Nghiên cứu tách triết và đặc tính sinh dược học của một số hợp chất tự nhiên từ cây măng cụt (Garcinia mangostana L.) (LV00285)

Mục đích nghiên cứu của đề tài: - Nghiên cứu qui trình tách chiết, đặc tính hoá sinh và sinh học của một số phân đoạn dịch chiết từ lá và vỏ quả măng cụt và tác dụng của chúng lên quá tr

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

––––––––––––––––––––––––––––

NGễ THỊ HỒNG THUí

Nghiên cứu tách chiết và đặc tính sinh dược học của một số hợp chất tự nhiên từ CÂY MĂNG

CụT (garcinia mangostana L.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội – 2009

MỞ ĐẦU

1 Lí do chọn đề tài

Cuộc sống ngày càng phát triển thì con người ngày càng phải đối mặt với những căn bệnh nguy hiểm, đó là mặt trái của xã hội hiện đại Không chỉ trên thế giới mà ngay ở Việt Nam tỉ lệ người mắc bệnh: béo phì, tiểu đường, tim mạch, ung thư…ngày càng gia tăng mạnh mẽ cùng với sự phát triển của xã hội công nghiệp và

đô thị hoá

Hiện nay tình trạng thừa cân và béo phì đang tăng lên với tốc độ báo động không những ở các quốc gia phát triển mà cả ở các quốc gia đang phát triển Đây là mối đe doạ tiềm ẩn của các bệnh rối loạn trao đổi chất và tim mạch trong tương lai Theo tổ chức Quốc tế theo dõi bệnh béo phì (Internation Obesity Tast Force - IOTF) nghiên cứu, hiện nay trên thế giới đã có khoảng 1,7 tỷ người thừa cân và mắc bệnh béo phì [2], [39] Các kết quả điều tra được tiến hành gần đây cho thấy, Mỹ là nước

có số dân béo phì nhiều nhất trên thế giới với khoảng 60 triệu người dân bị béo phì Theo thống kê của Liên đoàn Đái tháo đường quốc tế (1991), tỷ lệ người thừa cân

và béo phì ở một số nước Châu Á như sau: Thái Lan 3,58%, Philipin 4,27%, Malaysia 3,01%, Nam Triều Tiên 2,08%, Đài Loan 1,6%, Hồng Kông 3% [2], [16], [22] Theo điều tra mới nhất của Viện Dinh dưỡng cho thấy tình trạng thừa cân (2007), béo phì ở người Việt Nam đang tăng nhanh, trong đó tỷ lệ béo phì ở người trưởng thành, từ 25-64 tuổi, lên tới 16,8% [8] Bệnh béo phì cũng là một trong các nguyên nhân gây ra các biến chứng về tim mạch, đái tháo đường, mỡ máu, đột quỵ…đã và đang ngày càng gia tăng, thậm chí xuất hiện ở cả trẻ em của các thành phố công nghiệp

Hiện nay, chi phí điều trị bệnh béo phì và các bệnh biến chứng bằng thuốc tân dược rất tốn kém, ví dụ ở Hoa Kỳ trong năm 1997 chi phí cho điều trị bệnh béo phì là 47,6 tỉ đô la [2], [39] Hơn nữa các loại thuốc tân dược được dùng hiện nay trên thị trường thường gây nhiều phản ứng phụ có thể gây nguy hại cho sức khoẻ,

và giá thành rất đắt Trong những năm gần đây có nhiều công trình nghiên cứu về

sử dụng các hợp chất tự nhiên từ cây cỏ để chữa bệnh béo phì và đái tháo đường,

các loại thuốc dược liệu từ cây cỏ thường ít gây ra tác dụng phụ, đồng thời tác dụng của thuốc có hiệu quả kéo dài [6], [12], [15], [24], [28], [41], [42]

Việt Nam có hệ thực vật vô cùng phong phú và đa dạng, trong đó có nhiều loài chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học cao có tác dụng chữa bệnh Trong kinh nghiệm dân gian người Việt ta đã biết sử dụng cỏ cây, nguồn thảo dược tự nhiên để chữa bệnh, bảo vệ sức khoẻ Tuy nhiên, các hợp chất tự nhiên từ các cây thuốc cổ truyền dân tộc chống béo phì và một số bệnh biến chứng rối loạn trao đổi chất như đái tháo đường, tim mạch… mặc dù rất phong phú ở nước ta nhưng chưa được khai thác và nghiên cứu đầy đủ về cơ chế hoá sinh và dược lý

