Nghiên cứu tách chiết và đặc tính sinh dược học của một số hợp chất tự nhiên từ cây hồng bì (Clausena lansium Lour.) (LV00294)

Nghiên cứu tác dụng của các phân đoạn dịch chiết từ vỏ quả Hồng Bì đến trọng lượng và một số chỉ số hoá sinh máu của chuột BPTN .... Phương pháp nghiên cứu tác dụng hạ glucose huyết của

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan những gì trình bày trong luận văn là của riêng tôi, dưới sự hướng dẫn của GS TS Đỗ Ngọc Liên và không trùng lặp với bất kì một nghiên cứu nào có trước

Hà Nội, ngày 10 tháng 10 năm

2009

Học viên

Hoàng Thị Hương Quỳnh

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2



HOÀNG THỊ HƯƠNG QUỲNH

NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT VÀ ĐẶC TÍNH SINH DƯỢC HỌC CỦA MỘT SỐ

HỢP CHẤT TỰ NHIÊN TỪ CÂY HỒNG BÌ

(Clausena lansium Lour.)

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN 5

1.1 Các hợp chất thứ sinh từ thực vật 5

1.1.1 Các hợp chất phenolic từ thực vật 5

1.1.2 Alkaloid thực vật 10

1.1.3 Terpen thực vât 11

1.2 Bệnh béo phì (Obesity) 11

1.2.1 Khái niệm và phân loại béo phì 11

1.2.2 Thực trạng béo phì thế giới và Việt Nam 12

1.2.3 Tác hại và nguy cơ bệnh béo phì 12

1.2.4 Nguyên nhân, giải pháp phòng, điều trị béo phì 13

1.2.5 Rối loạn trao đổi lipid máu 14

1.2.6 Mối quan hệ giữa béo phì và đái tháo đường 15

1.3 Bệnh đái tháo đường (Diabetse mellitus) 16

1.3.1 Khái niệm và phân loại 16

1.3.2 Thực trạng đái tháo đường thế giới và Việt Nam 18

1.3.3 Tác hại và biến chứng 18

1.3.4 Phòng và điều trị bệnh đái tháo đường 19

1.3.5 Đái tháo đường với Y học cổ truyền 19

1.3.6 Chuyển hoá glucose và điều hoà glucose huyết 19

1.4 Cây Hồng Bì (Clausena lansium Lour.) 20

1.4.1 Đặc điểm thực vật học 21

1.4.2 Thành phần hoá học 22

1.4.3 Sử dụng và hoạt tính sinh học 22

1.4.4 Các nghiên cứu về cây Hồng Bì (Clausena lansium Lour) có tác dụng giảm béo phì và hạ glucose huyết 23

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Đối tượng nghiên cứu 23

2.1.1 Mẫu thực vật 23

2.1.2 Mẫu động vật 23

2.1.3 Dụng cụ và hoá chất thí nghiệm 23

2.2 Phương pháp nghiên cứu 24

2.2.1 Phương pháp tách chiết mẫu nghiên cứu 24

2.2.2 Phương pháp khảo sát thành phần hoá học của cây Hồng Bì 24

2.2.3 Nghiên cứu tác dụng của các phân đoạn dịch chiết từ vỏ quả Hồng Bì đến trọng lượng và một số chỉ số hoá sinh máu của chuột BPTN 28

2.2.4 Phương pháp nghiên cứu tác dụng hạ glucose huyết của các phân đoạn dịch chiết từ vỏ quả Hồng Bì trên mô hình chuột ĐTĐ type 2 thực nghiệm 30

2.2.5 Một số kĩ thuật phân tích hoá sinh 31

2.2.5.1 Phương pháp định lượng glucose huyết 31

2.2.5.2 Định lượng insulin huyết thanh chuột 31

2.2.5.3 Phương pháp định lượng một số chỉ số lipid trong huyết thanh 32

2.2.5.4 Phương pháp xác định hoạt độ một số enzyme liên quan đến quá trình trao đổi carbohydrate ở chuột đái tháo đường 33

2.2.6 Phương pháp xử lý số liệu thống kê 34

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35

3.1 Quy trình tách chiết các phân đoạn từ vỏ quả Hồng Bì 35

3.2 Kết quả khảo sát thành phần các hợp chất tự nhiên có trong các phân đoạn dịch chiết từ vỏ quả Hồng Bì 36

3.2.1 Định tính một số hợp chất tự nhiên có trong vỏ quả Hồng Bì 36

3.2.2 Hàm lượng polyphenol tổng số 37

3.2.3 Kết quả sắc kí lớp mỏng 38

3.3 Kết quả xác định liều độc cấp 40

3.4 Tác dụng của các phân đoạn dịch chiết từ vỏ quả Hồng Bì trên mô hình chuột BPTN 41

3.4.1 Kết quả xây dựng mô hình chuột béo phì thực nghiệm 41

3.4.2 Tác dụng của các phân đoạn dịch chiết từ vỏ quả Hồng Bì đến trọng lượng và một số chỉ số lipid huyết của chuột 44

3.4.2.1 Tác dụng đến trọng lượng chuột 44

3.4.2.2 Tác dụng đến các chỉ số lipid của chuột béo phì 46

3.5 Tác dụng hạ đường huyết của vỏ quả Hồng Bì trên mô hình chuột ĐTĐ type 2 50

3.5.1 Kết quả tạo mô hình chuột ĐTĐ type 2 thực nghiệm 50

3.5.2 Tác dụng của phân đoạn dịch chiết từ vỏ quả Hồng Bì đến nồng độ glucose huyết của chuột ĐTĐ 53

3.5.3 Tác dụng của các phân đoạn dịch chiết từ vỏ quả Hồng Bì đến hàm lượng insulin huyết thanh 55

3.6 Tác dụng của các phân đoạn dịch chiết từ vỏ quả Hồng Bì đến một số yếu tố liên quan đến chuyển hoá glucose 57

3.6.1 Ảnh hưởng đến hàm lượng glycogen của gan 58

3.6.2 Ảnh hưởng đến hoạt độ enzyme hexokinase và glucose-6-phosphatase 59

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

BPTN : Béo phì thực nghiệm

BMI : Chỉ số khối cơ thể (Body Mass Index)

BuOH : Cao buthanol

CH2Cl2 : Cao dichlomethan

ĐTĐ : Đái tháo đường

ELISA : Enzyme linked immunosorbent assay

EtOAc : Cao ethylacetate

G6Pase : Glucose -6- phosphatase

HK : Hexokinase

HFD : Ăn thức ăn chứa chất béo cao

HDL-c : Lipoprotein có tỷ trọng cao (High Density Lipoprotein) LDL-c : Lipoprotein có tỷ trọng thấp (Low Density Lipoprotein)

LD50 : Liều độc làm chết 50% số chuột

MeOH : Cao methanol

Met : Thuốc metformin

ND : Ăn thức ăn chuẩn, bình thường

DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Phân loại BMI của người trưởng thành Châu Âu và Châu Á

Bảng 1.2 Các tiêu chí để chuẩn đoán ĐTĐ theo WTO

Bảng 2.1 Bảng các phản ứng định tính đặc trưng

Bảng 2.2 Kết quả xây dựng đường chuẩn acid gallic

Bảng 2.3 Thành phần thức ăn giàu lipid

Bảng 2.4 Mô hình nghiên cứu khả năng giảm béo của các phân đoạn dịch chiết từ

vỏ quả Hồng Bì

Bảng 2.5 Mô hình nghiên cứu khả năng hạ glucose huyết của các phân đoạn dịch chiết từ vỏ quả Hồng Bì

Bảng 3.1 Hiệu suất chiết rút các phân đoạn từ vỏ Hồng Bì

Bảng 3.2 Kết quả định tính các phân đoạn dịch chiết vỏ quả Hồng Bì

Bảng 3.3 Hàm lượng polyphenol tổng số trong các phân đoạn dịch chiết từ vỏ quả Hồng Bì

Bảng 3.4 Đặc điểm sắc kí đồ các phân đoạn dịch chiết vỏ quả Hồng Bì

Bảng 3.5 Kết quả thử độc tính theo đường uống

Bảng 3.6 Trọng lượng trung bình của chuột nuôi bằng hai chế độ dinh dưỡng Bảng 3.7 So sánh một số chỉ số hóa sinh giữa chuột nuôi thường và nuôi BPTN Bảng 3.8 Trọng lượng trung bình các lô chuột thí nghiệm trước và sau khi điều trị

Bảng 3.13 Hàm lượng glycogen gan chuột sau 21 ngày điều trị bằng các phân đoạn dịch chiết

Bảng 3.14 Hoạt độ enzyme hexokinase và glucose-6-phosphatase của các lô chuột thí nghiệm sau 21 ngày điều trị

DANH MỤC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ

Hình 2.1 Cây Hồng Bì (Clausena lansium Lour.) và cành mang quả

Hình 2.2 Đồ thị đường chuẩn acid gallic

Hình 3.1 Sơ đồ quy trình tách chiết các hợp chất tự nhiên trong vỏ quả Hồng Bì Hình 3.2 Sắc kí đồ các phân đoạn dịch chiết từ vỏ quả Hồng Bì

Hình 3.3 Biểu đồ biểu diễn sự tăng trọng của các nhóm chuột với 2 chế độ dinh dưỡng khác nhau trong vòng 6 tuần

Hình 3.4 Biểu đồ so sánh một số chỉ số hóa sinh giữa các lô chuột thí nghiệm Hình 3.5 Biểu đồ trọng lượng trung bình của các lô chuột trước và sau điều trị 21 ngày Hình 3 6 Tác động của các phân đoạn dịch chiết đến một số chỉ số trao đổi lipid ở chuột béo phì thực nghiệm

