Nghiên cứu tách chiết và đặc tính sinh dược học của một số hợp chất tự nhiên từ cây hồng bì (Clausena lansium Lour.) (LV00294)

1 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan những gì trình bày trong luận văn là của riêng tôi, dưới sự hướng dẫn của GS. TS. Đỗ Ngọc Liên và không trùng lặp với bất kì một nghiên cứu nào có trước. Hà Nội, ngày 10 tháng 10 năm 2009 Học viên Hoàng Thị Hương Quỳnh BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2  HOÀNG THỊ HƯƠNG QUỲNH NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT VÀ ĐẶC TÍNH SINH DƯỢC HỌC CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT TỰ NHIÊN TỪ CÂY HỒNG BÌ (Clausena lansium Lour.) 2 MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Chương 1. TỔNG QUAN 5 1.1. Các hợp chất thứ sinh từ thực vật 5 1.1.1. Các hợp chất phenolic từ thực vật 5 1.1.2. Alkaloid thực vật 10 1.1.3. Terpen thực vât 11 1.2. Bệnh béo phì (Obesity) 11 1.2.1. Khái niệm và phân loại béo phì 11 1.2.2. Thực trạng béo phì thế giới và Việt Nam 12 1.2.3. Tác hại và nguy cơ bệnh béo phì 12 1.2.4. Nguyên nhân, giải pháp phòng, điều trị béo phì 13 1.2.5. Rối loạn trao đổi lipid máu 14 1.2.6. Mối quan hệ giữa béo phì và đái tháo đường 15 1.3. Bệnh đái tháo đường (Diabetse mellitus) 16 1.3.1. Khái niệm và phân loại 16 1.3.2. Thực trạng đái tháo đường thế giới và Việt Nam 18 1.3.3. Tác hại và biến chứng 18 1.3.4. Phòng và điều trị bệnh đái tháo đường 19 1.3.5. Đái tháo đường với Y học cổ truyền 19 1.3.6. Chuyển hoá glucose và điều hoà glucose huyết 19 1.4 Cây Hồng Bì (Clausena lansium Lour.) 20 1.4.1. Đặc điểm thực vật học 21 1.4.2. Thành phần hoá học 22 1.4.3. Sử dụng và hoạt tính sinh học 22 1.4.4. Các nghiên cứu về cây Hồng Bì (Clausena lansium Lour) có tác dụng giảm béo phì và hạ glucose huyết 23 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 3 2.1 Đối tượng nghiên cứu 23 2.1.1. Mẫu thực vật 23 2.1.2. Mẫu động vật 23 2.1.3. Dụng cụ và hoá chất thí nghiệm 23 2.2. Phương pháp nghiên cứu 24 2.2.1. Phương pháp tách chiết mẫu nghiên cứu 24 2.2.2. Phương pháp khảo sát thành phần hoá học của cây Hồng Bì 24 2.2.3. Nghiên cứu tác dụng của các phân đoạn dịch chiết từ vỏ quả Hồng Bì đến trọng lượng và một số chỉ số hoá sinh máu của chuột BPTN 28 2.2.4. Phương pháp nghiên cứu tác dụng hạ glucose huyết của các phân đoạn dịch chiết từ vỏ quả Hồng Bì trên mô hình chuột ĐTĐ type 2 thực nghiệm 30 2.2.5. Một số kĩ thuật phân tích hoá sinh 31 2.2.5.1. Phương pháp định lượng glucose huyết 31 2.2.5.2. Định lượng insulin huyết thanh chuột 31 2.2.5.3. Phương pháp định lượng một số chỉ số lipid trong huyết thanh 32 2.2.5.4. Phương pháp xác định hoạt độ một số enzyme liên quan đến quá trình trao đổi carbohydrate ở chuột đái tháo đường 33 2.2.6. Phương pháp xử lý số liệu thống kê 34 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 3.1. Quy trình tách chiết các phân đoạn từ vỏ quả Hồng Bì 35 3.2. Kết quả khảo sát thành phần các hợp chất tự nhiên có trong các phân đoạn dịch chiết từ vỏ quả Hồng Bì 36 3.2.1. Định tính một số hợp chất tự nhiên có trong vỏ quả Hồng Bì 36 3.2.2. Hàm lượng polyphenol tổng số 37 3.2.3. Kết quả sắc kí lớp mỏng 38 3.3. Kết quả xác định liều độc cấp 40 