Trong số các loại dược thảo thiên nhiên thì Măng cụt là một loại cây trái có

nhiều tác dụng dược lý quan trọng giúp cho người sử dụng tăng cường được hệ miễn dịch có thể chống lại bệnh tật một cách hữu hiệu như: kháng khuẩn, chống

ĐTĐ, tim mạch Vỏ Măng cụt đã từng là một phương thuốc trị bệnh tại các nước vùng Đông Nam Á như Thái Lan, Mã Lai, Việt Nam Chính vì vậy, tôi quyết định

chọn đề tài nghiên cứu khoa học là: “Nghiên cứu tách chiết và đặc tính sinh dược học của một số hợp chất tự nhiên từ cây Măng cụt (Garcinia mangostana L.)”

2 Mục đích nghiên cứu của đề tài:

- Nghiên cứu qui trình tách chiết, đặc tính hoá sinh và sinh học của một số phân đoạn dịch chiết từ lá và vỏ quả măng cụt và tác dụng của chúng lên quá trình trao đổi lipid – glucid ở mô hình chuột béo phì và rối loạn trao đổi chất

- Xác định được phân đoạn dịch chiết có tác dụng chống béo phì và rối loạn trao đổi chất trên mô hình chuột đã được gây bệnhbéo phì

- Xác định khả năng kháng khuẩn đối với các chủng vi khuẩn Gram (-), Gram (+) gây nhiễm độc thực phẩm

3 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu qui trình tách chiết, tinh chế phân đoạn dịch chiết và một số hợp chất tự nhiên có tác dụng chống béo phì, chống tăng glucose huyết từ lá và vỏ quả măng cụt

- Nghiên cứu tạo mô hình chuột béo phì và rối loạn trao đổi glucid – lipid

- Nghiên cứu tác dụng hoá sinh của một số phân đoạn dịch chiết từ vỏ quả và

lá măng cụt trong trao đổi glucid – lipid ở chuột béo phì

- Nghiên cứu đáp ứng dược lý (liều độc LD50) của một số phân đoạn dịch chiết vỏ quả và lá măng cụt lên chuột béo phì thực nghiệm bằng đường uống

- Nghiên cứu đáp ứng trao đổi lipid – glucid (biểu hiện LDLC, VLDLC, triglycerid, cholesterol, glucose máu…) và đáp ứng protein miễn dịch của chuột béo phì thực nghiệm trước và sau khi được xử lý dịch chiết vỏ quả và lá măng cụt

4 Đối tượng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu

4.1 Đối tượng nghiên cứu

4.1.1 Mẫu thực vật

- Lá măng cụt (Garcinia mangostana L.)

- Vỏ quả măng cụt (Garcinia mangostana L.)

4.1.2 Mẫu động vật

Chuột nhắt trắng 4 tuần tuổi, cân nặng từ 14 – 16 g (Mus musculus chủng

Swiss) được mua của Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương

4.1.3 Mẫu vi sinh vật

- Vi khuẩn Gr âm: E coli, Salmonella typhi

- Vi khuẩn Gr dương: Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus

4.2 Phạm vi nghiên cứu của đề tài

Nghiên cứu tách chiết và đặc tính sinh dược học của một số phân đoạn dịch chiết (cao ethanol, cao n- hexan, cao chloroform, cao ethyl acetat) của vỏ quả và lá măng cụt, tác dụng chống rối loạn trao đổi lipid – glucid trên mô hình chuột gây béo phì thực nghiệm và tác dụng kháng một số chủng vi sinh vật

5 Phương pháp nghiên cứu

5.1 Khảo sát sơ bộ thành phần hoá học của cây măng cụt bằng các phản ứng hoá học đặc trưng

- Thử định tính flovanoid

- Thử định tính tannin

- Thử định tính glycoside

- Thử định tính alkaloid

- Thử định tính sapomin

5.2 Định lượng polyphenol tổng số theo phương pháp Folin Ciocalteau [31]