Hình 3.7 Nồng độ glucose huyết lúc đói của các lô chuột thí nghiệm trước và sau khi tiêm 72 giờ

Hình 3.8 Kết quả nồng độ glucose huyết lúc đói của các lô chuột sau 21 ngày điều trị Hình 3.9 Ảnh hưởng của các phân đoạn dịch chiết đến nồng độ insulin huyết thanh của chuột sau 21 ngày điều trị

Hình 3.10 Hàm lượng glycogen gan (mg/g gan) sau điều tri của các lô chuột

Hình 3.11 Hoạt độ enzyme hexokinase và glucose-6-phosphatase của các lô chuột thí nghiệm sau 21 ngày điều trị

Hình 3 12 Tóm tắt cơ chế tác dụng của các phân đoạn dịch chiết đến khả năng hạ glucose huyết

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan những gì trình bày trong luận văn là của riêng tôi, dưới sự hướng dẫn của GS TS Đỗ Ngọc Liên và không trùng lặp với bất kì một nghiên cứu nào có trước

Hà Nội, ngày 10 tháng 10 năm

Tôi xin trân trọng cảm ơn TS Đào Xuân Tân và các cán bộ trung tâm hỗ trợ nghiên cứu khoa học và chuyển giao công nghệ trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, các cán bộ thuộc Trung tâm nghiên cứu khoa học sự sống trường Đại học Khoa học

Tự nhiên, Phòng hóa sinh Bệnh viện 108 đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tiến hành đề tài này

Nhân dịp này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, Phòng đào tạo sau đại học, các thầy cô giáo trong khoa Sinh học trường Đại học Sư phạm Hà Nội

2 đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Cuối cùng tôi cũng xin chân thành cảm ơn các anh chị em học viên cao học, sinh viên, gia đình và người thân đã động viên, khích lệ, giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này

Hà Nội, ngày 10 tháng 10 năm 2009

Học viên Hoàng Thị Hương Quỳnh

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Nhịp sống công nghiệp hiện đại, thói quen dinh dưỡng mất cân bằng…là nguyên nhân của nhiều căn bệnh nguy hiểm như béo phì (Obesity), đái tháo đường (Diabetse mellitus), … Ngày nay theo thống kê của tổ chức quốc tế theo dõi bệnh béo phì (International Obesity Task Force – IOTF) thế giới có khoảng 1,7 tỉ người thừa cân béo phì [3], [4] và đang có xu hướng trẻ hóa Bệnh béo phì thường gặp ở các quốc gia phát triển ví dụ như Mỹ có trên 30% người trưởng thành mắc bệnh, Thái Lan có 20%, Hàn Quốc 22%, Singapore 31% [3], [4], [13], [34] và đang dần xuất hiện ở cả các nước đang phát triển Tại Việt Nam theo thống kê mới nhất của Viện Dinh dưỡng Quốc gia (2007) tỉ lệ người trưởng thành từ 25- 64 tuổi

có tình trạng thừa cân béo phì là 16,8%, ở trẻ em là 16,3% và còn tiếp tục gia tăng [3], [31] Ngày 31/11/2007 Bộ Y tế đã kí quyết định thành lập Trung tâm Dinh dưỡng và Kiểm soát béo phì thuộc Viện Dinh dưỡng, chính thức tuyên chiến với bệnh béo phì [13]

Đái tháo đường (ĐTĐ) là một bệnh nội tiết phổ biến nhất, hiện trên thế giới

có trên 200 triệu người mắc bệnh ĐTĐ Nhìn chung khoảng 4% người trưởng thành được chẩn đoán ĐTĐ vào năm 1985 và ước tính con số này sẽ tăng lên 5,4% vào năm 2025 [4], [18], [37] Sự gia tăng nhanh chóng tỉ lệ người mắc bệnh làm cho ĐTĐ trở thành một vấn đề sức khỏe lớn vì bệnh có tỉ lệ mắc, chết trầm trọng và quá trình trị liệu lâu dài, đặc biệt là ĐTĐ type 2 một trong những bệnh phổ biến nhất trong bệnh ĐTĐ

Nếu béo phì ảnh hưởng trực tiếp tới sức khỏe, thẩm mỹ và tiềm ẩn nhiều nguy cơ bệnh tật khác như ĐTĐ type 2 (diabetes type 2), bệnh tim mạch, rối loạn lipid máu, sỏi túi mật, gan nhiễm mỡ, viêm khớp mãn tính, đột quỵ … thì ĐTĐ có thể mang đến nhiều biến chứng nguy hiểm hơn nữa như: biến chứng võng mạc, suy thận, biến chứng mạch máu lớn, tổn thương bàn chân dẫn đến cắt cụt …Vì vậy đại

đa số người bệnh đều có nhu cầu chữa bệnh một cách an toàn Mỗi năm nước Mỹ

đã phải chi hàng tỉ đô la cho điều trị béo phì cũng như ĐTĐ bằng các thuốc do tổ chức an toàn thực phẩm và dược phẩm Mỹ phê chuẩn (Food and Drug Aministration - FDA) như: Metformin, Orlistat, Sibutramin, Ephedrin, Fenfluramin

… Song hầu hết các thuốc này đều có nguồn gốc hóa học và thường gây tác dụng phụ Trước tình hình đó ủy ban chuyên gia của WHO đã khuyến nghị nên sử dụng các thuốc có nguồn gốc thảo dược sẵn có, giá thành rẻ và ít độc tính Việc nghiên cứu, khảo sát thành phần hóa học và tác dụng dược lý của các loài thảo mộc trên thế giới nói chung, Việt Nam nói riêng đã và đang phát triển, mang một tầm quan trọng đặc biệt

Dựa trên cơ sở các nghiên cứu về tác dụng dược lý của các cây thuộc họ Cam quýt (Rutaceae) [16], [32], chi Clausena [26], [27], [66] nói chung và một số

nghiên cứu trên đối tượng Clausena lansium [33], [50] nói riêng, chúng tôi quyết định chọn đề tài : “Nghiên cứu tách chiết và đặc tính sinh dược học của một số hợp chất tự nhiên từ cây Hồng Bì ( Clausena lansium Lour.)”

2 Mục đích nghiên cứu

Luận văn tập trung nghiên cứu thành phần hóa học của cây Hồng Bì

(Clausena lansium Lour.) và tác động của nó tới trọng lượng và một số chỉ số hóa

sinh, nhằm tạo cơ sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực tìm kiếm thuốc và giải thích tác dụng chữa bệnh của cây thuốc y học cổ truyền Mục tiêu chính của luận văn:

1 Tìm ra quy trình tách chiết và khảo sát thành phần các hợp chất tự nhiên từ mẫu thực vật

2 Đánh giá tác dụng sinh dược học của một số phân đoạn dịch chiết từ mẫu thực vật trên mô hình chuột béo phì và ĐTĐ thực nghiệm

3 Nhiệm vụ nghiên cứu

Dựa trên mục tiêu nghiên cứu chúng tôi xác định các nhiệm vụ cụ thể của luận văn như sau:

1 Đưa ra quy trình tách chiết các hợp chất từ cây Hồng Bì (Clausena lansium Lour.)

2 Khảo sát thành phần các hợp chất tự nhiên có trong vỏ quả Hồng Bì

(Clausena lansium Lour.)

3 Nghiên cứu tác dụng các phân đoạn dịch chiết vỏ quả Hồng Bì lên trọng lượng và một số chỉ số lipid máu trên mô hình chuột béo phì thực nghiệm (BPTN)

4 Nghiên cứu khả năng điều hòa đường huyết của các phân đoạn dịch chiết

vỏ quả Hồng Bì trên mô hình chuột ĐTĐ mô phỏng type 2 và xác định ảnh hưởng các phân đoạn đến hoạt độ một số enzyme trao đổi glucid

4 Đóng góp mới của đề tài

 Đưa ra quy trình tách chiết phân đoạn các hợp chất tự nhiên từ vỏ quả

Hồng Bì (Clausena lansium Lour.)

 Đánh giá được tác dụng hạ thấp lipid máu của các phân đoạn dịch chiết từ vỏ quả Hồng Bì ở chuột BPTN

 Đánh giá được khả năng hạ glucose huyết của các phân đoạn dịch chiết lên mô hình chuột ĐTĐ mô phỏng type 2 thông qua chỉ số glucose huyết

và hoạt độ một số enzyme trao đổi glucid

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Các chất thứ sinh thực vật ( plant secondary metabolites)

Ở thực vật, ngoài protein, saccarid, lipid, vitamin … còn có những chất khác

có vai trò quan trọng trong đổi chất của cây được gọi là các chất thực vật thứ sinh (plant secondary metabolites) Căn cứ vào tính chất hóa học, các hợp chất thực vật thứ sinh được chia thành một số nhóm chính như: nhóm phenolic, nhóm terpen và nhóm alkaloid Nhiều công trình nghiên cứu gần đây đã cho thấy các hợp chất polyphenol (thuộc nhóm hợp chất phenolic) ngày càng ứng dụng rộng rãi trong điều trị một số bệnh nan y như: ung thư, béo phì, tiểu đường …

1.1.1 Các hợp chất phenolic từ thực vật

Hợp chất phenolic là nhóm các chất khác nhau rất phổ biến trong thực vật Đặc điểm chung của chúng là trong phân tử có vòng thơm (benzene) mang một, hai hay ba nhóm hydroxyl (-OH) gắn trực tiếp vào vòng benzene Dựa vào thành phần

và cấu trúc người ta chia hợp chất phenolic thành 3 nhóm nhỏ [39]:

 Nhóm hợp chất phenolic đơn giản: Trong phân tử chỉ có một vòng benzene

và một vài nhóm hydroxyl Tùy thuộc vào số lượng nhóm OH mà chúng được gọi là các monophenol (phenol), diphenol (pyrocatechin, hydroquynone…), triphenol (pyrogalol, oxyhydroquynol…)

 Nhóm hợp chất phenolic phức tạp: Trong thành phần cấu trúc phân tử của

chúng ngoài vòng thơm benzene (C6) chúng còn có dị vòng, mạch nhánh Đại diện nhóm này có axid cyamic, axid ceramic

 Nhóm hợp chất phenolic đa vòng: là nhóm đa dạng nhất trong các hợp chất

phenol, có cấu trúc phức tạp do sự liên kết hoặc trùng hợp của các đơn phân Ngoài gốc phenol còn có các nhóm phụ dị vòng mạch nhánh hoặc đa vòng Nhóm này có flavonoid, tannin và coumarin

Hợp chất phenolic được hình thành một cách dễ dàng trong tất cả các cơ quan thực vật từ những sản phẩm đường phân và chu trình pentose phosphate qua

acid sikimic hay theo con đường acetate manolate qua acetyl – SCoA Trong số các chất polyphenol tự nhiên, flavonoid là nhóm chất quan trọng nhất vì chúng phổ biến

ở hầu hết các loài thực vật và mang nhiều hoạt tính sinh dược học có giá trị

1.1.1.1 Flavonoid

Falvonoid là những sắc tố, phần lớn có màu vàng (flavus- nghĩa là màu vàng) Tuy nhiên một số sắc tố khác như xanh, đỏ, tím,…hoặc không màu cũng xếp vào nhóm flavonoid vì chúng có chung đặc điểm cấu tạo

* Cấu tạo hóa học và phân loại

Về cấu tạo hóa học, khung cacbon của flavonoid là C6 -C3 -C6, gồm 15 nguyên tử cacbon, hai vòng benzene A và B nối với nhau qua dị vòng C, trong đó A kết hợp với C tạo khung chroman

9 10 8

5

7 6

2 3

O

1

4

1' 5' 6' 4'

3' 2'

B

Flavan (2-phenyl chroman ) Tùy theo mức độ oxy hóa vòng pyran, sự có mặt hay không có mặt của nối đôi giữa C2 với C3 và nhóm cacbonyl ở C4 mà có thể phân biệt flavonoid thành các nhóm phụ sau: Flavon và flavonol, flavanol (đihidro flavon), chalcol, aurol, leucoantoxianidin, catechin, isoflavonoid, rotenoid và neoflavonoid

* Hoạt tính sinh học của flavonoid

Tác dụng chống oxy hóa (antioxidant)

Flavonoid có khả năng kìm hãm các quá trình oxy hóa dây truyền gây ra bởi các gốc tự do hoạt động Tuy nhiên hoạt tính này mạnh hay yếu còn phụ thuộc vào đặc điểm của từng flavonoid cụ thể

Gốc tự do sinh ra trong quá trình sinh lý bình thường của cơ thể hay do tác động bên ngoài là nguyên nhân gây phá hủy ADN, protein, lipid làm phát sinh nhiều bệnh tật nguy hiểm và sự lão hóa cho cơ thể Flavonoid có bản chất polyphenol nên dễ dàng biến đổi dưới tác động của các enzyme có trong tế bào

động thực vật Đặc biệt flavonoid có nhóm hyđroxyl ở vị trí ortho dễ dàng bị oxy hóa bởi xúc tác của enzyme polyphenoloxydase và peroxydase tạo semiquynol hoặc quynol [32] Đây là các gốc tự do bền vững chúng có thể nhận điện tử và trở thành dạng hidroquynol Bởi vậy các chất này có khả năng phản ứng với các gốc tự do hoạt động và loại chúng ra khỏi cơ thể Quá trình được tóm tắt qua sơ đồ sau:

O2 + Flavonoid (khử) Flavonoid (oxy hoá)

(Hiđroquynol) (semiquynol hoặc quynol) Ngoài ra flavonoid còn có tác dụng bảo vệ các hệ thống sinh học nhờ khả năng tạo phức với các kim loại chuyển tiếp như Fe+2, Cu+2 … hoạt hóa enzyme chống oxy hóa và ức chế sự oxy hóa

Tác dụng thay đổi hoạt độ các enzyme

Hợp chất phenol nói chung và flavonoid nói riêng có khả năng tương tác với protein nhờ tính chất này mà các flavonoid có thể làm thay đổi hoạt tính enzyme Năm 1929, A.I Oparin và A.L Kursanop đã phát hiện ra các flavonoid có khả năng

ức chế nhiều loại enzyme nhưng tính chất này không hoàn toàn đặc hiệu Đây chính

là cơ sở hóa sinh để định hướng cho việc sử dụng flavonoid thiên nhiên vào lĩnh vực sinh – y học phục vụ sức khỏe và đời sống con người [32]

Tác dụng kháng khuẩn

Nhiều công trình nghiên cứu trong nước và thế giới đã chứng tỏ tác dụng chống viêm nhiễm (anti-inflamatory) chống vi khuẩn (anti-bacterial) và virut (antiviral) [5], [8]

Tác dụng làm bền thành mạch máu

Các dẫn xuất đường của flavonoid có hoạt tính của vitamin P như rutin, hesperidin… có tác dụng làm tăng sức bền và tính đàn hồi của thành mao mạch, giảm sức thẩm thấu của hồng cầu qua thành mao mạch Hoạt tính này được ứng dụng trong chữa trị các rối loạn chức năng tĩnh mạch, giãn hay suy yếu tĩnh mạch, trĩ, rối loạn tuần hoàn tĩnh mạch [18]

Polyphenoloxydase Peroxydase

Tác dụng giảm béo phì và lipid máu

Theo kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học Nhật cho thấy khi chuột béo

phì được điều trị bằng dịch chiết giàu flavonoid từ lá Bằng lăng ( Lagerstroemia specciosa L.) thì có trọng lượng giảm đáng kể (~ 10% ) [72] Thí nghiệm tương tự với flavonoid từ lá Kim ngân (Lonicera japonica Thunb.) đối với chuột cống trắng

uống cholesterol cũng cho thấy có tác dụng làm giảm các chỉ số cholesterol, triglycerid, LDL-c đồng thời tăng HDL-c [35] Naringin (C17H32O4) và hesperidin (C28H34O15) là những flavonoid có hàm lượng cao trên họ cam chanh (Rutaceae) đã được nhiều nhà nghiên cứu chiết xuất và thử tác dụng trên mô hình chuột béo phì cho kết quả tốt trong việc làm hạ các chỉ số lipid máu [36], [39]

Tác dụng hạ glucose huyết

O

O

OH OH

OH OH

CH3O

O

O OH O

O O

O

OH

OH

OH

Một số flavonoid được tách chiết từ nguyên liệu thực vật đã được chứng minh là có tác dụng điều hòa glucose huyết như: Quercetin có trong Đỗ trọng

(Eucommia ulmoides Oliver.) [63], Hesperidin và Naringin có trong các cây thuộc

họ Rutaceae [44], Genistein và Daidzein có trong Đậu nành (Glycine max L.) [12], Myricetin có trong cây Vông vang (Abelmoschus moschatus) [12]…

1.1.1.2.Tannin thực vật

Tannin là các hợp chất phenolic có trọng lượng phân tử cao có chứa các nhóm hydroxyl và các nhóm chức khác như có khả năng tạo phức với protein và các phân tử lớn khác trong điều kiện môi trường đặc biệt Tannin thường là các hợp chất vô định hình, có màu trắng, màu vàng nhạt hoặc gần như không màu, có hoạt tính quang học, vị chát, dễ bị oxy hóa khi đun nóng hay khi để ngoài ánh sáng

Tác dụng sinh học của tannin là chất bảo vệ cây trồng trước sự tấn công của

vi sinh vật gây bệnh và côn trùng ăn lá [43], [58] Trong y học, tannin được sử dụng làm thuốc cầm máu, chữa đi ngoài, ngộ độc kim loại nặng, chữa trĩ, viêm miệng, viêm xoang, điều trị cao huyết áp và đột quỵ [2]

O O

OH

OH

OH OH

O O

OH

OH

OH OH

1.1.1.3 Hợp chất coumarin

Coumarin là dẫn chất của α- purone có cấu trúc C6- C3 dị vòng chứa oxy Coumarin kết tinh không màu hoặc màu vàng nhạt, vị đắng, cay, có mùi thơm [30] Tính chất hóa học đặc trưng là dễ dàng kết hợp với đường glucose tạo thành glycosid dễ tan trong nước

Hiện nay chúng ta biết đến 1500 hợp chất coumarin khác nhau khi nghiên cứu 800 loài thực vật Ta cũng dễ dàng tìm thấy coumarin trong tất cả các bộ phận khác nhau của cây như: áo hạt, quả, hoa, rễ, lá, thân…Coumarin cũng có vai trò là một nhóm chất phòng thủ hóa học hữu hiệu chống lại vi khuẩn và tác nhân có hại của môi trường Tuy nhiên cho tới nay con đường tổng hợp coumarin vẫn chưa hoàn toàn sáng tỏ [39]

O O

Coumarin

Coumarin sử dụng trong đời sống ngày như làm nước hoa, hương liệu, làm chất chống đông máu và chất diệt loài gặm nhấm Trong y học dẫn xuất của coumarin có tác dụng chống co thắt, giãn nở động mạch vành, làm bền và bảo vệ thành mạch, ngăn cản đột quỵ [39] Một số coumarin khác có tác dụng kháng khuẩn kháng nấm, kháng khối u, trừ giun sán và giảm đau