3.4. Tác dụng của các phân đoạn dịch chiết từ vỏ quả Hồng Bì trên mô hình chuột BPTN 41 4 3.4.1. Kết quả xây dựng mô hình chuột béo phì thực nghiệm 41 3.4.2. Tác dụng của các phân đoạn dịch chiết từ vỏ quả Hồng Bì đến trọng lượng và một số chỉ số lipid huyết của chuột 44 3.4.2.1. Tác dụng đến trọng lượng chuột 44 3.4.2.2. Tác dụng đến các chỉ số lipid của chuột béo phì 46 3.5. Tác dụng hạ đường huyết của vỏ quả Hồng Bì trên mô hình chuột ĐTĐ type 2 50 3.5.1. Kết quả tạo mô hình chuột ĐTĐ type 2 thực nghiệm 50 3.5.2. Tác dụng của phân đoạn dịch chiết từ vỏ quả Hồng Bì đến nồng độ glucose huyết của chuột ĐTĐ 53 3.5.3. Tác dụng của các phân đoạn dịch chiết từ vỏ quả Hồng Bì đến hàm lượng insulin huyết thanh 55 3.6. Tác dụng của các phân đoạn dịch chiết từ vỏ quả Hồng Bì đến một số yếu tố liên quan đến chuyển hoá glucose 57 3.6.1. Ảnh hưởng đến hàm lượng glycogen của gan 58 3.6.2. Ảnh hưởng đến hoạt độ enzyme hexokinase và glucose-6-phosphatase 59 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64 5 DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT BPTN : Béo phì thực nghiệm BMI : Chỉ số khối cơ thể (Body Mass Index) BuOH : Cao buthanol CH 2 Cl 2 : Cao dichlomethan ĐTĐ : Đái tháo đường ELISA : Enzyme linked immunosorbent assay EtOAc : Cao ethylacetate G6Pase : Glucose -6- phosphatase HK : Hexokinase HFD : Ăn thức ăn chứa chất béo cao HDL-c : Lipoprotein có tỷ trọng cao (High Density Lipoprotein) LDL-c : Lipoprotein có tỷ trọng thấp (Low Density Lipoprotein) LD 50 : Liều độc làm chết 50% số chuột MeOH : Cao methanol Met : Thuốc metformin ND : Ăn thức ăn chuẩn, bình thường PĐ : Phân đoạn STZ : Streptozocin SE : Sai số chuẩn (Standard error) TC : Cholesterol tổng số TG : Triglycerid TW : Trung ương 6 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Phân loại BMI của người trưởng thành Châu Âu và Châu Á Bảng 1.2. Các tiêu chí để chuẩn đoán ĐTĐ theo WTO Bảng 2.1. Bảng các phản ứng định tính đặc trưng Bảng 2.2. Kết quả xây dựng đường chuẩn acid gallic Bảng 2.3. Thành phần thức ăn giàu lipid Bảng 2.4. Mô hình nghiên cứu khả năng giảm béo của các phân đoạn dịch chiết từ vỏ quả Hồng Bì Bảng 2.5. Mô hình nghiên cứu khả năng hạ glucose huyết của các phân đoạn dịch chiết từ vỏ quả Hồng Bì Bảng 3.1. Hiệu suất chiết rút các phân đoạn từ vỏ Hồng Bì Bảng 3.2. Kết quả định tính các phân đoạn dịch chiết vỏ quả Hồng Bì Bảng 3.3. Hàm lượng polyphenol tổng số trong các phân đoạn dịch chiết từ vỏ quả Hồng Bì Bảng 3.4. Đặc điểm sắc kí đồ các phân đoạn dịch chiết vỏ quả Hồng Bì Bảng 3.5. Kết quả thử độc tính theo đường uống Bảng 3.6. Trọng lượng trung bình của chuột nuôi bằng hai chế độ dinh dưỡng Bảng 3.7. So sánh một số chỉ số hóa sinh giữa chuột nuôi thường và nuôi BPTN Bảng 3.8. Trọng lượng trung bình các lô chuột thí nghiệm trước và sau khi điều trị 21 ngày Bảng 3.9. Tác động của các phân đoạn dịch chiết từ vỏ quả Hồng Bì đến các chỉ số lipid của chuột béo phì Bảng 3.10. Nồng độ glucose huyết lúc đói của các lô chuột trước và sau khi tiêm STZ Bảng 3.11. Kết quả nồng độ glucose huyết lúc đói của các lô chuột sau 21 ngày điều trị Bảng 3.12. Ảnh hưởng của các phân đoạn dịch chiết đến nồng độ insulin huyết thanh của chuột