Đánh giá sự phân bố và nguồn gốc tiến hóa của virus gây bệnh xoăn cánh (Deformed Wing virus) trên ong mật Việt Nam (LV thạc sĩ)Đánh giá sự phân bố và nguồn gốc tiến hóa của virus gây bệnh xoăn cánh (Deformed Wing virus) trên ong mật Việt Nam (LV thạc sĩ)Đánh giá sự phân bố và nguồn gốc tiến hóa của virus gây bệnh xoăn cánh (Deformed Wing virus) trên ong mật Việt Nam (LV thạc sĩ)Đánh giá sự phân bố và nguồn gốc tiến hóa của virus gây bệnh xoăn cánh (Deformed Wing virus) trên ong mật Việt Nam (LV thạc sĩ)Đánh giá sự phân bố và nguồn gốc tiến hóa của virus gây bệnh xoăn cánh (Deformed Wing virus) trên ong mật Việt Nam (LV thạc sĩ)Đánh giá sự phân bố và nguồn gốc tiến hóa của virus gây bệnh xoăn cánh (Deformed Wing virus) trên ong mật Việt Nam (LV thạc sĩ)Đánh giá sự phân bố và nguồn gốc tiến hóa của virus gây bệnh xoăn cánh (Deformed Wing virus) trên ong mật Việt Nam (LV thạc sĩ)Đánh giá sự phân bố và nguồn gốc tiến hóa của virus gây bệnh xoăn cánh (Deformed Wing virus) trên ong mật Việt Nam (LV thạc sĩ)Đánh giá sự phân bố và nguồn gốc tiến hóa của virus gây bệnh xoăn cánh (Deformed Wing virus) trên ong mật Việt Nam (LV thạc sĩ)Đánh giá sự phân bố và nguồn gốc tiến hóa của virus gây bệnh xoăn cánh (Deformed Wing virus) trên ong mật Việt Nam (LV thạc sĩ)
BỘ GIÁO DỤC VIỆN KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT BÙI THỊ THÙY DƯƠNG ĐÁNH GIÁ SỰ PHÂN BỐ VÀ NGUỒN GỐC TIẾN HÓA CỦA VIRUS GÂY BỆNH XOĂN CÁNH (DEFORMED WING VIRUS) TRÊN ONG MẬT VIỆT NAM Chuyên ngành Sinh học thực nghiệm Mã số 60420114 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội – 2015 MỞ ĐẦU Ong mật biết đến lồi trùng có ích tự nhiên thơng qua việc thụ phấn cho Có tới 52 tổng số 115 loại trồng giới phụ thuộc vào thụ phấn ong bao gồm ăn lấy hạt Không thụ phấn cho trồng, sản phẩm từ ong đem lại nguồn lợi kinh tế lớn cho người nuôi ong Tuy nhiên ong mật thường b c ng nhi u t c nhân gây bệnh bao gồm virus vi huẩn nấm sinh tr ng C c d liệu nghiên c u v bệnh ong nh ng năm g n cho thấy virus nh ng nguyên nhân ch nh gây tổn thất cho người nu i ong làm giảm suất chất lượng chí hủy diệt đàn ong Từ đ u kỉ 20 có 22 loại virus có chất RNA gây bệnh phổ biến ong mật công bố Deformed wing virus (DWV) DWV phân lập l n đ u tiên vào nh ng năm 1980 Nhật Bản lan rộng toàn giới DWV gây bệnh ong trưởng thành với nh ng dấu hiệu quăn c nh chướng bụng, làm ong khơng có khả bay iếm mật; nhiễm ấu trùng làm chết ấu trùng, hậu gây thiệt hại lớn cho người nuôi ong Việt Nam đ ng th sáu v xuất mật ong giới th hai châu Á với kim ngạch g n 80 triệu USD/năm Tuy nhiên ngành nu i ong nước ta phải đối mặt với nhi u hó hăn đặc biệt tình hình bệnh d ch virus Vì x c đ nh có mặt phạm vi phân bố nguồn gốc tiến hóa virus gây bệnh c c đàn ong mật Việt Nam giúp nhà nghiên c u người nu i ong có sở để dự phịng u tr hiệu bệnh chủ động nguồn giống bệnh nhằm đem lại lợi ích cao cho người ni ong Xuất phát từ sở thực đ tài “Đánh giá phân bố nguồn gốc tiến hóa virus gây bệnh xoăn cánh (Deformed Wing virus) ong mật Việt Nam” Đ tài thực phòng Vi sinh vật phân tử, Viện Công nghệ Sinh học- Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu loài ong mật Ong mật thuộc ngành chân đốt (Arthropoda) hay lớp chân (Hecxapoda); phân ngành có ống h (Tracheata) Lớp c n tr ng (Insecta) Bộ c nh màng (Hymenoptera) Họ ong mật (Aptsdae) Giống ong mật (Apis) Các loài ong cho mật: + Ong châu Âu (ong ngoại): Apis mellifera (A.mellifera) + Ong nội đ a (ong châu Á): Apis cerana (A.cerana) + Ong Khoái (ong gác kèo): Apis dorsata (A.dorsata) + Ong Hoa (ong muỗi): Apisflorea (A.florea) Trong loài lại phân chia thành c c phân loại h c như: Đối với ong châu Âu (A.mellifera) có phân loài: Ong ý, ong Trung - Nga, ong Cacpat ong Crain ong v ng Capcazơ Đối với ong A.cerana có: A.cerana cerana, A.cerana indica, A.cerana japonica Mỗi phân lồi lại có nhi u dạng sinh th i - sinh học hình thành từ lâu đời t c động c c yếu tố ngoại cảnh h c c c đặc điểm th ch nghi với u iện sống h c Đi u dẫn đến c c đặc điểm có h c có nghĩa inh tế người nghĩa to lớn c ng t c giống ong chúng bảo vệ trì t nh đa dạng sinh học th ng qua c c hệ gen qu tồn tự nhiên Việt Nam tồn loài ong mật có ngịi đốt có lồi đ a: ong nội (A cerana); ong khoái (A.dorsata); ong đ (A laboriosa); ong ruồi đen (A andreniformic); ong ruồi đỏ (A florea) ong ngoại (A mellifera) Trong ong nội ong ngoại hai loài ong nu i rộng rãi sản xuất ngành ong Việt Nam Ngồi tự nhiên cịn gặp lồi ong mật h ng ngịi đốt (Stingless bees) c c lồi t có gi tr inh tế Ong nội (Apis cerana) Hình 1.1 Ong nội Apis cerana Ong nội A.cerana giống ong đ a Việt Nam, Trung Quốc số nước khác Ở nước ta, ong nội phân bố rộng khắp nước ngoại trừ rừng tràm U Minh Ong nội có đặc t nh chăm chỉ, ch u n kiện sống bất lợi, d ch bệnh, chất lượng mật cao, nhiên suất mật thấp, d , dễ bốc bay chia đàn Ong nội thích nghi tốt với nguồn hoa rải rác, ni quy mơ từ hộ gia đình tới ni chun nghiệp th ch hợp với kiểu ni ong quy mơ nhỏ gia đình cung cấp sản phẩm phục vụ tiêu d ng nước Để phát triển ong nội, c n chọn c c đàn có t nh tụ đàn cao, chọn giống ong tốt quan tâm tới phòng bệnh để nâng cao suất mật Ong ngoại (Apis mellifera) Hình 1.2 ong ngoại Apis mellifera Ong ngoại A.mellifera có nguồn gốc từ châu Âu châu Phi nhập vào nước ta từ nh ng năm 60 với hình th c thương mại th ch nghi tốt với u iện h hậu nguồn hoa nước ta Loài ong ph t triển tốt nh ng nơi có nguồn hoa tập trung th ch hợp với iểu nu i ong chuyên nghiệp với trình độ chuyên m n hóa cao vốn đ u tư lớn Ong ngoại có lớn ong nội ch thước tụ đàn dự tr mật cao mật ong ngoại chủ yếu để xuất hẩu Nhưng ong ngoại có s c ch u đựng ém nên nh ng nơi có nguồn hoa rải r c u iện hắc nghiệt việc nu i ong ngoại h ng thể Bên cạnh nh ng gi tr inh tế mà ong ngoại đem lại việc nhập ong A.mellifera mang theo c c loài sinh bệnh bệnh thối ấu tr ng châu Âu bệnh ấu tr ng túi bệnh bào tử tr ng Nosema cho c c loài ong đ a Ngoài cịn số lồi ong hoang dã ong ho i (A.dorsata) ong đ (A.laboriosa), ong hoa (A.florea) Tuy nhiên việc hai th c mật c c loài chiếm tỉ lệ nhỏ chủ yếu dừng lại hai th c săn bắt tự nhiên 1.2 Lợi ích ong mật 1.2.1 Ong mật ngành nông lâm nghiệp Ong mật có vai trị quan trọng sản xuất n ng nghiệp toàn c u Mỗi năm có tới 52 115 loại trồng giới phụ thuộc vào thụ phấn ong bao gồm ăn lấy hạt C c mặt hàng phụ thuộc vào ong giảm tới 90% h ng có ong mật Thêm vào sản lượng chất lượng ch cỡ giảm từ 90-40% 16 mặt hàng thương mại Có tới 22 6% tổng số n ng nghiệp c c nước ph t triển 14 7% c c nước ph t triển phụ thuộc vào thụ phấn động vật Có tới 35% lượng thực phẩm chế độ ăn người có nguồn gốc từ thụ phấn Ước t nh gi tr c c loài c n tr ng thụ phấn đem lại cho người hoảng 212 tỉ USD chiếm 9.5 % tổng giá tr c c sản phẩm n ng nghiệp [38] Ong mật h ng phải loài c n tr ng thụ phấn h ng phải hiệu thụ phấn tất c c loại trồng Tuy nhiên ong loại c n tr ng thụ phấn quan trọng c c loài trồng giới [28] Ong nu i nhân tạo với c c loại đường c c loại