1.1.2 Alkaloid thực vật

Alkaloid là hợp chất chứa nitơ, đa số có nhân dị vòng và có tính kiềm, thường gặp ở thực vật và động vật Đa số các alkaloid thành phần chứa oxy ở thể rắn (cafein), không có oxy thường ở thể lỏng dễ bay hơi (nicotin) Alkaloid thường không có màu, không mùi và vị đắng Một số alkaloid có màu vàng như berberin, palmitin Các alkaloid ở dạng base thường không tan trong nước [39]

N

N N

N

CH3

CH3C

Alkaloid có tính kiềm yếu, do các mạch cacbon chứa nitơ quyết định Chúng

có thể liên kết với kim loại nặng tạo phức và phản ứng với một số thuốc thử đặc trưng như: Bouchardat (kết tủa màu nâu sẫm), Vans-Mayer (kết tủa trắng ánh vàng) hay Dragendroff (màu da cam, nâu đỏ)

Loài người có lịch sử hơn 2000 năm nghiên cứu và sử dụng alkaloid Cho tới nay có hơn 12000 alkaloid khác nhau được phân lập Chúng không phổ biến trong

tự nhiên mà chỉ tập trung ở một số loài thực vật có hoa (khoảng 20% loài thực vật

có hoa có khả năng sinh alkaloid) Với cây trồng alkaloid là chất hóa học bảo vệ cây trồng trước côn trùng và sâu bọ ăn lá [39] Trong y học nhiều thuốc chữa bệnh có thành phần alkaloid như thuốc gây kích thích hoặc ức chế hệ thần kinh trung ương, thuốc điều hòa huyết áp, chữa rối loạn nhịp tim… Một số nghiên cứu gần đây cho thấy các alkaloid chiết từ thực vật cũng có tác dụng hạ glucose huyết như: Berberin

(Tinospora cordifolia, Coptis sinensis), Casuarine 6-O-α- glucoside (Syzygium malaccense)…

1.1.3 Terpen thực vật

Terpen là nhóm hydrocacbon thực vật lớn và đa dạng nhất, được hình thành

từ quá trình polyme hoá các tiểu đơn vị isopren 5-carbon (C5H8), có công thức cấu tạo chung là (C5H8)n Trong thực vật terpen được tổng hợp thông qua con đường trao đổi chất acetate/mevalonate hoặc con đường glyceraldehyde 3-phosphate/pyruvate Hầu hết các terpen đều thuộc nhóm hydrocarbon, tuy nhiên chúng có thể bị khử hoặc bị oxy hóa để hình thành các hợp chất terpenoid khác nhau như alcohol, ketone, acid và aldehyd Vì vậy, một số tác giả sử dụng thuật ngữ

“terpenes” để chỉ chung một nhóm lớn các hợp chất bao gồm cả terpen và terpenoid Terpen là thành phần chính của các loại tinh dầu, được dùng trong công nghệ hương mỹ phẩm, thực phẩm và dược phẩm Những terpen bậc cao thường là các chất có hoạt tính sinh học

1.2 Bệnh béo phì (Obesity)

1.2.1 Khái niệm và phân loại béo phì

Tổ chức y tế thế giới (WHO) định nghĩa béo phì (obesity) là tình trạng tích lũy mỡ quá mức và không bình thường tại một vùng hay toàn bộ cơ thể gây ảnh hưởng tới sức khỏe

Để nhận định tình trạng béo gầy WHO thường dùng chỉ số khối cơ thể (BMI- Body Mass Index) Chỉ số khối cơ thể được tính theo công thức như sau:

Trong đó : W: Khối lượng (kg ) H:Chiều cao (m )

Bảng 1.1 Phân loại BMI của người trưởng thành Châu Âu và Châu Á [3]

Mức độ thể trọng Người trưởng thành

Châu Âu

Người trưởng thành Châu Á

1.2.2 Thực trạng béo phì thế giới và Việt Nam

Theo tổ chức y tế thế giới (WHO) hiện nay số người béo phì đã lên tới 1,7 tỉ người [4], không chỉ gặp nhiều ở các quốc gia phát triển mà còn gặp cả ở các quốc gia đang phát triển Mỹ là nước có số dân mắc bệnh cao nhất thế giới, khoảng 60 triệu người (chiếm 30% dân số), tăng gấp 3 lần so với điều tra năm 1991 Ở Châu

Âu, Anh là quốc gia đứng đầu bảng với 23% dân số Tại Châu Á tỉ lệ thừa cân béo phì ở một số nước như sau: Thái Lan: 3,5%, Philipin 4,27%, Malaysia 3,01%, Nhật 3%, Trung Quốc 2%, Hồng Kông 3%

Tại Việt Nam, theo tiêu chuẩn cho người Châu Á, số người thừa cân béo phì cũng tăng theo thời gian Năm 1991 theo điều tra của Lê Huy Liệu và cộng sự thì tỉ

lệ thừa cân mắc bệnh béo phì nói chung tại Hà Nội là 1,1% Đến năm 2000 con số này đã là 2,62% tăng gần 2,5 lần trong vòng 10 năm (điều tra của Lê Văn Hải)

Năm 2007, Viện Dinh dưỡng Quốc gia điều tra trên đối tượng người trưởng thành 25 - 64 tuổi cho thấy tỉ lệ thừa cân béo phì là 16,8% và còn có xu hướng tăng lên Theo Viện trưởng TS Nguyễn Công Khẩn thì tỉ lệ này ở thành thị lớn hơn nông thôn, ở nữ giới cao hơn nam giới Trẻ em Việt Nam cũng có 16,3% mắc thừa cân béo phì [13] Hà Nội có 4,9% trẻ 4 - 6 tuổi mắc bệnh, Thành phố Hồ Chí Minh 6% trẻ duới 5 tuổi và 22,7% học sinh tiểu học cũng rơi vào tình trạng này [59] Trước tình hình đó bộ y tế đã kí quyết định thành lập “Trung tâm phục hồi dinh dưỡng và kiểm soát béo phì” trực thuộc Viện Dinh dưỡng, chính thức tuyên chiến với bệnh béo phì

1.2.3.Tác hại và nguy cơ của bệnh béo phì

Chứng thừa cân và bệnh béo phì gây nhiều tác hại cho cuộc sống con người như mất thoải mái trong sinh hoạt, giảm hiệu suất lao động khối lượng cơ thể nặng

 Rối loạn lipid máu: Tình trạng này rất hay gặp ở người béo bụng và

có biểu hiện đặc trưng là tăng triglycerid và lipid có hại (LDL-c), giảm lipid

có lợi (HDL-c)

 Tiểu đường: béo phì toàn thân có nguy cơ mắc ĐTĐ type 2

 Đột quỵ: Những người có BMI > 30 dễ bị tử vong do bệnh liên quan đến mạch máu não

 Ngoài ra béo phì còn làm gia tăng nguy cơ của nhiều bệnh khác: xấu

đi tình trạng rối loạn tiền mãn kinh ở phụ nữ, suy giảm chức năng hô hấp, rối loạn hoạt động cơ xương, ung thư, sỏi mật và các vấn đề bệnh lý tâm thần khác… [4], [13], [37]

1.2.4 Nguyên nhân và giải pháp phòng, điều trị béo phì

Nguyên nhân chính dẫn đến thừa cân béo phì là do khẩu phần và thói quen dinh dưỡng không hợp lý, hoạt động thể lực kém dẫn đến năng lượng hấp thụ vào cơ thể vượt quá mức cần thiết và tích lũy dưới dạng mỡ Ngoài ra một số bệnh lý nội tiết như: Hội chứng Cushing (do hormone cortisosteroid trong cơ thể tăng quá cao), bệnh suy tuyến giáp trạng, bệnh trứng đa nang hoặc có chứa gen béo phì di truyền

Để phòng bệnh béo phì có hiệu quả, mỗi cá nhân cần nâng cao nhận thức về dinh dưỡng và hoạt động thể lực Trên phạm vi xã hội, việc phòng bệnh cần tập trung vào nhóm có nguy cơ cao mắc bệnh này

Điều trị cân thừa cân béo phì dựa trên nguyên tắc kết hợp giữa chế độ ăn uống, luyện tập và dùng thuốc Trong đó thuốc và phẫu thuật chỉ dùng trong trường hợp bắt buộc Thuốc chống béo phì được chia làm hai nhóm lớn

 Nhóm có tác dụng lên hệ thần kinh trung ương

 Nhóm tác dụng lên hệ tiêu hóa

Thuốc điều trị béo phì phổ biến hiện nay là Metformin thuộc nhóm hai với tác dụng chủ yếu là ức chế phân giải glycogen thành glucose ở gan, làm tăng tính nhạy cảm của insulin ngoại vi, tác động hạ glucose trong khoảng 2 - 4 mmol/l, giảm

HbA1C đến 2% Vì thế, Metformin được dùng cho cả bệnh nhân béo phì và tiểu đường Tuy nhiên thuốc cũng có một số tác dụng phụ với đường tiêu hóa, chống chỉ định với người suy tim nặng, bệnh gan, bệnh thận và những người từng có tiền sử nhiễm toan lactic