sau 21 ngày điều trị Bảng 3.13. Hàm lượng glycogen gan chuột sau 21 ngày điều trị bằng các phân đoạn dịch chiết Bảng 3.14. Hoạt độ enzyme hexokinase và glucose-6-phosphatase của các lô chuột thí nghiệm sau 21 ngày điều trị 7 DANH MỤC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ Hình 2.1. Cây Hồng Bì (Clausena lansium Lour.) và cành mang quả Hình 2.2. Đồ thị đường chuẩn acid gallic Hình 3.1. Sơ đồ quy trình tách chiết các hợp chất tự nhiên trong vỏ quả Hồng Bì Hình 3.2. Sắc kí đồ các phân đoạn dịch chiết từ vỏ quả Hồng Bì Hình 3.3. Biểu đồ biểu diễn sự tăng trọng của các nhóm chuột với 2 chế độ dinh dưỡng khác nhau trong vòng 6 tuần. Hình 3.4. Biểu đồ so sánh một số chỉ số hóa sinh giữa các lô chuột thí nghiệm Hình 3.5. Biểu đồ trọng lượng trung bình của các lô chuột trước và sau điều trị 21 ngày Hình 3. 6. Tác động của các phân đoạn dịch chiết đến một số chỉ số trao đổi lipid ở chuột béo phì thực nghiệm Hình 3.7. Nồng độ glucose huyết lúc đói của các lô chuột thí nghiệm trước và sau khi tiêm 72 giờ Hình 3.8. Kết quả nồng độ glucose huyết lúc đói của các lô chuột sau 21 ngày điều trị Hình 3.9. Ảnh hưởng của các phân đoạn dịch chiết đến nồng độ insulin huyết thanh của chuột sau 21 ngày điều trị Hình 3.10. Hàm lượng glycogen gan (mg/g gan) sau điều tri của các lô chuột Hình 3.11. Hoạt độ enzyme hexokinase và glucose-6-phosphatase của các lô chuột thí nghiệm sau 21 ngày điều trị Hình 3. 12. Tóm tắt cơ chế tác dụng của các phân đoạn dịch chiết đến khả năng hạ glucose huyết. 8 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan những gì trình bày trong luận văn là của riêng tôi, dưới sự hướng dẫn của GS. TS. Đỗ Ngọc Liên và không trùng lặp với bất kì một nghiên cứu nào có trước. Hà Nội, ngày 10 tháng 10 năm 2009 Học viên Hoàng Thị Hương Quỳnh LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến GS. TS. Đỗ Ngọc Liên người thầy đã tận tình hướng dẫn, dìu dắt tôi từng bước và tạo điều kiện cho tôi, động viên tôi trong suốt thời gian nghiên cứu. Tôi xin trân trọng cảm ơn TS. Đào Xuân Tân và các cán bộ trung tâm hỗ trợ nghiên cứu khoa học và chuyển giao công nghệ trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, các cán bộ thuộc Trung tâm nghiên cứu khoa học sự sống trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Phòng hóa sinh Bệnh viện 108 đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tiến hành đề tài này. Nhân dịp này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám hiệu, Phòng đào tạo sau đại học, các thầy cô giáo trong khoa Sinh học trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. 9 Cuối cùng tôi cũng xin chân thành cảm ơn các anh chị em học viên cao học, sinh viên, gia đình và người thân đã động viên, khích lệ, giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Hà Nội, ngày 10 tháng 10 năm 2009 Học viên Hoàng Thị Hương Quỳnh 10 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Nhịp sống công nghiệp hiện đại, thói quen dinh dưỡng mất cân bằng…là nguyên nhân của nhiều căn bệnh nguy hiểm như béo phì (Obesity), đái tháo đường (Diabetse mellitus), …. Ngày nay theo thống kê của tổ chức quốc tế theo dõi bệnh béo phì (International Obesity Task Force – IOTF) thế