.E 2001 Bacillus cereus In: Doyle, M P., et al (Eds), Food microbiology: Fundamentals and Frotiers ASM Press, Washington, DC, pp 373- 381 31 Guinebretiere, M.H and Nguyen- The, C 2003 Sources of Bacillus cereus contamination in a pasteurised zucchini puree processing plant, differentiated by two PCR- based method FEMS Microbiology Ecology 43, 207- 215 32 Guinebretiere, M.H., Broussolle, V., Nguyen- The, C.2002 Enterotoxigenic profiles of food poisoning and food borne Bacillus cereus strains J Clin Microbiol 40, 3053- 3056 33 Haggblom, M.M., Apetroaie, C., Anderson, M.A., Salkinoja- Salonen, M S 2002 Quantitative analysis of cereulide, the emetic toxin of Bacillus cereus, produced under various conditions Appl Environ Microbiol 68, 2479- 2483 34 Hansen, B M., Hendrikdisen, N B 2001 Dectection of enterotoxic Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis strains by PCR analysis Appl Environ Microbiol 67, 185- 189 35 Hauge, S 1955 Food poisoning caused by aerobic spore forming bacilli J App Bacteriol 18: 591- 595 36 Jaakelainen, E.L., Haggblom, M.M., Andersson, M.A., SalkinojaSalonen, M S 2004 Atmospheric oxygen and other conditions affecting the production of cereulide by Bacillus cereus in food International Journal of Food Microbiology 96, 75- 83 52 37 Jeffery, E Rhodehamel and Stanley, M Harmon 1998 Bacillus cereus Bacteriological Analytical Manual, 8th Edition, Revision A Chapter 14 38 Kramer, J.M and Gilbert, J.M 1989 Bacillus cereus and other Bacillus species Ch 2, In Foodborne Bacterial Pathogens, M.P.Doyle (Ed.), Marcel Dekker, Inc., New York, p 21-70 39 Lund, T., and P.E Granum 1997 Comparison of biological effect of the two different enterotoxin complexes isolated from three different strains of Bacillus cereus Microbiology 143:3329- 3336 40 Mahler, H., Pasi, A., Kramer, J.M., Schulte, P., Scoging, A.C., Bar, W and Krahenbuhl, S 1997 Fulminant liver failure in association with the emetic toxin of Bacillus cereus (see comments) New England Journal of Medicine 336, 1142-1148 41 Marahiel, M.A., Stachelhaus, T Mootz, H.D 1997 Modular peptide synthetases involved in nonribosomal peptide synthesis Chem Rev 97, 2651- 2673 42 Mikkola, R., Saris, N.E., Grigoriew, P A., Anderson, M.A and Salkinoja- Salonen, M S 1999 Inophoretic properties and mitochonodrial effects of cereulide: the emetic toxin of B cereus Eur J Biochem 263 112- 117 43 Murray R.E., Don J Brenner Jonh G Holt, Noel R Krieg, et al Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology Vol2 529- 575 44 Notermans, S., and C.A Batt 1998 A rick assessment approach for food borne Bacillus cereus and its toxins J Appl Microbiol Symp Suppl 84:51S- 61S 45 Opinion of the Scientific Panel on Biological Hazards on Bacillus cereus and other Bacillus spp in foodstuffs The EFSA Journal 2004 175, 1- 49 53 46 Paananen, A., Mikkola, R., Sareneva, T., Matikainen, S., et al 2002 Inhibiton of human natural killer cells activity by cereulide, an emetic toxin from Bacillus cereus Clin Exp Immumol 129, 420- 428 47 Peng, J.S., Tsai, W.C and Chou, C.C 2001 Surface characteristics of Bacillus cereus and its