5.3 Phương pháp gây béo phì thực nghiệm cho chuột nhắt trắng chủng Mus musculus Swiss

5.4 Nghiên cứu tác dụng chống béo phì của dịch chiết vỏ quả và lá măng cụt trên

mô hình chuột béo phì thực nghiệm

- Thử độc tính cấp, xác định LD50 bằng đường uống

- Phương pháp xác định các chỉ số hoá sinh trong máu chuột: glucose huyết, cholesterol, triglycerid, HDLC, LDLC

5.5 Phương pháp phân tách các hợp chất bằng sắc kí lớp mỏng

5.6 Phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

- Phương pháp nuôi cấy và bảo quản vi sinh vật

- Đo vòng vô khuẩn khi xử lý bằng dịch chiết

5.7 Phương pháp xử lý số liệu: xác suất thống kê toán học (sử dụng Microsoft –

Excell)

6 Đóng góp mới của đề tài: Tách chiết được một số phân đoạn dịch chiết từ vỏ quả và lá măng cụt có tác dụng chống rối loạn trao đổi lipid – glucid trên mô hình chuột béo phì và khả năng kháng khuẩn Gr (-), Gr (+) gây ngộ độc thực phẩm

NỘI DUNG Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Các hợp chất phenol và polyphenol

1.1.1 Cấu tạo hóa học và phân loại

Hợp chất phenol là nhóm các hợp chất hóa học mà trong công thức hóa học

có chứa nhóm chức hydroxyl (-OH) gắn với vòng hydrocacbon thơm Các hợp chất này phổ biến trong giới thực vật Nhóm hydroxyl là nhóm phản ứng chủ yếu của các phenol Tùy thuộc vào số lượng và vị trí tương hỗ của các nhóm này mà các tính chất lý hóa hoặc hoạt tính sinh học thay đổi [34]

Dựa theo số lượng nhóm hydroxyl mà người ta phân biệt thành phenol một, hai, ba và polyphenol Polyphenol thực vật có thể phân chia thành flavonoid, axit phenolic và tannin…

Hợp chất phenol được hình thành một cách dễ dàng trong tất cả các cơ quan thực vật từ những sản phẩm đường phân và chu trình pentoza qua axit xikimic hay theo con đường acetat malonat qua acetyl-SCoA Cả hai con đường này đều tham gia vào quá trình hình thành flavonoid Nhiều chất phenol hòa tan trong nước được tổng hợp trong lục lạp

1.1.2 Vai trò của các hợp chất phenol và polyphenol thực vật

Các hợp chất phenol và polyphenol thực vật có vai trò quan trọng trong hóa học, sinh học, nông nghiệp và y khoa [10]

- Phenol tham gia vào quá trình hô hấp như là chất vận chuyển hyđro

- Các polyphenol có thể hình thành liên kết hyđro với các protein và enzym làm thay đổi hoạt động của các enzym này với vai trò gây hiệu ứng dị lập thể, mang tính chất tự điều hòa, do đó làm tăng hoặc giảm hoạt động của enzym

- Phenol có tác dụng mạnh lên quá trình sinh trưởng của thực vật Phenol đóng vai trò là chất hoạt hóa IAA - oxydaza, nó còn tham gia vào sự sinh tổng hợp enzym này Phenol được coi như là chất điều khiển các chất sinh trưởng ở thực vật

- Các hợp chất phenol có tính kháng khuẩn Những phenol bảo vệ thường không có ở cây khỏe Nó được hình thành như những phản ứng tự vệ đối với các vết thương do vi khuẩn gây bệnh tạo nên (như phản ứng kháng nguyên-kháng thể ở động vật và người) Các hợp chất phenol có vai trò quan trọng trong việc liền sẹo do vết thương cơ giới ở thực vật Nó có tác dụng làm nhanh quá trình tái sinh, bảo vệ bức xạ, chống lại các gốc tự do, chống các tác nhân gây đột biến và các chất gây oxy hóa

- Polyphenol được coi là hợp chất chống oxy hóa tiềm tàng do chúng có khả năng dọn dẹp các gốc tự do trong cơ thể, ức chế sự oxy hóa của α-tocopherol trong cholesterol xấu, tái chế α-tocopherol đã bị oxy hóa và loại bỏ các ion kim loại