1.2.5 Rối loạn trao đổi lipid máu

Huyết thanh người bình thường có 5- 7g/l lipid toàn phần bao gồm acid béo

tự do, triglycerid, cholesterol toàn phần với hai dạng cholesterol tự do và cholesterol este, các photpholipid Vì không tan trong nước nên lipid được vận chuyển trong máu dưới dạng kết hợp với các protein đặc hiệu Các acid béo tự do được vận chuyển chủ yếu bởi albumin, các lipid khác được lưu hành trong máu dưới dạng phức hợp lipoprotein như: các hạt chymomicron, VLDL, HDL, IDL, LDL Các lipoprotein này có kích thước, thành phần, tỉ trọng và chức năng khác nhau trong quá trình chuyển hóa lipid [9], [28], [60], [77]

Để đánh giá lượng mỡ trong máu người ta làm xét nghiệm với các chỉ số:

 Cholesterol toàn phần (2,9 – 5,2 mmol/l )

là có rối loạn lipid máu ngay từ khi tỉ lệ thành phần của lipid máu có sự thay đổi Khái niệm này chỉ rõ rối loạn lipid máu có thể xảy ra từ rất sớm, ngay cả khi chưa

có tăng các giá trị tuyệt đối nồng độ của các thành phần trong máu [3] Rối loạn này

có thể tiên phát do di truyền hoặc thứ phát sau các bệnh khác như: béo phì, đái tháo đường, nghiện rượu, suy giáp trạng Fredrickson căn cứ vào kĩ thuật điện di và siêu

ly tâm với các thành phần huyết thanh đã phân loại chứng tăng lipid máu thành 5 type dựa trên những thay đổi thành phần lipoprotein Cách phân loại này đã được

WHO chính thức sử dụng vào năm 1970 [23] Nhiều nghiên cứu đã chứng minh người mắc bệnh béo phì có nguy cơ cao mắc các bệnh rối loạn lipid máu dẫn đến xơ vữa động mạch (liên quan chủ yếu đến các lipoprotein) hoặc hiện tượng “nhiễm độc

mỡ tế bào” [18], [23]

1.2.6 Mối quan hệ giữa béo phì và đái tháo đường

Béo phì và ĐTĐ là hai bệnh không truyền nhiễm nguy hiểm nhất của thế kỉ

21 Hai căn bệnh này có mối liên quan chặt chẽ với nhau thể hiện ở chỗ tỉ lệ người béo phì luôn tăng tương đương với số bệnh nhân bị ĐTĐ Một cuộc khảo sát của

Mỹ gần đây đã chỉ ra rằng có tới 58% số người bị ĐTĐ type 2 được quy cho là do béo phì Béo phì liên quan tới ĐTĐ type 2 thông qua sự đề kháng insulin Nồng độ acid béo tự do cứ tăng 100µM thì mức đề kháng insulin tăng khoảng 5-10% [3] Thiếu insulin dẫn đến sự tăng trọng lượng cơ thể, tăng đường máu, cuối cùng dẫn đến bệnh ĐTĐ type 2

Có nhiều nhân tố ảnh hưởng tới mối quan hệ giữa béo phì và bệnh ĐTĐ type

2 bao gồm: chỉ số khối cơ thể, thời gian béo phì, chế độ dinh dưỡng, sự vận động thân thể … Một thống kê đã chỉ ra rằng những người có chỉ số khối cơ thể lớn hơn

30 kg/m2 trong 10 năm có nguy cơ mắc bệnh ĐTĐ type 2 cao gấp hai lần người bị béo phì dưới 5 năm và nếu trọng lượng cơ thể tăng một kilogam thì rủi ro về bệnh ĐTĐ type 2 tăng 4,5% [37] Đây chính là cơ sở để Reed và cộng sự đưa ra phương pháp gây mô hình ĐTĐ thực nghiệm ở động vật bằng cách tiêm STZ liều đơn cho chuột đã được vỗ béo nhiều ngày [68], [73] Tại Việt Nam, Trần Thị Chi Mai đã áp dụng phương pháp này và đạt hiệu quả 90% chuột xuất hiện ĐTĐ với nồng độ glucose máu ≥10 mmol/l [18]

Kết quả của nhiều nghiên cứu cho thấy acid béo tự do có vai trò trong bệnh sinh ĐTĐ type 2 Phần lớn người béo phì có nồng độ acid béo trong huyết tương tăng cao Sự tăng này ức chế quá trình hấp thu glucose ngoại vi dưới tác dụng của insulin, ức chế sử dụng glucose của toàn cơ thể, ức chế oxy hóa glucose ở cơ [38]

ĐTĐ đặc trưng bởi sự rối loạn chuyển hóa glucid, sự rối loạn này ảnh hưởng đến môi trường nội môi do đó kéo theo hoặc làm cho quá trình rối loạn chyển hóa lipid ở mỗi loại ĐTĐ mang những đặc trưng riêng Đặc trưng chung của rối loạn chuyển hóa lipid trong ĐTĐ là sự tăng triglycerid, giảm HDL-c và LDL-c vẫn nằm trong giới hạn bình thường Tuy nhiên ở ĐTĐ type 1 rối loạn tăng triglycerid sẽ mất đi khi kiểm soát được glucose máu khác với type 2, rối loạn này có thể vẫn kéo dài mặc dù có sự điều trị giảm glucose máu thích hợp LDL-c của type 2 cũng có thể tăng nhẹ và xuất hiện nhiều LDL-c với kích thước nhỏ và nặng hơn khi việc kiểm soát glucose kém Đây chính là yếu tố làm tăng nguy cơ bệnh xơ vữa động mạch [18]

1.3 Bệnh đái tháo đường (Diabetse mellitus)

1.3.1 Khái niệm và phân loại

Danh từ đái tháo đường (diabetes mellitus) có nguồn gốc từ tiếng Hy lạp (diabetes: nước chảy trong ống syphon) và tiếng Latinh (mellitus: ngọt) [77] Khoảng 1550 năm trước công nguyên các thầy thuốc Hy lạp đã mô tả bệnh này với các triệu chứng ăn nhiều, uống nhiều, tiểu nhiều, nước tiểu có đường và sút cân nhanh [3] PGS TS Tạ Văn Bình thì định nghĩa đái tháo đường (ĐTĐ) là một hội chứng có đặc tính biểu hiện bằng tăng đường máu, do hậu quả của việc mất hoàn toàn insulin hoặc là do có liên quan đến sự suy yếu trong bài tiết và hoạt động của insulin Bệnh ĐTĐ được xác định dựa vào những tiêu chí trong bảng 1.2 [3]

Bảng 1.2 Các tiêu chí để chuẩn đoán ĐTĐ theo WTO [3]

Kết luận

Đường huyết lúc đói (mmol/l)

Đường huyết 2 giờ sau khi làm nghiệm pháp tăng đường huyết (mmol/l)

Đường huyết tại thời điểm bất kì (mmol/l)

kèm triệu chứng uống nhiều, đái nhiều

và gầy sút

Rối loạn dung

Dựa vào những hiểu biết về nguyên nhân phát sinh bệnh, ủy ban chuyên gia

về chuẩn đoán và phân loại ĐTĐ của WHO chia ĐTĐ thành các loại như sau:

 ĐTĐ type 1: Thường xảy ra ở trẻ em và thanh thiếu niên, khởi phát ở các cá thể có tính mẫn cảm về di truyền với bệnh Nguyên nhân chính của bệnh là tế bào β đảo tụy Langerhans bị phân hủy dẫn đến mất khả năng sản xuất insulin một hormon điều hòa lượng đường trong máu Quá trình hủy hoại tế bào β do cơ chế tự miễn [3], [29] Người ta đã biết đến 18 vùng gen liên quan đến type này được kí hiệu từ IDDM1 đến IDDM18 Các gen này chủ yếu liên quan đến những yếu tố kháng nguyên bạch cầu người HLA hoặc là gen mã hóa insulin [12]

 ĐTĐ type 2: Chiếm 80% - 90% bệnh nhân, có tính quy tụ gia đình và hay gặp

ở những người trên 30 tuổi Hai yếu tố chính đóng vai trò quan trọng trong cơ chế sinh ĐTĐ type 2 là khiếm khuyết chức năng tế bào β tuyến tụy và tình trạng kháng insulin [3], [37] Hai yếu tố này luôn có tác động qua lại với nhau và không thể kết luận yếu tố nào xuất hiện trước Kháng insulin có thể do bất thường ở hậu thụ thể insulin, bất thường về số lượng receptor insulin hoặc ái lực gắn hormon của insulin

và cũng có thể do acid béo tự do tăng cao gián tiếp làm ảnh hưởng quá trình truyền tin nội bào của insulin ở tế bào đích Bởi vậy, bệnh béo bệu là một trong những nguyên nhân môi trường được đề cập đến nhiều nhất vì chính béo bệu làm gia tăng tình trạng kháng insulin [12]

Sinh bệnh học ĐTĐ type 2 diễn biến qua ba giai đoạn:

- Giai đoạn 1: Mặc dù nồng độ glucose trong máu vẫn bình thường, nhưng có hiện tượng kháng insulin vì insulin tăng cao hơn mức bình thường trong máu

- Giai đoạn 2: Tình trạng kháng insulin có xu hướng nặng dần do có hiện tượng tăng glucose huyết sau ăn

- Giai đoạn 3: Kháng insulin không đổi nhưng bài tiết insulin suy giảm gây tăng glucose huyết lúc đói, bệnh ĐTĐ biểu hiện ra bên ngoài

 Ngoài ra còn có ĐTĐ thai nghén và một số type ĐTĐ đặc biệt khác như thiếu hụt chức năng tế bào β, thiếu hụt di truyền về tác động của insulin, bệnh tụy ngoại tiết,

