2.2.1. Phương pháp phân lập
2.2.2. Phương pháp tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn.
- Cấy khuẩn lạc vi khuẩn vào 2 ml môi trường LB, lắc qua đêm 200vòng/phút ở 37oC.
- Hút 1,5 ml dịch nuôi vào ống eppendorf, ly tâm 6000 vòng/phút (4oC, 10phút).
- Loại dịch nổi thu cặn, bổ sung 150 μl dung dịch Sol I, vortex làm tan tủa.
- Bổ sung 150 μl dung dịch Sol II, đảo nhẹ (để vào đá 5 phút) - Bổ sung 150 μl dung dịch Sol III, đảo nhẹ (để vào đá 5 phút)
- Ly tâm 12000 vòng/phút, thu dịch nổi, bổ sung 1 ml cồn tuyệt đối , ủ - 20oC (3giờ ).
- Ly tâm 12000 vòng/phút (4oC, 10phút), thu cặn, làm khô tự nhiên - Bổ sung 30- 40 àl Rnase, ủ ở 37oC trong 1 giờ, bảo quản ở -200C.
2.2.3. Phương pháp tách DNA tổng số
- Lấy khuẩn lạc vi khuẩn cấy vào 2 ml môi trường LB, lắc qua đêm 200 vòng/ phút ở 370C .
- Ly tâm 6000 vòng/ phút trong 10 phút, thu tế bào, rửa lại bằng 100 μl H2O.
- Bổ sung 30 μl SDS 10 %, mix nhẹ (votex).
- Bổ sung 6 μl proteaza K, ủ 370C trong 1 giờ.
- Bổ sung 180 μl NaCl 5M, mix nhẹ bằng tay.
- Đẩy nước tới 500 μl.
- Bổ sung chloroform tỷ lệ 1:1, đảo nhẹ.
- Ly tâm 10000 vòng/ phút trong 10 phút ở 40C.
- Thu dịch nổi (3 pha: pha trên cùng chứa DNA, xác tế bào. Dung môi).
- Bổ sung chloroform/ phenol tỷ lệ 1:1, đảo nhẹ.
- Ly tâm 10000 vòng/ phút trong 10 phút, thu dịch nổi.
- Bổ sung choloroform với tỷ lệ 1:1, đảo nhẹ.
- Ly tâm thu dịch nổi.
- Bổ sung NaCOAC/ KOAC ( CH3COOK) tỷ lệ 1: 10.
- Bổ sung ethanol 100 % (2.5:1) hoặc đẩy đến 1.5 ml.
- Tủa ở -200C, 4 giờ hoặc qua đêm.
- Ly tâm 12000 vòng/ phút trong 15 phút, thu cặn.
- Rửa bằng cồn 700C (300 μl).
- Ly tâm thu cặn ở 15000 vòng/ phút trong 10 phút.
- Làm khô.
- Bổ sung 10 μl TE Rnase.
- Ủ 370C trong 1 giờ.
- Giữ ở 40 C.
2.2.4. Phương pháp tinh sạch plasmid của E. coli.
- Đẩy nước trong ống eppendorf có chứa DNA plasmid tách từ vi khuẩn lờn 500 àl.
- Bổ sung chloroform : Isoamyl alcohol (24:1). Tỷ lệ bổ sung là 1:1, đảo nhẹ.
- Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch nổi.
- Bổ sung 1/10 NaOAC hoặc KOAC (1NaOAC/10 dịch nổi).
- Đẩy lên 1,5 ml bằng cồn tuyệt đối, ủ ở -20oC trong 4giờ hoặc qua đêm.
- Ly tâm 12000 vòng/phút (4oC, 10phút), thu tủa.
- Rửa bằng 300 àl cồn 70oC, ly tõm 12000 vũng/phỳt. Thu cặn, làm khụ tự nhiên.
- Bổ sung 45 àl dH2O làm tan tủa, bảo quản ở -20oC
2.2.5. Phương pháp PCR khuếch đại gen.
*/ Thành phần phản ứng PCR cho một chủng một cặp mồi với tổng thể tớch 20àl là:
dNTPs : 2 àl Buffer : 2 àl
Primer F : 1 àl Primer R : 1 àl
Taq : 0,3 àl
DNA : 2 àl Nước khử ion : 11,7 àl
2.2.6.Phương pháp điện di trên gel agarose.