protein Chúng gi c c th ng nu i an tồn để vận chuyển c c hoảng c ch xa để thụ phấn Đặc t nh sinh học ong mật ph hợp cho việc thụ phấn thương mại Chúng di chuyển với hoảng c ch 4.5 m quanh tổ ghé thăm nh ng loại hoa h ng th ch hợp cho việc thụ phấn Ong mật thụ phấn cho diện t ch 6360 hecta tổ ong đặt gi a trung tâm vườn h ng làm ảnh hưởng tới c c v ng h c Một ong b o cho đồng loại biết v tr hoa đâu để c c ong h c éo tới Đi u làm cho ong mật loài thụ phấn hiệu [36] 1.2.2 Lợi ích từ sản phẩm ong mật Ong mật h ng nh ng loài c n tr ng có ch giúp thụ phấn cho trồng mà đem lại nhi u gi tr inh tế cho người nu i ong Nuôi ong h ng tốn đất trồng c c loại hình chăn nu i h c tư lớn Ngh nu i ong h ng c n vốn đ u ch th ch trồng gây rừng ăn C c sản phẩm từ ong bao gồm: - Mật ong : sản phẩm ch nh ong chủ yếu đường đơn gluco fructose Trong mật cịn có nhi u vitamin nhóm B (B1, B2, B3) vitamin C Vitamin E lượng lớn Kali g mật ong ch a 31503350 cal d ng để bồi bổ ch a bệnh - Phấn hoa: sản phẩm giàu chất dinh dưỡng thu lượm từ nh nhi u lồi hoa h c Có nhi u màu sắc h c (vàng vàng x m đỏ nhạt ) Phấn hoa ch a 7-35% protein có 10% c c amino acid tự D ng để bồi bổ thể ch a bệnh - S a chúa: Là nguồn dinh dưỡng cao cấp sản phẩm đặc biệt ong Đây nguồn dinh dưỡng để nu i chúa ấu tr ng ong chúa ong thợ non tiết Thành ph n dinh dưỡng s a chúa bao gồm: protein 18% mỡ 46% c c vitamin chất h 39 9% tro 82% S a chúa ch th ch qu trình trao đổi lipit protein giúp cho thể hỏe mạnh hoạt b t S a chúa giàu hoocmon sinh dục vitamin E, có t c dụng ch th ch hoạt động sinh l t i tạo tế bào chống già cỗi c c tổ ch c tế bào - S p ong: Là vật tư chủ yếu để làm n n b nh tổ cho ong Ngồi s p ong cịn d ng c c ngành c ng nghiệp dệt y tế hàng h ng - Keo ong: Ong d ng eo để v t n he hở gi a c c c u ong xung quanh th ng để chúng u hòa nhiệt độ th ng ong cho ph hợp Keo ong có t nh s t huẩn diệt huẩn cao nên dân gian ngành y tế d ng để làm thuốc chống viêm nhiễm làm lành vết thương [3] Tình hình ni ong xuất mật ong giới Việt Nam 1.3 Tình hình ni ong xuất mật ong giới Theo thống ê Tổ ch c n ng lượng thực giới T nh tới thời điểm c ng bố tổng số đàn ong giới hoảng 72.6 triệu đàn năm 2007 tăng 64% so với năm 1961 Tuy nhiên tỉ lệ số đàn ong tăng giảm h c toàn c u Số lượng đàn ong mật Mỹ giảm tới 61% từ 5.9 triệu đàn ong năm 1947 xuống 2.3 triệu đàn năm 2008 Bắc Mĩ giảm tới 49 5% Trong hi châu Âu số lượng đàn ong giảm 26.5% Riêng Anh 20% đàn ong biến năm 2008 Năm 1970 số lượng đàn ong 21 triệu đàn giảm xuống 15.5 triệu đàn t nh tới năm 2007 Trong hi c c nước châu Á tăng (426%) châu Phi tăng (130%) Nam Mĩ (86%), Châu Đại Dương (39%) V sản lượng mật ong theo số liệu thống ê năm 2005 Hiệp hội nu i ong quốc tế (APIMONDIA) sản lượng mật ong giới hoảng triệu Trung Quốc nước có sản lượng mật ong lớn ( hoảng 180.000 tấn) nước xuất hẩu lớn Argentina (90.000 tấn) Gi tr toàn c u năm 2007 ước t nh đạt 25 tỉ USD Cũng theo báo cáo th trường mật ong Hội đồng quốc gia Mỹ ngày 24/01/2014: Năm 2013 Mỹ nhập hẩu 142.925.543 g mật ong với gi tr 455.511.802 USD C c nước xuất hẩu mật ong chủ yếu vào Mỹ Argentina Việt Nam Ấn Độ Uruguay Canada Brazin (Bảng 1.1) V hối lượng mật ong nhập hẩu vào Mỹ đ ng th Argentina 41.581.668 g đ ng th Việt nam 30.501.060 g th ba Ấn Độ 24.852.692 g c c nước Uruguay Brazin Canada Gi tr xuất hẩu đ ng đ u Argentina đạt gi tr 136.501.855 USD đ ng th Việt Nam 75.668.847 USD tiếp đến Ấn Độ Canada Brazin Uruguay Gi mật ong bình quân/ g cao Canada