1.3.2 Thực trạng đái tháo đường thế giới và Việt Nam

Cùng với các bệnh không lây nhiễm khác bệnh ĐTĐ đang phát triển với tốc

độ nhanh chóng cùng sự phát triển của nền kinh tế xã hội Năm 1994, toàn thế giới

có 110 triệu người mắc ĐTĐ Năm 1995 đã tăng lên 135 triệu người chiếm 4% dân

số thế giới Dự đoán đến năm 2010 có khoảng 221 triệu và năm 2025 có khảng 300 triệu bệnh nhân chiếm 5,4% dân số thế giới Đặc biệt ngày nay tỉ lệ người mắc bệnh

ở Châu Á đã vượt xa Châu Âu - nơi vẫn được xem là ổ bệnh [2] Tại tây Thái Bình Dương có 12 quốc gia có tỉ lệ ĐTĐ type 2 trên 8%, cá biệt có quốc đảo có tỉ lệ bệnh vượt 40% [13]

Việt Nam hiện nay ĐTĐ đang gia tăng rất nhanh Năm 1990, Hà Nội có tỉ lệ mắc bệnh là 1,2%, Huế 0,96%, Thành phố Hồ Chí Minh là 2,52% Theo điều tra quốc gia năm 2002 cho thấy tỉ lệ người mắc bệnh ĐTĐ lứa tuổi từ 30 - 64 trong toàn quốc là 2,7% (khu vực đô thị và khu công nghiệp tỉ lệ tới 4,4% ) Đặc biệt bệnh này trong nhóm người có yếu tố nguy cơ là rất cao (10,3%) Hiện nay, có khoảng hai triệu người mắc bệnh ĐTĐ nhưng có tới 65% số đó không biết mình đã mắc bệnh Theo PGS TS Tạ Văn Bình: ĐTĐ type 2 ở lứa tuổi thanh thiếu niên ngày một tăng nhanh, đây là một vấn đề rất đáng lưu tâm

- Biến chứng thận như: microalbumin niệu (11,6%), macroalbumin (3%), suy thận từ độ 1 đến độ 4 (3,5%) …

- Biến chứng thần kinh ngoại vi: giảm hoặc mất phản xạ gân xương hoặc cảm giác rung …

- Tổn thương bàn chân: tùy từng mức độ như phỏng rộp, biến dạng, loét, hoại thư, cắt cụt, …

- Biến chứng mạch máu lớn: mạch vành có tới (38%), đột quỵ (1,2%), tăng huyết áp (27,6%)

1.3.4 Phòng và điều trị bệnh ĐTĐ

Trừ những nguyên nhân di truyền thì ăn uống sinh hoạt hợp lý điều độ và khám sức khỏe định kỳ là phương thức chung để phòng bệnh nói chung và bệnh ĐTĐ nói riêng Tùy theo loại ĐTĐ mà việc điều trị bằng thuốc là khác nhau:

+ Insulin và các thuốc kích thích bài tiết insulin như Sulfonflurea, Nateglinid (Starlix) …

+ Thuốc làm tăng tính nhạy cảm của thụ thể với insulin như: Biguanid, nhóm thiazolidinedion…

+ Các thuốc chống tăng glucose huyết sau bữa ăn: thuốc ức chế enzyme α- glucosidase…

1.3.5 Đái tháo đường với y học cổ truyền

Theo quan niệm đông y ĐTĐ thuộc phạm vi chứng tiêu khát với ba triệu chứng chính là ăn nhiều, uống nhiều, tiểu nhiều do ăn quá nhiều các chất cay, béo, ngọt làm mất cân bằng âm dương trong cơ thể tạo thành hỏa nhiệt, uất nhiệt làm phần âm như âm, vị, thận bị hao tổn Hoả nhiệt làm phế hư gây chứng tiêu khát, vị

âm gây chứng gầy đói, thận hư gây tiểu nhiều và tiểu ra đường Xuất phát từ quan niệm đó nên phương pháp điều trị chủ yếu là dưỡng âm, thanh nhiệt sinh tân dịch làm cơ thể lập lại cân bằng âm dương Thảo dược hay dùng là sinh địa, cỏ ngọt, mướp đắng, hoàng kỳ, huyền sâm…[7], [17]

1.3.6 Chuyển hóa glucose và sự điều hòa glucose huyết

Glucose trong cơ thể có nguồn gốc chủ yếu từ thức ăn thông qua quá trình tiêu hóa Vào các thời điểm xa bữa ăn hoặc khi glucid thức ăn không đủ, cơ thể sẽ huy động nguồn glucose thứ hai nhờ sự thoái hóa glycogen ở gan, cơ Ngoài ra glucose còn có được nhờ quá trình tân tạo glucose nhờ hệ thống enzyme đặc hiệu riêng biệt (xảy ra ở gan, thận, ruột) từ pyruvat, lactat hay các sản phẩm trung gian của chu trình Krebs

Glucose sau khi được hấp thu hoặc tạo thành trong cơ thể sẽ tan trong máu

và được vận chuyển vào trong tế bào nhờ các protein vận chuyển Cuối cùng glucose sẽ thoái hóa để tạo năng lượng hay các sản phẩm trung gian thông qua quá trình đường phân, chu trình pentose phosphat hay con đường tạo uronic và ascorbic Glucose dư thừa khi nhu cầu năng lượng của cơ thể thấp lại được chuyển thành dạng glucid dự trữ là glycogen ở gan [28]

Để duy trì nồng độ glucose ổn định trong máu cơ thể phải huy động nhiều cơ chế, có sự xúc tác của nhiều loại enzyme khác nhau nhằm cân bằng giữa lượng glucose đi vào máu và lượng glucose được thu nạp bởi các tổ chức Trong đó quan trọng nhất là việc điều hòa quá trình tân tạo glucose và quá trình thoái hóa glucose

có sự tham gia của nhiều protein vận chuyển glucose qua màng tế bào (các GLUT)

Glucose trong cơ thể được điều hòa ổn định bởi các hormon mà chủ yếu là các hormon tuyến tụy nội tiết Insulin là hormon tiết bởi các tế bào β của đảo tụy Langerhans có tác dụng làm giảm glucose máu do làm tăng dự trữ glycogen ở gan,

cơ, ức chế quá trình tân tạo đường mới Glucagon là hormon tiết bởi tế bào α đảo tụy, có tác dụng ngược với insulin, nghĩa là làm tăng sự phân giải glycogen và tăng tân tạo đường mới do đó giảm glucose huyết

1.4 Cây Hồng Bì (Clausena lansium Lour.)

Cây Hồng Bì hay còn gọi là Hoàng bì

Tên khoa học: Clausena lansium (Lour.) Skells

Syn: Clausena wampi (Blanco.) Oliv (tên tiếng Anh là wampi) thuộc họ Cam

quýt ( Rutaceae)

1.4.1 Đặc điểm thực vật học

Hồng Bì (Clausena lansium Lour.) là một loài cây gỗ nhỏ cao 3 - 5m, cành

sần sùi do có nhiều hạch Lá kép lông chim lẻ, dài 35cm, lá chét hình trứng, nguyên hay hơi khía tai bèo, phía cuống lá tròn nhẵn Hoa trắng mọc thành chùm ở ngọn, chùm hoa thưa dài 25 - 50cm Quả màu vàng, hình cầu, đường kính 15 mm, có lông ngắn 1 - 2mm, có 1-2 hạt, thịt quả ngọt thơm Mùa hoa tháng 4, mùa quả tháng 6 đến tháng 10

Cây Hồng Bì được trồng nhiều ở các tỉnh miền bắc nước ta để lấy quả ăn, còn thấy mọc ở Ấn Độ, Malaysia, miền nam Trung Quốc [2], [7], [27]

1.4.2 Thành phần hóa học

Từ việc nghiên cứu những bộ phận khác nhau của cây Hồng Bì

(Clausena lansium Lour.), 58 chất đã được tách chiết và xác định cấu trúc [26],

[27] Các chất này chủ yếu thuộc nhóm hợp chất cacbazol alkaloid, coumarin, amit, terpenoid và steroid…

Tinh dầu thu từ lá, hoa, vỏ quả và hạt đều đã được xác định thành phần Tinh dầu từ vỏ quả chứa β-santatol (52,0%), α-santatol (15,5%), farnesol (5,2%) và sinensal (4,0%)

N H

O H

O H

Lansimid (amid)

H3

Wampetin (Courmarin)

19

C O H

CH 3

28

18 21

C

33 26

Lansiol (terpennoid)

1.4.3 Sử dụng và hoạt tính sinh học

Vỏ rễ Hồng Bì (Clausena lansium Lour.) được dùng để chữa ho, sốt Quả

được dùng để ăn, trị tiêu hóa kém, ho nhiều Lá dùng làm thuốc trị cảm cúm, nhiễm lạnh, sốt, viêm não, sốt rét và nhiều khi dùng để gội đầu cho sạch gầu, trơn tóc Rễ

và hạt trị đau dạ dày, đau thượng vị, đau thoát vị, đau bụng Hạt Hồng Bì chữa

rắn cắn [2], [7], [17], [20] Các hợp chất phân lập từ cây Hồng Bì (Clausena lansium Lour.) có hoạt tính bảo vệ gan [27], chống co thắt của các lansimit [49],

chống oxy hóa lipid và bảo vệ não [56] Tác dụng chống ung thư phổi, gan và ung thư tế bào tuyến HELA cũng được nhiều tác giả đề cập đến [67]

1.4.4 Các nghiên cứu về cây Hồng Bì (Clausena lansium Lour.) có tác dụng

giảm béo và hạ glucose huyết

Hồng Bì (Clausena lansium Lour.) là cây ăn quả, cây thuốc nhận được sự

quan tâm của nhiều nhà hóa học Hơn 50 hợp chất hóa học khác nhau đã được xác định cấu trúc Tuy nhiên vẫn chủ yếu là cấu trúc hợp chất tinh dầu [27]