adhesion to stainless steel International Journal of Food Microbiology 65, 105- 111 48 Pichayawasin, S., Kuse, M., Koga, K., Isobe, M., et al 2003 Complexation of cyclic dodecadepsipeptide, cereulide with ammonium salts Bioorg Med Chem Lett 13, 3507- 3512 49 Pol, I and Smith, E J., 1999 Combined action of nisin and carvacrol on Bacillus cereus and Listeria monocytogenes Letters in Applied Microbiology 29, 166- 170 50 Ray, B 1992 Nisin of Lactococus lactis ssp lactus as a food biopreservative Pp207- 264 in B Ray and M A Daeschel (ed) Food Biopresevatives of Naturnal Origen CRC Press Boca Raton Fla 51 Shinagawa, K 1990 Analytical methods for Bacillus cereus and other Bacillus species Int J Food Microbiol 10, 1250- 141 52 Shinagawa, K., Komuma, H., Sekita, H., Sugii, S 1995 Emesis of rhesus monkeys induced by intragastric administration with the Hep- vacuolation factor (cereulide) produced by Bacillus cereus FEMS Microbiol Lett 130, 87- 90 53 Shinagawa, K., Ueno, Y., Hu, D., Ueda, S., Sugii, S 1996 Mouse lethal activity of a HEp- vacuolation factor, cereulide produced by Bacillus cereus isolated from vomiting- type food poisoning J Vet Med Sci 58, 1027- 1029 54 Svenson, B., Ekelund, K., Ogura, H and Christiansson, A 2004 Charactetisation of Bacillus cereus isolated from milk silo tanks at eight different dairy plants International Dairy Journal 14, 17- 27 54 55 Turgay, K., Marahiel, M A.1994 A general approach for identifying and cloning peptide synthetase genes Pept Res 7, 238- 241 56 Vahey, J.B., and H.W Flynn, Jr 1991 Results in the management of Bacillus endophthalmitis Ophthalmic Surg 22: 681- 686 57 Wijanands, L.M., Dufrenne, J.B., Van Leusden, F.M The pathogenic mechanism of the diarrheal syndrome caused by Bacillus cereus RIVM report 250912001/2002 58 Yamada, S., Ohashi, E., Agata, N., Venkateswaran, K., 1999 Cloning and nudeotide sequence analysis of gyrB of Bacillus cereus, B thuringiensis, B mycoides, and B anthracis and their applicaation to the detection of B cereus in rice Appl Environ Microbiol 65(4), 1483- 1490 Tài liệu từ internet 59 Bacillus cereus www.aggiehorticulture.tamu.edu/extension/poison.html 60 Bacillus cereus www.emedicine health.com/articles/17289-1 asp 61 Bacillus cereus www.msu.edu/course/fsc/840/lect- 19.pdf 62 Bacillus cereus www.nzfsa.govt.nz/science/data-sheets/bacillu-cereus.pdf 63 Bacillus cereus 2005 www.textbookofbacteiology.net/B.cereus.html 64 Bacillus cereus www.vetmed.ucdavis.edu/PHR/PHR150/2005/B%20cereus.pdf 55 ... SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ĐINH THỊ NGA TÁCH DÕNG VÀ GIẢI TRÌNH TỰ GEN MÃ HÓA ĐỘC TỐ TIÊU CHẢY VÀ ĐỘC TỐ NÔN CỦA CHỦNG BACILLUS CEREUS PHÂN LẬP TẠI VIỆT NAM Chuyên ngành: Vi sinh vật Mã số:... vi hóa sinh học nói riêng ngành công nghệ thực phẩm đại xuất phát từ tính cấp thiết tiến hành đề tài: Tách dòng giải trình tự gen mã hóa độc tố tiêu chảy độc tó gây nôn chủng Bacillus cereus phân. .. phân lập Việt Nam Với mục đích tạo nguồn gen cho sản xuất nguyên liệu chế tạo kit phát độc tố vi khuẩn B cereus sau */ Mục tiêu nhiệm vụ: - Tách dòng đọc trình tự gen mã hóa độc tố gây nôn và tiêu