đạt 61 USD c c nước h c 3.99 tiếp đến Brazin 3.31 Argentina 3.28 thấp Việt Nam 2.48 USD/kg Bảng 1.1 Tình hình nhập mật ong vào Mỹ năm 2013 Nƣớc TT Khối lƣợng mật(kg) Giá trị (USD) Giá (USD) bq/kg Argentina 41.581.668 136.501.855 3.28 Việt Nam 30.501.060 75.668.847 2.48 Ấn Độ 24.852.692 67.414.679 2.71 Uruguay 8.616.316 27.076.440 3.14 Brazin 8.452.259 28.008.070 3.31 Canada 8.466.810 39.097.273 4.61 C c nước h c 20.454.738 81.744.638 3.99 142.925.543 455.511.802 3.18 Tổng số 1.3.2 Tình hình ni ong xuất mật ong Việt Nam Trong nh ng năm g n ngh nu i ong Việt Nam có ph t triển nhanh v số lượng đàn sản lượng mật ong thu số lượng mật xuất hẩu tăng mạnh nhờ ch nh s ch nhà nước v đ u tư cho c ng t c nghiên c u huyến n ng ong mở rộng th trường xuất hẩu c c sản phẩm ong Năm 1994 nước có hoảng 40.000 đàn ong năm 2001 270.000 đàn Tổng số đàn ong Việt Nam năm 2006 vào hoảng 678.987 đàn tăng l n so với năm 2000 (273.872 đàn) Theo th ng tin từ Hội Nu i ong Việt Nam ước tính tới nước ta có triệu đàn ong 350.000 đàn ong nội chiếm (23 33%) 1.150.000 đàn ong ngoại chiếm 76 67% Số người nu i ong hoảng 34 nghìn người số người nu i ong chuyên nghiệp hoảng 6.350 người chiếm 18 67% Tuy nhiên số lượng đàn ong t so với ti m nguồn mật c c v ng sinh th i Việt Nam (theo t nh to n l thuyết hai th c 35-45% tr lượng mật phấn) suất mật đàn ong thấp chất lượng mật chưa cao nên gi b n thấp Tốc độ tăng trưởng giai đoạn 2001-2006 đạt bình quân 26% Số người nu i ong đến năm 2005 2 vạn người Th trường mật ong nước tăng nhanh Trong năm g n m c tiêu thụ tăng trung bình hoảng 8-10% Năm 2002 mật ong Việt nam có dư lượng thuốc h ng sinh đặc biệt Chloramphenicol số l hàng xuất sang th trường châu Âu làm ảnh hưởng tới uy t n ngành ong gây hậu to lớn ngành chăn nu i ong Do nh ng yêu c u nghiêm ngặt c c nước nhập hẩu đặc biệt th trường châu Âu nh ng năm g n người nu i ong có th c việc đảm bảo chất lượng sản phẩm p dụng nh ng biện ph p ỹ thuật chăn nu i phòng tr bệnh nên sản lượng mật tăng lên c ng với chất lượng sản phẩm cải thiện Tình hình xuất mật ong Việt Nam năm gần Việt Nam đ ng th v xuất ong mật Châu Á đ ng th giới Năm 2011 sản lượng mật ong nước 30.000 tấn, 27.000 xuất sang nước Năm 2012 doanh thu xuất mật ong Việt Nam đạt 58 triệu USD – chiếm 3,1% th ph n xuất mật ong giới Trong Mỹ th trường nhập lớn nhất, chiếm đến 95% sản lượng mật ong Việt Nam bán giới Đến 2013, sản lượng mật ong nước 48.000 37.000 xuất Đặc biệt 2013 năm đ u tiên Việt Nam xuất mật ong vượt mốc 30.000 vào Mỹ đạt kim ngạch 75.66 triệu USD Với lượng mật xuất sang Trung Đ ng Nhật bản, EU số nước châu Á khác xuất khoảng 34.000 tấn, kim ngạch xuất đạt khoảng 85 triệu USD, bước tiến nhảy vọt ngành nu i ong Tuy nhiên lượng mật ong xuất năm 2013 gồm có vài nghìn từ năm 2012 chưa xuất Mặt khác với giá xuất 2,48 USD/kg mật giá thấp so với giá bình quân xuất vào Mỹ 3,31 USD nhi u nước khác Năm 2014 im ngạch xuất mật ong Việt Nam đạt 120 triệu USD Trong quý I/2015, tính riêng th trường châu Âu, doanh nghiệp Việt Nam xuất đuợc 80 mật ong 46 1 GTG GGC TAA TGG CCG GGC CTG ACC GCG AGC CTG CAG CGT CAG ATG Val Gly End Trp Pro Gly Leu Thr Ala Ser Leu Gln Arg Gln Met 45 15 46 16 GAT TAT ATG AAA CTG AAA AGC AGC AGC TAT GTG GTG TTT GAT CTG Asp Tyr Met Lys Leu Lys Ser Ser Ser Tyr Val Val Phe Asp Leu 90 30 91 31 CAG GAA AGC AAC AGC TTT ACC TTT GAA GTG CCG TAT GTG AGC TAT Gln Glu Ser Asn Ser Phe Thr Phe Glu Val Pro Tyr Val Ser Tyr 135 45 136 46 CGT CCG TGG TGG GTG CGT AAA TAT GGC