Trong nhiều công trình nghiên cứu tác dụng sinh dược học, chúng tôi chú ý đến công trình nghiên cứu về tác dụng hạ đường huyết của rễ cây Hồng Bì Nam phi

(Clausena anisata (Willd) Hook) của Ojewole J.A.O và cộng sự (2002) [66], vỏ thân cây Hồng Bì thật (Clausena lansium Lour.) của Adebajo A.C [33]. Các tác giả

đã kết luận dịch chiết từ rễ Hồng Bì có tác dụng hạ đường huyết với chuột cống gây ĐTĐ thực nghiệm bằng Streptozotocin Liu Y Shi C Z cũng kết luận tốt về khả

năng chống oxy hóa lipid của Clausena lansium Lour [56]

Tại Viện Nam, tính tới thời điểm chúng tôi nghiên cứu (2009) chưa có tác giả nào trong nước đề cập về vấn đề sinh dược học của vỏ quả cây Hồng Bì thật

(Clausena lansium Lour.) với tác dụng chống béo phì và ĐTĐ

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Mẫu thực vật

Mẫu nghiên cứu là vỏ quả Hồng Bì Quả Hồng Bì được thu hái tại tỉnh Bắc Giang, sau khi sử dụng phần ruột, vỏ quả được thu thập và đem rửa sạch, để ráo nước và tiến hành sấy khô ở 500C sau đó tán thành bột mịn Mẫu thực vật do Bộ môn Thực vật học - Trường ĐH Khoa học Tự nhiên Hà Nội giám định

Hình 2.1 Cây Hồng Bì (Clausena lansium Lour.) và cành mang quả

2.1.2 Mẫu động vật

Chuột nhắt trắng (Mus musculus) chủng Swiss 4 tuần tuổi (14-16g) do Viện

Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp Chuột được nuôi trong điều kiện nhiệt độ phòng 22- 25°C với chu kỳ sáng 12h và tối 12h, được cho ăn và uống nước tự do 2.1.3 Dụng cụ, hóa chất thí nghiệm

Các dụng cụ thí nghiệm

- Tủ sấy Memert, Đức

- Bình chiết 30 lít

- Phễu chiết, phễu lọc, giấy lọc …

- Máy cô quay chân không RE 400 Yamato, Japan

- Cân kĩ thuật GM612, Đức

- Máy quang phổ UV – VIS 1000

- Máy xét nghiệm tự động các chỉ số sinh hóa OLYMPUS AU 640, Nhật

- Máy li tâm eppendorf, li tâm lạnh

- Máy đo đường huyết tự động OneTouch Ultra và que thử, Mỹ

- Micropipet và các dụng cụ đo đếm khác

Hóa chất

- STZ (streptozotocin) Sigma, ST.Louse

- Silica gel 60 (0.04 – 0.063mm), Merck

- Các loại dung môi hữu cơ với độ tinh khiết cao như ethanol, dichlomethan, ethylacetate, aceton của Trung Quốc và Sigma (Mỹ)

- Bộ KIT định lượng insulin huyết thanh chuột nhắt bằng kĩ thuật ELISA (hãng Mercodia), Thụy Điển

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp tách chiết mẫu nghiên cứu

Vỏ Hồng Bì khô (3kg) được chiết rút 3 lần với dichlomethan (CH2Cl2) thu lại dịch chiết, cô loại dung môi được cao dichlomethan Bã còn lại chiết rút 3 lần với methanol tinh khiết, methanol 50%, gộp các dịch chiết, cô loại dung môi thu được phân đoạn cao methanol (MeOH) Cao MeOH hòa tan trong nước rồi tiếp tục chiết qua các dung môi có độ phân cực tăng dần là ethylacetate và buthanol, các dịch chiết cũng được loại dung môi thành các cao tương ứng

2.2.2 Phương pháp khảo sát thành phần hóa học của cây Hồng Bì

2.2.2.1 Định tính

Cao các phân đoạn được hòa tan trong dung môi thích hợp với từng loại phản ứng định tính Các nhóm phản ứng được trình bày tóm tắt trong bảng sau:

Bảng 2.1 Bảng các phản ứng định tính đặc trưng Nhóm

hợp chất Phản ứng Thuốc thử Dấu hiệu nhận biết

Flavonoid

Shinoda Mg/HCl

Màu đỏ, hồng, da cam xuất hiện chứng tỏ sự

có mặt của flavon, flavonol và các dẫn xuất hydro của chúng

Diazo hoá Diazo Phản ứng cho màu da cam là dương tính Dung dịch

kiềm NaOH 10%

Phản ứng có kết quả dương tính khi xuất hiện màu vàng cam

Acid sulfuric H2SO4 10%

Phản ứng cho mầu vàng đậm cho thấy sự có mặt của favon và flavonol, mầu đỏ hay nâu cho thấy sự có mặt của chalcon và auron

Vanilin/HCl Màu đỏ son xuất hiện chứng tỏ sự có mặt của

Phản ứng dương tính nếu có kết tủa màu trắng hoặc vàng nhạt

Dragendorf Phản ứng dương tính nếu có kết tủa màu da

cam

Glycoside Keller-Killian Phản ứng dương tính nếu xuất hiện vòng đỏ

nâu ở bề mặt phân cách giữa hai lớp chất lỏng

Polypheno

l khác

Dung dịch kiềm Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu vàng

FeCl3/HCl Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu lục,

xanh, đen

2.2.2.2 Định lượng pholyphenol tổng số theo phương pháp Folin- Ciocalteu

Nguyên tắc dựa trên phản ứng của các hợp chất polyphenol (trong mẫu) với

thuốc thử Folin-Ciocalteau cho sản phẩm màu xanh lam So màu trên máy quang phổ UV VIS 1000 ở bước sóng λ = 765 nm, dùng chất chuẩn là acid gallic [51]

Các bước tiến hành như sau:

○ Chuẩn bị mẫu định lượng và hóa chất

- Dung dịch acid gallic: 0,5 g acid gallic + 10 ml C2H5OH + 90 ml H2O bảo quản lạnh Như vậy dịch chuẩn gốc acid gallic có nồng độ 5mg/ml

- Dung dịch Na2CO3: 200g Na2CO3 + 800 ml H2O đun sôi Thêm một vài tinh thể Na2CO3, sau 24 giờ đem lọc và dẫn nước cất tới 1000ml

- Dung dịch mẫu cần định lượng

○ Tiến hành xây dựng đường chuẩn acid gallic

Chuẩn bị cóng định lượng theo số lượng dung dịch gốc như sau: 0, 1, 2, 3, 5

và 10 ml sau đó dẫn nước cất tới 100 ml ta thu được các nồng độ 0, 50, 100, 150,

250 và 500 mg/l acid gallic

Cho vào mỗi cuvert 20µl mẫu thử (dung dịch gallic chuẩn ở các nồng độ hoặc dịch chiết các phân đoạn) + 1,58ml H2O + 100 µl thuốc thử Folin- Ciocalteau sau 30 giây đến 8 phút cho thêm 300µl Na2CO3 Để hỗn hợp dung dịch phản ứng trong 2 giờ ở 20oC rồi xác định ở bước sóng 765nm Tiến hành định lượng acid gallic để dựng đường chuẩn

Bảng 2.2 Kết quả xây dựng đường chuẩn acid gallic

TT gallic acid

(mg/l)

OD (765nm)

Hình 2.2 : Đồ thị đường chuẩn acid gallic

○ Định lượng phenolic của mẫu nghiên cứu bằng cách lấy 20µl (0,02ml) để định

lượng tương tự như đã làm với mẫu chuẩn acid gallic

2.2.2.3 Phương pháp sắc kí lớp mỏng (TLC)

Sắc kí lớp mỏng (TLC - thin layer chromatography) là kĩ thuật sắc kí khá nhanh gọn và tiện lợi Nó giúp nhận biết các nhóm chất có trong mẫu nghiên cứu Phương pháp sắc kí lớp mỏng, thành phần trong hỗn hợp được xác định nhờ so sách hệ số lưu của hỗn hợp (Rf)và hệ số lưucủa 1 số chất đã biết[32]

Nguyên tắc: Kĩ thuật này dựa vào mức độ tương tác của các chất khác nhau

với pha tĩnh (bản mỏng) và pha động (hệ dung môi chạy sắc kí) Pha tĩnh có thể là silicagel, bột Al2O3 hoặc polyamide Pha động là một hỗn hợp từ 2 dung môi trở lên với các độ phân cực khác nhau tuỳ thuộc vào mẫu phân tích

Phương pháp: Các mẫu (đã pha trong dung môi thích hợp) được tiến hành

chạy sắc ký trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715) kích thước phù hợp trên các hệ dung môi khác nhau để lựa chọn ra hệ dung môi phù hợp nhất Một số hệ dung môi được sử dụng:

- TEAF: 5: 3: 1: 1 (Toluen – ethylacetate – acetone – acid formic)

- Toluen: etylaxetate: acid focmic = 5:4:1

- Etylaxetat: acid focmic: nước = 8:1:1

Hiện màu bằng dung dịch H2SO4 10% được phun đều trên bản mỏng Xác định hệ số lưu (Rf) theo công thức: Rf = a/b Trong đó a là khoảng di chuyển của chất nghiên cứu, b là khoảng di chuyển của dung môi

2.2.3 Nghiên cứu tác dụng của dịch chiết các phân đoạn vỏ quả Hồng Bì lên trọng lượng và một số chỉ số hóa sinh máu của chuột BFTN