- Các flavonoid như flavonol và antoxyan có vai trò trong việc điều chỉnh sự phân bố năng lượng ánh sáng ở lá cây, làm tăng hiệu quả quang hợp Một số hợp chất polyphenol tạo ra màu sắc tự nhiên của hoa quả nhằm hấp dẫn động vật thụ phấn cho hoa

1.1.3 Một số polyphenol quan trọng trong thực vật

a Đặc điểm cấu tạo hoá học của flavonoid

Flavonoid có cấu trúc chung là C6-C3-C6, gồm hai vòng thơm benzen A, B và

dị vòng-pyranC, trong đó vòng A kết hợp với vòng C tạo thành khung chroman

B 1' 2' 3'4'

5' 6' 1 2

3 4 5

O 4

A B C Hình 1.2 Cấu trúc chung của flavonoid(A), izoflavonoid(B) và neoflavonoid(C)

* flavonoid:

Trong thực vật flavonoid tồn tại ở hai dạng: dạng tự do (aglycon) và dạng liên kết (glycozit) Glycozit bị thủy phân bằng axit hoặc bazơ sẽ giải phóng đường

và aglycon

Ví dụ: Rutin Quecetin + Glucose + Rhamnoza

Có khoảng 4000 hợp chất flavonoid đã được biết đến Tùy theo mức độ oxy hóa của mạch 3 cacbon, sự có mặt hay không có mặt của nối đôi giữa C2 và C3, nhóm cacbonyl ở C4 mà có thể phân flavonoid thành các nhóm phụ sau:

- Flavan: không có nối đôi ở C2 = C3, không có nhóm cacbonyl ở C4, không

- Flavon: Có nối đôi ở C2 = C3, có nhóm cacbonyl ở C4, không có nhóm hyđroxyl ở C3 (ví dụ như luteolin) Trong phân tử flavon có liên kết đôi và nhóm cacbonyl tạo thành hệ thống nối đôi liên hợp Đặc điểm này là nguyên nhân gây nên màu vàng chanh của flavon

Các flavon có quang phổ hấp thụ cực đại ở vùng 320-350nm

- Flavonol: Có nối đôi ở C2 = C3, có nhóm cacbonyl ở C4, có nhóm hyđroxyl

- Flavanon: Không có nối đôi giữa C2 = C3, có nhóm cacbonyl ở C4, không

có nhóm hyđroxyl ở C3 (ví dụ: naringenin) Các flavanon có quang phổ hấp thụ tia

Các flavanon nằm trong cân bằng hỗ biến với các chalcol do vòng dihydropyron của flavanon kém bền nên dễ xảy ra mở vòng chuyển thành chalcol

O

O

O H H

O H

O

+

- Flavonoid phụ và các dẫn xuất của flavonoid:

+ Chalcol: Chalcol khác với các loại flavonoid khác là nhóm chalcol có

phân tử gồm 2 vòng benzen A và B được nối với nhau bởi một mạch hở có 3 nguyên tử cacbon, số thứ tự các nguyên tố bắt đầu được đánh từ vòng B Công thức cấu tạo chung của chalcol:

O

C h a l c o l

1 2 3 4 5 6

1,

2,

3,

4, 5,

6,

Hiện nay, người ta đã biết đến khoảng 20 hợp chất chalcol Chalcol có thể bị đồng phân hoá thành flavanon khi đun nóng với acid chlohydric (HCl)

+ Auron: là hợp chất có vòng cacbon là một dị vòng 5 cạnh Công thức cấu

tạo chung của nhóm auron là:

O

C H O

A u r o n

Auron có màu vàng đậm và không tạo màu khi thực hiện phản ứng Shinoda

(phản ứng định tính flavonoid) Trong tự nhiên, các chalcol – glycoside dễ bị oxi

hoá thành auron – glycoside nên hai nhóm chất này tồn tại cạnh nhau

+ Catechin: Catechin là dẫn xuất của flavan-3-ol Do có hai trung tâm

cacbon bất đối nên chúng tồn tại dưới dạng hai cặp đồng phân đối quang Ví dụ như

các cặp catechin và epicatechin Trong đó chỉ có (+)- catechin và (-)- epicatechin