GGC AAC TAT CTG CCG AGC Arg Pro Trp Trp Val Arg Lys Tyr Gly Gly Asn Tyr Leu Pro Ser 180 60 181 61 AGC ACC GAT GCG CCG AGC ACC CTG TTT ATG TAT GTG CAG GTG CCG Ser Thr Asp Ala Pro Ser Thr Leu Phe Met Tyr Val Gln Val Pro 225 75 226 76 CTG ATT CCG ATG GAA GCG GTG AGC GAT ACC ATT GAT ATT AAC GTG Leu Ile Pro Met Glu Ala Val Ser Asp Thr Ile Asp Ile Asn Val 270 90 271 91 TAT GTG CGT GGC GGC AGC AGC TTT GAA GTG TGC GTG CCG GTG CAG Tyr Val Arg Gly Gly Ser Ser Phe Glu Val Cys Val Pro Val Gln 315 105 316 106 CCG AGC CTG GGC CTG AAC TGG AAC ACC GAT TTT ATT CTG CGT AAC Pro Ser Leu Gly Leu Asn Trp Asn Thr Asp Phe Ile Leu Arg Asn 360 120 361 121 GAT GAA GAA TAT CGT GCG AAA ACC GGC TAT GCG CCG TAT TAT GCG Asp Glu Glu Tyr Arg Ala Lys Thr Gly Tyr Ala Pro Tyr Tyr Ala 405 135 406 136 GGC GTG TGG CAT AGC TTT AAC AAC AGC AAC AGC CTG GTG TTT CGT Gly Val Trp His Ser Phe Asn Asn Ser Asn Ser Leu Val Phe Arg 450 150 451 151 TGG GGC AGC GCG AGC GAT CAG ATT GCG CAG TGG CCG ACC ATT AGC Trp Gly Ser Ala Ser Asp Gln Ile Ala Gln Trp Pro Thr Ile Ser 495 165 496 166 GTG CCG CGT GGC GAA CTG GCG TTT CTG CGT ATT AAA GAT GGC AAA Val Pro Arg Gly Glu Leu Ala Phe Leu Arg Ile Lys Asp Gly Lys 540 180 541 181 AAA GCG GCG GTG GGC ACC CAG CCG TGG CGT ACC ATG GTG GTG TGG Lys Ala Ala Val Gly Thr Gln Pro Trp Arg Thr Met Val Val Trp 585 195 586 196 CCG AGC GGC CAT GGC TAT AAC ATT GGC ATT CCG ACC TAT AAC GCG Pro Ser Gly His Gly Tyr Asn Ile Gly Ile Pro Thr Tyr Asn Ala 630 210 631 211 GAA CGT GCG CGT CAG CTG GCG CAG CAT CTG TAT GGC GGC GGC AGC Glu Arg Ala Arg Gln Leu Ala Gln His Leu Tyr Gly Gly Gly Ser 675 225 676 226 CTG ACC GAT GAA AAA GCG AAA CAG CTG TTT GTG CCG GCG AAC CAG Leu Thr Asp Glu Lys Ala Lys Gln Leu Phe Val Pro Ala Asn Gln 720 240 721 241 CAG GGC CCG GGC ACC GCG AGC AAC GGC AAC CCG GTG TGG GAA GTG Gln Gly Pro Gly Thr Ala Ser Asn Gly Asn Pro Val Trp Glu Val 765 255 766 256 ATG CGT GCG CAG TTT GGC AAC Met Arg Ala Gln Phe Gly Asn 786 262 Hình 3.3 Trình tự đoạn nucleotide gen VP1 Deformed Wing virus phân lập từ mẫu ong thu Hƣng Yên 47 Trình tự sản phẩm PCR xử lý ph n m m Bioedit d ch mã sang trình tự acid amin suy diễn so s nh với trình tự protein DWV Genbank Kết phân tích cho thấy, trình tự khuếch đại có độ tương đồng lên đến 99% so với trình tự VP1 DWV cơng bố Genbank (bảng 3.2) Kết khẳng đ nh đoạn mồi chúng tơi thiết kế có t nh đặc hiệu cao cho DWV, d ng để chuẩn đo n bệnh xoăn c nh DWV gây ong mật Việt Nam Đoạn DNA sản phẩm PCR t ch dòng vector pCR 2.1 d ng làm đối ch ng dương phản ng phát bệnh xoăn c nh DWV c c th nghiệm Bảng 3.2 Kết so sánh trình tự amino acid suy diễn VP1 với trình tự ngân hàng gen Mã số M tả Độ che Độ tương phủ đồng Select seq dbj |BAM42600.1| capsid protein [Deformed wing virus] 98% 99% Select seq dbj|BAM15910.1| capsid protein VP1 [Deformed wing virus] 98% 99% Select seq dbj|BAM42602.1| capsid protein [Deformed wing virus] 98% 99% Select seq dbj|BAM62925.1| capsid protein wing virus] 98% 99% [Deformed Tách dòng đoạn sản phẩm PCR Sản phẩm PCR gen VP1 DWV gắn vào vector tách dịng pCR2.1® enzyme T4-DNA ligase Sau biến nạp vào tế bào E coli (DH5α) c c huẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp (vector pCR2.1® gắn sản phẩm PCR gen VP1) chọn lọc theo phương ph p huẩn lạc xanh trắng Chúng nhặt nuôi ngẫu nhiên khuẩn lạc màu trắng từ đĩa biến nạp plasmid tái tổ hợp mang sản phẩm PCR, khuẩn lạc màu xanh làm đối 48 ch ng sau tiến hành tách chiết DNA plasmid Kết tách chiết DNA plasmid trình bày hình 