giới có khoảng 1,7 tỉ người thừa cân béo phì [3], [4] và đang có xu hướng trẻ hóa. Bệnh béo phì thường gặp ở các quốc gia phát triển ví dụ như Mỹ có trên 30% người trưởng thành mắc bệnh, Thái Lan có 20%, Hàn Quốc 22%, Singapore 31% [3], [4], [13], [34] và đang dần xuất hiện ở cả các nước đang phát triển. Tại Việt Nam theo thống kê mới nhất của Viện Dinh dưỡng Quốc gia (2007) tỉ lệ người trưởng thành từ 25- 64 tuổi có tình trạng thừa cân béo phì là 16,8%, ở trẻ em là 16,3% và còn tiếp tục gia tăng [3], [31]. Ngày 31/11/2007 Bộ Y tế đã kí quyết định thành lập Trung tâm Dinh dưỡng và Kiểm soát béo phì thuộc Viện Dinh dưỡng, chính thức tuyên chiến với bệnh béo phì [13]. Đái tháo đường (ĐTĐ) là một bệnh nội tiết phổ biến nhất, hiện trên thế giới có trên 200 triệu người mắc bệnh ĐTĐ. Nhìn chung khoảng 4% người trưởng thành được chẩn đoán ĐTĐ vào năm 1985 và ước tính con số này sẽ tăng lên 5,4% vào năm 2025 [4], [18], [37]. Sự gia tăng nhanh chóng tỉ lệ người mắc bệnh làm cho ĐTĐ trở thành một vấn đề sức khỏe lớn vì bệnh có tỉ lệ mắc, chết trầm trọng và quá trình trị liệu lâu dài, đặc biệt là ĐTĐ type 2 một trong những bệnh phổ biến nhất trong bệnh ĐTĐ. Nếu béo phì ảnh hưởng trực tiếp tới sức khỏe, thẩm mỹ và tiềm ẩn nhiều nguy cơ bệnh tật khác như ĐTĐ type 2 (diabetes type 2), bệnh tim mạch, rối loạn lipid máu, sỏi túi mật, gan nhiễm mỡ, viêm khớp mãn tính, đột quỵ … thì ĐTĐ có thể mang đến nhiều biến chứng nguy hiểm hơn nữa như: biến chứng võng mạc, suy thận, biến chứng mạch máu lớn, tổn thương bàn chân dẫn đến cắt cụt …Vì vậy đại đa số người bệnh đều có nhu cầu chữa bệnh một cách an toàn. Mỗi năm nước Mỹ [...]... chiết và đặc tính sinh dược học của một số hợp chất tự nhiên từ cây Hồng Bì ( Clausena lansium Lour.) 2 Mục đích nghiên cứu Luận văn tập trung nghiên cứu thành phần hóa học của cây Hồng Bì (Clausena lansium Lour.) và tác động của nó tới trọng lượng và một số chỉ số hóa sinh, nhằm tạo cơ sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực tìm kiếm thuốc và giải thích tác dụng chữa bệnh của cây. .. chiết các hợp chất từ cây Hồng Bì (Clausena lansium Lour.) 12 2 Khảo sát thành phần các hợp chất tự nhiên có trong vỏ quả Hồng Bì (Clausena lansium Lour.) 3 Nghiên cứu tác dụng các phân đoạn dịch chiết vỏ quả Hồng Bì lên trọng lượng và một số chỉ số lipid máu trên mô hình chuột béo phì thực nghiệm (BPTN) 4 Nghiên cứu khả năng điều hòa đường huyết của các phân đoạn dịch chiết vỏ quả Hồng Bì trên mô... y học cổ truyền Mục tiêu chính của luận văn: 1 Tìm ra quy trình tách chiết và khảo sát thành phần các hợp chất tự nhiên từ mẫu thực vật 2 Đánh giá tác dụng sinh dược học của một số phân đoạn dịch chiết từ mẫu thực vật trên mô hình chuột béo phì và ĐTĐ thực nghiệm 3 Nhiệm vụ nghiên cứu Dựa trên mục tiêu nghiên cứu chúng tôi xác định các nhiệm vụ cụ thể của luận văn như sau: 1 Đưa ra quy trình tách chiết. .. tâm của nhiều nhà hóa học Hơn 50 hợp chất hóa học khác nhau đã được xác định cấu trúc Tuy nhiên vẫn chủ yếu là cấu trúc hợp chất tinh dầu [27] Trong nhiều công trình nghiên cứu tác dụng sinh dược học, chúng tôi chú ý đến công trình nghiên cứu về tác dụng hạ đường huyết của rễ cây Hồng Bì Nam phi (Clausena