xuất hiện trong thiên nhiên

Catechin có nhiều trong quả và lá chè Catechin và leucoantoxyanidin có phổ

tử ngoại giống nhau, hấp thụ cực đại ở vùng 270-280nm

O H

(-)- epicatechin

- Leucoantoxyanidin (flavan-3,4-diol): Leucoantoxyanidin có 3 cacbon bất

đối, vì vậy chúng tồn tại ở các dạng đồng phân quang học khác nhau

- Các biflavonoid: Trong thiên nhiên thường gặp các hợp chất thuộc nhóm

biflavonoid Đây là kết quả ngưng tụ hai phân tử flavonoid, ví dụ như amentoflavon

A m e n t o f l a v o n

* Isoflavonoid: bao gồm các dẫn xuất của 3 – phenyl chroman, được chia

thành các nhóm nhỏ sau:

Nhìn vào cấu tạo chung của rotenoid thấy chúng có quan hệ chặt chẽ với isoflavon về mặt cấu trúc Khung cacbon được mở rộng thêm một nguyên tử cacbon nên có thể tạo thêm một vòng pyran thứ hai

b Hoạt tính sinh học của flavonoid

Các hợp chất flavonoid thường gặp trong tự nhiên, phân bố phổ biến trong thực vật Việc nghiên cứu hoạt tính sinh học của flavonoid được quan tâm đặc biệt vì giá trị to lớn của nó đối với đời sống con người và dưới đây là một số hoạt tính sinh học chính của flavonoid

* Tác dụng làm bền thành mạch [16]

Các flavonoid có hoạt tính của vitamin P như rutin, hesperindin… có tác dụng làm tăng sức bền và tính đàn hồi của thành mao mạch, giảm sức thẩm thấu các hồng cầu qua thành mạch Hoạt tính này được ứng dụng trong chữa trị các rối loạn chức năng tĩnh mạch, giãn hay suy yếu tĩnh mạch, trĩ, rối loạn tuần hoàn võng mạc

Một số flavonoid có ảnh hưởng trên hệ tim mạch, dùng trong dự phòng các bệnh này Các nhà khoa học đã thử nghiệm proantoxyanidin có trong hạt nho trên

xơ vữa động mạch in vivo, kết quả cho thấy chất này ức chế sự phát triển bệnh xơ

vữa động mạch ở thỏ ăn cholesterol

* Tác dụng chống oxy hóa [23]

Flavonoid có khả năng kìm hãm các quá trình oxy hóa dây chuyền sinh ra bởi gốc tự do hoạt động Tuy nhiên hoạt tính này thể hiện mạnh hay yếu phụ thuộc vào đặc điểm cấu tạo hóa học của từng chất flavonoid cụ thể Do bản chất cấu tạo polyphenol nên flavonoid ở trong tế bào thực vật hoặc trong cơ thể động vật chịu tác động của các biến đổi oxy hóa  khử, bị oxy hóa từng bước và tồn tại ở các dạng hydroxyl  semiquinon  quinon Những flavonoid có các nhóm hydroxyl sắp xếp ở vị trí octo dễ dàng bị oxy hóa dưới tác dụng của các enzym polyphenoloxydaza và peroxydaza có trong tế bào động vật, thực vật, phản ứng như sau:

O2 + Flavonoid (khử) Flavonoid (oxy hóa) (Hydroquinon) (Semiquinon hoặc quinon)

H2O2 + Flavonoid (khử) Flavonoid (oxy hóa) (Hydroquinon) (Semiquinon hoặc quinon)

Semiquinon hoặc quinon là những gốc tự do bền vững, gọi là gốc phenoxy,

ký hiệu là ArO*, chúng có thể nhận điện tử và hydro từ chất cho khác nhau để trở lại dạng hydroquinon Các chất này có khả năng phản ứng với các gốc tự do hoạt động sinh ra trong quá trình sinh lý và bệnh lý để triệt tiêu chúng