3.4 Khi điện di gel agarose 1% tác dụng dòng điện chi u plasmid di chuyển v phía cực dương Sự di chuyển plasmid phụ thuộc vào cấu trúc h ng gian ch thước phân tử Quan sát kết ảnh điện di (hình 3.4) cho thấy DNA plasmid có băng vạch nh ng v trí khác với độ đậm nhạt h c Đi u tế bào plasmid tồn nhi u dạng cấu trúc khác nhau: mạch vòng (2 sợi DNA xoắn vào nối với tạo thành vòng khép kín), vịng xoắn số trạng thái siêu xoắn (plasmid tồn vi khuẩn xoắn lại thành dây hình số nhi u vịng) Plasmid dạng siêu xoắn có kích thước nhỏ gọn nên di chuyển nhanh tương ng với băng vạch thấp nhất, plasmid dạng xoắn vòng số tương ng với băng gi a plasmid dạng vòng di chuyển chậm có băng vạch cao Plasmid giếng số 1, có khả mang sản phẩm PCR chúng có ch thước lớn so với ch thước plasmid tách chiết từ khuẩn lạc màu xanh Plasmid khuẩn lạc màu trắng có gắn thêm sản phẩm PCR ch thước lớn so với ch thước plasmid khuẩn lạc màu xanh ( h ng có đoạn chèn), di chuyển chậm có lớn so với ch thước ch thước plasmid tách từ khuẩn lạc màu xanh Chúng tơi chọn dịng plasmid đường chạy số 1.2 để phân tích tiếp cắt kiểm tra với enzyme giới hạn plasmid tái tổ hợp mang gen đ ch 49 X Hình 3.4 Kết tách chiết plasmid Đường chạy X: plasmid tách từ khuẩn lạc màu xanh; đường chạy 1-3: plasmid tách chiết từ khuẩn lạc màu trắng Kết cắt kiểm tra enzyme giới hạn Do vector tách dịng pCR® 2.1 có hai v trí cắt EcoRI hai đ u vùng cắt gắn đa v (v trí gắn DNA ngoại lai) nên sử dụng enzyme để x c đ nh có hay khơng sản phẩm PCR vector tách dịng Nếu plasmid có gắn sản phẩm PCR sau xử lý enzyme giới hạn EcoRI văng đoạn DNA có chi u dài tương đương với chi u dài sản phẩm PCR gắn vào băng có ch thước ch thước vector PCR 2.1® Sản phẩm phản ng cắt enzyme EcoRI điện di kiểm tra gel agarose 1% Kết điện di sản phẩm cắt thể hình M pCR2.1 VP1 Hình 3.5 Điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp mang gen VP1 virus DWV Đường chạy M: Thang th DNA 1kb (Fermentas); đường chạy 1-3: plasmid tái tổ hợp số 1, cắt EcoRI 50 Kết điện di hình 3.5 cho thấy sản phẩm cắt đường chạy số 1,2, đ u xuất băng DNA có ch thước khoảng b tương ng với kích thước vetor pCR2.1 băng có với ch thước khoảng 750 bp tương ng ch thước sản phẩm PCR gen VP1 Như chúng t i chọn dòng plasmid tái tổ hợp mang sản phẩm PCR Plasmid tái tổ hợp d ng làm đối ch ng dương cho c c nghiên c u Phát virus thực địa RNA tổng số từ mẫu ong ấu tr ng ong trưởng thành từ 180 đàn ong l n lượt tách chiết sử dụng làm khuôn cho phản ng RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu VP1 m tả Sản phẩm RT-PCR điện di phân tích gel agrose 1% Kết điện di mẫu dương t nh có xuất băng sản phẩm với ch thước với ch thước mẫu đối ch ng dương g n với băng 750 bp thang DNA th (hình 3.6) Sản phẩm PCR tư c c mẫu dương t nh tinh đọc trình tự gen tiến hành phân tích xây dựng phát sinh lồi M 10 11 kb 750bp 12 13 Sản phẩm PCR Hình 3.6 Điện di sản phẩm PCR mốt số mẫu ong thực địa sử dụng cặp mồi đặc hiệu VP1 virus DWV M : Thang th DNA 1kb (Fermentas); 1: Mẫu đối ch ng dương (plasmid t i tổ hợp mang gen VP1); 2: Mẫu đối ch ng âm (SBV); 3-13: Các mẫu ong thu thập từ thực đ a Tiến hành l n lượt với tất 180 đàn ết u tra tỉ lệ nhiễm DWV 10 tỉnh thể bảng 3.3 hình 3.7 51 Bảng 3.3 Tỉ lệ nhiễm DWV đàn ong Tỉnh Tổng số đàn u Tỉ lệ nhiễm tra 10 tỉnh thành Tỉ lệ nhiễm c c giai đoạn Ấu tr ng Trưởng thành Bắc Giang 18 0% 0% 0% Điện Biên 18 0% 0% 0% Hịa Bình 18 0% 0% 0% Hưng n 18 17% 0% 17% Nghệ An 18 0% 0% 0% Bình Phước 18 22% 0% 