Nguyên tắc: Đây là phương pháp sử dụng để phân tích định tính cũng như định lượng của acid nucleic. Phương pháp điện di dựa vào cấu trúc của acid nucleic. Acid nucleic là đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt, khi nó ở trong điện trường nó sẽ chịu tác động của lực hút điện trường và di chuyển về phía cực dương của điện trường. Tính linh động của phân tử này phụ thuộc vào hai chỉ tiêu là trọng lượng phân tử của acid và nồng độ các chất cấu thành gel.
2.2.7. Phương pháp tách dòng gen nhe, hblA, bcet.
2.2.7.1. Gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pGEM.
Sản phẩm PCR được gắn trực tiếp vào vector tách dòng nhờ enzyme nối T4 - DNA ligase. Tùy vào nồng độ và chiều dài của đoạn gen cần nối mà có tỉ lệ trộn mẫu plasmid và đoạn gen nối (Sản phẩm PCR) khác nhau. Quá trình nối ghép được thực hiện trong điều kiện 4 - 6oC để tạo vector tái tổ hợp.
Thành phần phản ứng:
2X ligation buffer: 5 àl Vector: 1 àl T4 - DNA ligase : 1 àl Sản phẩm PCR: 3 àl
2.2.7.2. Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E.coli DH5α.
*/ Chuẩn bị tế bào khả biến:
- Cấy 1 khuẩn lạc E. coli DH5α vào môi trường LB , nuôi lắc qua đêm ở 37oC.
- Cấy chuyển 10% vào bình tam giác chứa 30 ml môi trường LB, nuôi lắc ở 37oC trong 1,5 - 2 giờ.
- Ủ đá (4oC trong 1 giờ hoặc 45 phút), thỉnh thoảng đảo nhẹ.
- Hút vào ống eppendorf 1,5 trong điều kiện vô trùng (hút trong box) - Ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút, loại bỏ dịch.
- Rửa bằng 1 ml CaCl2 0,1M, voltex đều.
- Ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút, loại bỏ dịch.
- Bổ sung 1 ml CaCl2 0,1M, voltex đều rồi ủ đá 2 giờ (15 phút đảo 1 lần).
- Ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút (thu tế bào).
- Bổ sung 1 - 1,5 ml CaCl2 0,1M, voltex nhẹ, ủ đá 1 giờ (15 phút đảo 1 lần).
- Ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút, thu tế bào.
- Bổ sung 60 àl
- Hỳt 5 àl sản phẩm của phản ứng nối ghộp gen vào dịch tế bào khả biến.
- Ủ đá 30 phút (tạo cho hỗn hợp có một nhiệt độ thấp nhất định và tạo điều kiện cho vector tái tổ hợp tiếp cận tế bào một cách đồng đều).
- Sốc nhiệt 42oC trong 60 - 90 giây. Chuyển vào đá 2 phút.
- Bổ sung 200 - 300 àl mụi trường LB, lắc ở 37oC trong 1 - 1,5 giờ.
- Trang 100 àl vào đĩa peptri chứa mụi trường LBA cú bổ sung khỏng sinh Ampicillin và X-gal. Nuôi ở 37oC từ 14 - 16 giờ.
2.2.8. Phương pháp xác định trình tự nucleotit của đoạn gen đã tách dòng.
Tiến hành xác định trình tự theo phương pháp của Sanger và cộng sự, dựa vào sự tổng hợp các mạch bổ sung cho mạch đơn DNA cần xác định.
Dưới sự xúc tác của enzyme DNA - polymerase.
Đặc trưng của phương pháp là ngoài việc sử dụng 4 nucleotide thông
thường, nó còn sử dụng thêm bốn loại dideoxynucleotide (ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP) đã được đánh dấu bằng huỳnh quang. Đây là những dideoxynucleotide có nhóm -OH ở đầu 3’ được thay bằng -H. Điều này khiến các dideoxynucleotide không còn khả năng hình thành các đầu nối phosphodieste và do đó làm ngừng quá trình tổng hợp.
Điện di sản phẩm PCR trên gel polyacrylamide có bổ sung ure để làm tăng độ phân giải của gen. Dùng tia laze quét để phát hiện dideoxynucleotid đánh dấu.
Xử lý kết quả bằng phần mềm PC/GENE, sau đó tiến hành so sánh trình tự gen đã tách dòng với các trình tự đã công bố trong Ngân hàng Gen Quốc tế.