anisata (Willd) Hook) của Ojewole J.A.O và cộng sự (2002) [66], vỏ thân cây Hồng Bì thật (Clausena. .. là làm tăng sự phân giải glycogen và tăng tân tạo đường mới do đó giảm glucose huyết 1.4 Cây Hồng Bì (Clausena lansium Lour.) Cây Hồng Bì hay còn gọi là Hoàng bì Tên khoa học: Clausena lansium (Lour.) Skells Syn: Clausena wampi (Blanco.) Oliv (tên tiếng Anh là wampi) thuộc họ Cam quýt ( Rutaceae) 1.4.1 Đặc điểm thực vật học Hồng Bì (Clausena lansium Lour.) là một loài cây gỗ nhỏ cao 3 - 5m, cành sần... cây Hồng Bì (Clausena lansium Lour.) có hoạt tính bảo vệ gan [27], chống co thắt của các lansimit [49], chống oxy hóa lipid và bảo vệ não [56] Tác dụng chống ung thư phổi, gan và ung thư tế bào tuyến HELA cũng được nhiều tác giả đề cập đến [67] 1.4.4 Các nghiên cứu về cây Hồng Bì (Clausena lansium Lour.) có tác dụng giảm béo và hạ glucose huyết Hồng Bì (Clausena lansium Lour.) là cây ăn quả, cây thuốc... phỏng type 2 và xác định ảnh hưởng các phân đoạn đến hoạt độ một số enzyme trao đổi glucid 4 Đóng góp mới của đề tài  Đưa ra quy trình tách chiết phân đoạn các hợp chất tự nhiên từ vỏ quả Hồng Bì (Clausena lansium Lour.)  Đánh giá được tác dụng hạ thấp lipid máu của các phân đoạn dịch chiết từ vỏ quả Hồng Bì ở chuột BPTN  Đánh giá được khả năng hạ glucose huyết của các phân đoạn dịch chiết lên mô... chuyển của chất nghiên cứu, b là khoảng di chuyển của dung môi 2.2.3 Nghiên cứu tác dụng của dịch chiết các phân đoạn vỏ quả Hồng Bì lên trọng lượng và một số chỉ số hóa sinh máu của chuột BFTN 2.2.3.1 Thử độc tính cấp, xác định LD50 Xác định LD50 của dịch chiết vỏ quả Hồng Bì bằng đường uống theo phương pháp Lorke [57] Chuột nhịn đói trước 16h thí nghiệm được phân lô ngẫu nhiên N = 10 và cho uống... dụng và hoạt tính sinh học Vỏ rễ Hồng Bì (Clausena lansium Lour.) được dùng để chữa ho, sốt Quả được dùng để ăn, trị tiêu hóa kém, ho nhiều Lá dùng làm thuốc trị cảm cúm, nhiễm lạnh, sốt, viêm não, sốt rét và nhiều khi dùng để gội đầu cho sạch gầu, trơn tóc Rễ và hạt trị đau dạ dày, đau thượng vị, đau thoát vị, đau bụng Hạt Hồng Bì chữa rắn cắn [2], [7], [17], [20] Các hợp chất phân lập từ cây Hồng Bì. .. dược lý của các loài thảo mộc trên thế giới nói chung, Việt Nam nói riêng đã và đang phát triển, mang một tầm quan trọng đặc biệt Dựa trên cơ sở các nghiên cứu về tác dụng dược lý của các cây thuộc họ Cam quýt (Rutaceae) [16], [32], chi Clausena [26], [27], [66] nói chung và một số nghiên cứu trên đối tượng Clausena lansium [33], [50] nói riêng, chúng tôi quyết định chọn đề tài : Nghiên cứu tách chiết . nghiên cứu trên đối tượng Clausena lansium [33], [50] nói riêng, chúng tôi quyết định chọn đề tài : Nghiên cứu tách chiết và đặc tính sinh dược học của một số hợp chất tự nhiên từ cây Hồng Bì. lansium Lour. ) . 2. Mục đích nghiên cứu Luận văn tập trung nghiên cứu thành phần hóa học của cây Hồng Bì (Clausena lansium Lour. ) và tác động của nó tới trọng lượng và một số chỉ số hóa sinh, . DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2  HOÀNG THỊ HƯƠNG QUỲNH NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT VÀ ĐẶC TÍNH SINH DƯỢC HỌC CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT TỰ NHIÊN TỪ CÂY HỒNG