22% C n Thơ 18 6% 0% 6% Đồng Nai 18 6% 0% 6% Lâm Đồng 18 17% 6% 11% Ti n Giang 18 0% 0% 0% Kết u tra cho thấy 10 tỉnh u tra có 12 tổng số 180 đàn ph t có lây nhiễm DWV chiếm 6.7% tổng số đàn Khi so s nh tỉ lệ nhiễm DWV gi a tỉnh Hưng Yên tỉnh mi n Bắc phát virus DWV với tổng số 18 đàn chiếm tới 17% Các tỉnh mi n Nam có tới 4/5 tỉnh u tra nhiễm DWV Trong Bình Phước có tỉ lệ cao chiếm 22% Lâm Đồng với 17%, tỉnh C n Thơ Đồng Nai tỉ lệ nhiễm 6%, Ti n Giang không phát đàn nhiễm DWV Virus gây bệnh ong mật lây nhiễm làm chết ong giai đoạn ấu tr ng giai đoạn ong trưởng thành Việc x c đ nh tỷ lệ nhiễm bệnh DWV ong trưởng thành ấu tr ng ong có nghĩa lớn dự phòng u tr bệnh DWV gây nên Kết u tra tỉ lệ nhiễm DWV ấu tr ng ong ong trưởng thành (hình 3.7) DWV phát ong trưởng thành mẫu ấu tr ng Tuy nhiên ong trưởng thành có tỉ lệ nhiễm cao so với mẫu ấu trùng 52 25% 20% 15% Tỉ lệ nhiễm 10% Tỉ lệ nhiễm Ấu trùng Tỉ lệ nhiễm Trưởng thành 5% 0% Hình 3.7 Tỉ lệ nhiễm DWV tỉnh thành Như có mặt DWV diện rộng khẳng đ nh Tuy nhiên tỉ lệ nhiễm chưa cao Mặc dù vậy, kết nghiên c u cho thấy c n chủ động phịng bệnh chăm sóc tốt đàn ong để tr nh nguy b ng ph t d ch 3.6 Xác định độ tƣơng đồng chủng virus DWV phân lập Việt Nam giới Chúng tinh sản phẩm PCR mẫu dương t nh với virus DWV sau tiến hành giải trình tự gen phân tích Các trình tự DWV d ng để so s nh lấy từ ngân hàng gen (bảng 3.3) Bảng 3.4 Các chủng DWV ngân hàng gen đƣợc sử dụng để phân tích gen VP1 lƣu hành Việt Nam năm 2014 TT Kí hiệu chủng Số đăng ký Ngân hàng gen Năm phân lập Nƣớc phân lập Chile JQ413340 2012 Chile Italy AJ489744 2006 Italy Kor1 JX878304 2013 Hàn Quốc Kor2 JX878305 2013 Hàn Quốc 53 USA AY292384 2006 Mỹ UK1 GU109335 2009 Anh UK2 HM067437 2010 Anh UK2014 KJ437447 2014 Anh Sử dụng ph n m m Bioedit để so sánh m c độ tương đồng Kết phân t ch thể bảng 3.4 Từ kết phân tích chúng tơi nhận thấy, trình tự gen VP1 gi a chủng DWV gây bệnh ong mật Việt Nam có độ tường đồng cao (98% tới 100%) Như khơng có biến đổi nhi u gi a chủng DWV v mặt đ a lí gi a chủng Việt Nam Kết gợi ý rằng, chủng DWV gây bệnh ong Việt Nam từ chủng Tuy c n thêm nghiên c u sâu phân t ch t nh độc lực, hay giải mã toàn hệ gen virus để khẳng đ nh giả thuyết Để tìm hiểu nguồn gốc tiến hóa chủng DWV lưu hành Việt Nam, chúng tơi so sánh với trình tự VP1 DWV phân lập Việt Nam với trình tự gen VP1 chủng phân lập giới Kết cho thấy gen VP1 DWV gây bệnh cho ong mật Việt Nam có độ tương đồng thấp so với chủng DWV giới Cụ thể so với chủng DWV phân lập từ Chile (89-90%) Hàn Quốc (89%-90%), Anh (84%-85%), Mỹ (89%-90%) Italy (87%- 88%) Như qua kết thấy chủng DWV lưu hành Việt Nam có nh ng biến đổi nhi u so với chủng DWV gây bệnh ong mật giới 54 Bảng 3.5 Mức độ tƣơng đồng chủng DWV phân lập Việt Nam giới dựa trình tự nucleotide 3.7 Cây phát sinh nguồn gốc tiến hóa DWV Cây phát sinh chủng loại xây dựng sở trình tự VP1 chủng DWV phân lập tỉnh thành Việt Nam trình tự VP1 DWV Genbank ph n m m MEGA6, khoảng cách tiến hóa t nh theo phương ph p Neighbor Joining Tree với hệ số Bootstrap 1000 Kết phân tích phát sinh chủng loại (hình 3.8) cho thấy chủng DWV phân thành nhóm ch nh đại diện cho Clade Clade gồm chủng từ c c nước Mỹ, Italy, Hàn Quốc, Nhật Bản Trung Quốc Clade gồm chủng phân lập Vương quốc Anh Các chủng DWV phân lập Việt Nam nằm nhánh riêng rẽ (Clade 2) phân loại Kết phát sinh chủng loại hoàn toàn phù hợp với kết so s nh độ tương đồng v trình tự nucleotide chủng virus phân lập Việt Nam so với chủng