2.2.3.2 Xây dựng mô hình chuột béo phì thực nghiệm

Chuột nhắt trắng chủng Swiss, sau khi mua về chuột được chăm sóc bình thường trong 3-4 ngày để thích ứng với môi trường mới sau đó chúng tôi tiến hành phân chuột thành 2 nhóm với hai chế độ dinh dưỡng như sau:

- Nhóm 1 – Nhóm đối chứng: Các con chuột tiếp tục được chăm sóc bằng

thức ăn bình thường (do viện Vệ sinh dịch tễ cung cấp)

- Nhóm 2 - Nhóm nuôi béo: Các con chuột được chăm sóc bằng chế độ

thức ăn giàu lipid và cholesterol do chúng tôi phối trộn các thực phẩm dinh dưỡng được tính toán với thành phần như bảng 2.3

Các nhóm chuột được theo dõi trong vòng 6 tuần, trọng lượng của các con chuột được kiểm tra hàng tuần Vào tuần cuối cùng thời gian thí nghiệm, sau khi

xác định trọng lượng, chúng tôi tiến hành lựa chọn ngẫu nhiên từ mỗi nhóm ra 10 con chuột, lấy máu tổng số và phân tích một số chỉ số lipid máu Các số liệu được thu thập và tiến hành xử lý thống kê

Bảng 2.3 Thành phần thức ăn giàu lipid [68], [73]

Vitamin & acid amin 2

2.2.3.3 Nghiên cứu tác dụng giảm trọng lượng và điều hòa trao đổi lipid của các phân đoạn dịch chiết từ vỏ quả Hồng Bì

Để đánh giá tác dụng đến trọng lượng và một số chỉ số hóa sinh liên quan đến trao đổi lipid của các phân đoạn dịch chiết, chúng tôi tiến hành phân chuột thành các lô khác nhau (6con/lô) như sau:

Bảng 2.4 Mô hình nghiên cứu khả năng giảm béo của các phân đoạn dịch chiết

từ vỏ quả Hồng Bì

Lô số Chế độ ăn trước điều

1 Thức ăn chuẩn Nước muối sinh lý 0,9% (Đối chứng - )

2 Thức ăn giàu lipid Nước muối sinh lý 0,9% (Đối chứng +)

3 Thức ăn giàu lipid Metformin (500 mg/kg thể trọng)

4 Thức ăn giàu lipid Cao methanol (1000 mg/ kg thể trọng )

5 Thức ăn giàu lipid Cao dichlomethan (1000 mg/ kg thể trọng)

6 Thức ăn giàu lipid Cao ethylacetate (1000 mg/ kg thể trọng )

Tiến hành điều trị trong 21 ngày, trọng lượng của các con chuột được theo dõi hàng tuần, vào ngày thứ 21 sau khi kiểm tra trọng lượng, các con chuột được cho nhịn đói 12 giờ sau đó tiến hành lấy máu tổng số, ly tâm ở 1500vòng/phút (10 phút), thu huyết thanh và tiến hành phân tích một số chỉ số hóa sinh liên quan đến quá trình trao đổi lipid

2.2.4 Phương pháp nghiên cứu tác dụng hạ glucose huyết của các phân đoạn dịch chiết vỏ quả Hồng Bì trên mô hình chuột đái tháo đường mô phỏng type 2

Để tìm hiểu tác dụng của dịch chiết cây Hồng Bì lên đường huyết, trước tiên chúng tôi tiến hành gây mô hình chuột đái tháo đường mô phỏng type 2 dựa trên chế độ ăn giàu chất béo kết hợp với STZ liều đơn của Srinivasan [73] Mô hình type

2 được kiểm chứng lại bằng bộ KIT định lượng insulin huyết thanh chuột bằng kĩ thuật ELISA (hãng Mercodia) Sau đó chuột được phân lô và điều trị 21 ngày, theo dõi đường huyết và xác định hoạt độ một số enzyme

2.2.4.1 Tạo mô hình chuột ĐTĐ type 2

Để có mô hình ĐTĐ mô phỏng type 2, chuột nuôi với chế độ ăn giàu chất béo và cholesterol sau 6 tuần, được tiêm màng bụng liều đơn STZ (100mg/kg pha trong đệm citrate 0,01M, pH = 4,3)

Đo đường huyết tại các thời điểm 0 giờ (trước khi tiêm STZ), 24giờ, 48 giờ (sau khi tiêm STZ) và 72 giờ (3 lần, mỗi lần cách nhau 1 tiếng và lấy trung bình) Chuột nào có đường huyết cao (≥18 mmol/l) và ổn định được lựa chọn để cho uống cao các phân đoạn dịch chiết trong vòng 21 ngày Đường huyết trong các trường hợp trên đều được đo sau khi cho chuột nhịn qua đêm (12h), chỉ cho uống nước

2.2.4.2 Thử khả năng hạ glucose huyết của các phân đoạn dịch chiết

Các lô chuột ĐTĐ type 2(6 con/lô) được ăn thức ăn thường và điều trị hằng ngày bằng cách cho uống cao các phân đoạn dịch chiết như bảng 2.4 Đường huyết của các con chuột được đo vào cùng một thời điểm trong ngày và sau khi nhịn đói

12 giờ ở các ngày thứ 0 (trước khi điều trị), ngày thứ 7, thứ 14, thứ 21 khi điều trị

Bảng 2.5 Mô hình nghiên cứu khả năng hạ glucose huyết của các phân đoạn

dịch chiết từ vỏ quả Hồng Bì

Lô Chế độ ăn

7 Thức ăn chuẩn Uống nước cất, không điều trị

8 Thức ăn béo STZ Uống nước cất, không điều trị

9 Thức ăn béo STZ Điều trị cao phân đoạn CH2Cl2 (1500mg/kg)

10 Thức ăn béo STZ Điều trị cao phân đoạn methanol (1500mg/kg)

11 Thức ăn béo STZ Điều trị cao phân đoạn ethylacetate (1500mg/kg)

12 Thức ăn béo STZ Điều trị metformin (500mg/kg) thể trọng

2.2.5 Một số kĩ thuật phân tích hóa sinh

2.2.5.1 Phương pháp định lượng glucose huyết

Xác định nồng độ glucose huyết trên máy đo đường huyết với que thử tự động One Touch Ultra

Nguyên tắc: KIT dựa trên phản ứng oxy hoá glucose bằng glucose oxidase

(GOD) và hydrogen peroxide tạo thành tác dụng với 4-aminoantipyrin và phenol nhờ xúc tác của peroxidase (POD) tạo phức hợp quinoimin theo các phản ứng

Glucose + O2 Glucose oxidase Gluconic acid + H2O2 Gluconic acid + Phenol + 4-aminoantipyrin Peroxidase Quinoimin (đỏ) + 4H2O2

2.2.5.2 Định lượng insulin trong huyết thanh chuột

Tiến hành theo phương pháp định lượng miễn dịch enzyme hai lớp (Sandwich ELISA) với bộ sinh phẩm đo insulin chuột nhắt của hãng Mercodia

Nguyên tắc: Insulin trong mẫu phản ứng với kháng thể kháng insulin liên kết

với enzyme peroxydase và kháng thể kháng insulin cố định trên giếng phản ứng Sau khi rửa để loại bỏ các kháng thể không gắn, phát hiện các kháng thể gắn bằng phản ứng với 3,3’, 5,5’- tetramethyl banzidine Dừng phản ứng bằng dung dịch acid sulfuric, đo màu ở bước sóng 450nm

Các bước thí nghiệm được tiến hành tại phòng hóa sinh bệnh viện nhi TW

2.2.5.3 Định lượng một số chỉ số lipid trong huyết thanh

Các chỉ số lipid huyết thanh (cholesterol toàn phần, triglycerid, HDL-c, LDL-c) được xác định trên máy xét nghiệm sinh hóa tự động (Phòng hóa sinh – Bệnh viện Hữu nghị Việt - Xô) Nguyên tắc xác định của mỗi chỉ số như sau:

a Định lượng triglycerid

Thuỷ phân triglycerid bằng enzyme lipase, định lượng glycerol giải phóng ra bằng phương pháp đo màu của quynonimin tạo thành từ 4-aminoantipyrin và 4-chlorophenol phản ứng với peroxide hydrogen theo các phản ứng sau:

Triglycerid Glycerol + acid béo Glycerol + ATP Glycerol-3-phosphate + ADP Glycerol-3-phosphate + O2 Dihiddroxyacetone + H2O2

H2O2 +Aminoantipyrine +4-chlorophenol Quynonimin +4 HCl + 4H2O

Đo mật độ quang học quynonimin ở bước sóng 546 nm (máy Olympus AU400) rồi so với chuẩn để tính kết quả

b Định lượng cholesterol toàn phần

Thuỷ phân cholesterol este bằng enzyme cholesterol esterase (CHE) và oxy hoá bằng cholesterol oxydase (CHO) Đo mật độ quang của quynonimin tạo nên từ phản ứng của hydrogen peroxide với 4-aminophenazone và phenol nhờ xúc tác của peroxydase Các phản ứng:

Cholesterol este + H2O Cholesterol + acid béo Cholesterol + O2 Chlesterol-3-one + H2O2

H2O2 + 4-aminophenazone + Phenol Quynonimin + H2O

Đo mật độ quang của Quynonimin ở bước sóng 546 nm (bằng máy Olympus AU400), so với ống chuẩn để tính kết quả

c.Định lượng HDL-c

Nguyên tắc: Xét nghiệm gồm hai bước đặc hiệu Bước thứ nhất cholesterol

trong chylomicron, VLDL, LDL bị loại bỏ và phá hủy bằng các phản ứng enzyme