giới từ trình bày Hiện giới có tổng cộng 10 trình tự genome hồn chỉnh DWV cơng bố có chủng Việt Nam ký hiệu GLVN Chủng GLVN tác giả Hà Th Thu cộng giải trình tự cơng bố nằm v Clade 55 tách biệt so với chủng lại tương tự ết chúng t i thu nghiên c u Có thể thấy rõ virus Deformed wing phân lập Việt Nam có quan hệ di truy n xa so với chủng công bố [2] VP1 Japan AB721532 99 70 VP1Japan AB721531.1 59 VP1Japan-AB721535.1 23 VP1 China AB721512 VP1 Kor JX878304 VP1 China AB721511.1 85 33 VP1 China AB721510.1 VP1 Japan AB721534.1 77 100 VP1 Japan AB721533 Clade VP1 USA AY292384 100 VP1 Italy AJ489744 99 52 VP1 Kor JX878305 86 VP1 Chile JQ413340 VP1 China AB746353 T275DHY 99 T396DBP T276DHY 100 T393DBP 56 T397DBP 6835 20 31 T386DBP Clade T418DLD T369DDN T413DCT 59 A414DLD T277DHY 33 98 T427DLD VP1 UK-KJ437447 100 VP1 UK HM067437 Clade 95 VP1 UK HM067438 0.01 Hình 3.8 Cây phát sinh chủng loại DWV dựa trình tự gen VP1 đƣợc xây dựng phƣơng pháp NJ (giá trị bootstrap 1000) Các chủng DWV phân lập Việt Nam (kí hiệu hình trịn đậm) 56 KẾT LUẬN - Đã hảo sát lây nhiễm DWV 180 đàn ong mật 10 tỉnh thành nước, phát 12/180 đàn nhiễm DWV chiếm tỷ lệ 6.7% Tỷ lệ nhiễm DWV tỉnh l n lượt Bình Phước (22%) Hưng Yên (17%) Lâm Đồng (17%) Đồng Nai (6%) C n Thơ (6%) C c tỉnh lại Bắc Giang Điện Biên Hịa Bình Ti n Giang Nghệ An h ng ph t thấy có mặt DWV - Đã giải trình tự gen VP1 chủng DWV gây bệnh ong mật Việt Nam Kết phân tích trình tự cho thấy gen VP1 tách từ 12 mẫu ong nhiễm bệnh lưu hành Việt Nam có độ tương đồng cao (99%-100%), nhi u khả chúng c ng chủng - Đã xây dựng phát sinh chủng loại dựa trình tự gen VP1 tách từ 12 ong mật Việt Nam chủng DWV giới Kết phân tích cho thấy chủng lưu hành Việt Nam có quan hệ g n gũi với tách thành nhánh riêng rẽ so với chủng giới KIẾN NGHỊ Mở rộng phạm vi thời gian nghiên c u phân bố Deformed wing virus Đi u tra tỉ lệ nhiễm virus qua nhi u thời điểm h c năm c c năm liên tiếp để x c đ nh đặc điểm d ch tễ học phân tử Deformed Wing virus phân bố Việt Nam 57 58 Luận văn hoàn thành Viện công nghệ sinh học Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Đồng Văn Quyền Phản biện 1: TS Đồn Thị Thanh Hương (Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam) Phản biện 2: TS Lê Văn Trường (Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam) Luận văn bảo vệ trước Hội đồng chấm luận văn Họp tại: Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam Vào hồi 14 00 ngày 16 tháng 12 năm 2015 Có thể tìm hiểu luận văn tại: - Phịng VSPT, Viện Cơng nghệ sinh học - Thư viện Viện Sinh thái Tài ngun sinh vật DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN Hà Thị Thu, Bùi Thị Thùy Dương, Nguyễn Thị Bích Nga, Lê Thanh Hịa, Đồng Văn Quyền (2015), “ Nghiên cứu đặc điểm phân tử hệ gen nguồn gốc tiến hóa Deformed wing virus (DWV) gây bệnh ong mật Việt Nam”, Tạp chí Cơng nghệ sinh học (2A): tr 589-595 ... i ong có sở để dự phòng u tr hiệu bệnh chủ động nguồn giống bệnh nhằm đem lại lợi ích cao cho người nuôi ong Xuất phát từ sở thực đ tài ? ?Đánh giá phân bố nguồn gốc tiến hóa virus gây bệnh xoăn. .. nhiên ngành nu i ong nước ta phải đối mặt với nhi u hó hăn đặc biệt tình hình bệnh d ch virus Vì x c đ nh có mặt phạm vi phân bố nguồn gốc tiến hóa virus gây bệnh c c đàn ong mật Việt Nam giúp nhà... Hình 1.4 Ong bị bênh xoăn cánh nhiễm DWV 24 1.5 Tình hình dịch bệnh phƣơng pháp phát bệnh ong mật Việt Nam Nghiên c u v d ch bệnh ong mật chủ yếu tập trung vào bệnh ấu tr ng túi SBV gây Năm 1974