Các gốc tự do sinh ra trong cơ thể ít bền và có khả năng phản ứng rất lớn Phản ứng của chúng là nguyên nhân sinh ra quá trình peroxy hóa các chất hữu cơ Các gốc *OH và oxy đơn bội 1O2 thường là tác nhân khơi mào phản ứng Tiếp đó, các gốc thứ cấp phản ứng với các phân tử mới khác ở cạnh, tạo ra phản ứng dây chuyền, cứ thế nhân mãi lên, không dừng lại và kéo dài cho đến khi tiêu tốn hết cơ chất (không có enzym tham gia) Vì thế, các cơ quan tổ chức bị phá hủy nghiêm trọng gây nên những biến đổi bệnh lý như ung thư, hoại tử, rối loạn chuyển hóa

polyphenoloxydaza

Peroxydaza

Ngoài các gốc tự do sinh ra trong quá trình sinh lý bình thường, cơ thể còn bị ảnh hưởng của các dạng oxy hóa hoạt động phát sinh bởi các yếu tố bên ngoài như: tia tử ngoại, bức xạ mặt trời, thuốc trừ sâu diệt cỏ, các phẩm nhuộm, các stress Để chống lại tác hại của các gốc tự do, mỗi cơ thể sống có những hệ thống chống oxy hóa nội sinh Tuy nhiên, theo các nhà khoa học thì các gốc tự do có thể là nguyên nhân phá hủy ADN, protein và lipid bất chấp hệ thống chống oxy hóa tự nhiên trong

cơ thể

Ngoài ra, flavonoid còn có tác dụng bảo vệ các hệ thống sinh học nhờ có khả năng tạo phức với các kim loại chuyển tiếp như Fe2+, Cu2+… hoạt hoá enzim chống oxy hóa, làm ức chế oxydaza

Với tính chất chống oxy hóa, flavonoid đã thể hiện tác dụng bảo vệ chức năng gan tích cực Flavonoid đóng vai trò chủ yếu trong những liệu pháp phức tạp

để điều trị viêm gan cấp, mãn tính và xơ gan Chúng giúp bảo toàn hoạt độ các enzym có chức năng tạo cầu nối pentoza, các enzym của chu trình axit tricacboxylic

và của quá trình β-oxy hóa các axit béo trong gan, tăng cường chức năng chống độc của gan, ngăn chặn sự phân hủy phospholipid do phospholipaza A gây ra, ngăn cản

sự nhiễm mỡ gan và hoại tử mô gan

* Tác dụng với các enzym [34]

Các hợp chất phenol nói chung và flavonoid nói riêng có thể tương tác với các protein, phản ứng ấy thường xảy ra giữa nhóm cacbonyl và hydroxyl của nhóm peptid hình thành liên kết hydro

Nhờ có tính chất này mà các flavonoid có thể làm thay đổi nhiều hoạt tính enzym Năm 1929, A.I.Oparin và A.L.Kursanop đã phát hiện ra rằng các polyphenol trong đó có flavonoid có khả năng ức chế nhiều loại enzym nhưng tính chất này không hoàn toàn đặc hiệu và nó có thể ức chế enzym này nhưng đồng thời

có thể làm tăng hoạt độ của một số enzym khác

Thông qua tác động lên hoạt tính enzym, một số chất phenol có khả năng làm tăng hoặc giảm sinh tổng hợp protein ở giai đoạn đầu Kết quả nghiên cứu của

nhiều tác giả đã xác nhận một số hợp chất phenol tham gia vào sự điều hòa sinh tổng hợp protein trong tế bào thực vật

Các công trình nghiên cứu về ảnh hưởng của flavonoid đối với các enzym

động vật (in vitro) cho biết, chúng có tác dụng ức chế nhiều enzym như:

histidin-decacboxylaza, kìm hãm không đặc hiệu phosphodiesteraza của AMP vòng, reductaza Bên cạnh tác dụng kìm hãm, nhiều flavonoid có khả năng làm tăng hoạt tính prolin-hydroxylaza là một enzym quan trọng trong quá trình làm lành các vết thương và tạo sẹo Dưới tác dụng của các flavonoid lên các enzym sinh học là một trong những cơ sở hóa sinh để định hướng cho việc sử dụng các chất flavonoid thiên nhiên vào lĩnh vực sinh-y học phục vụ sức khỏe và đời sống con người

aldose-* Tác dụng kháng khuẩn

Flavonoid có khả năng kháng nhiều loại vi khuẩn khác nhau như E coli, Salmonella typhi, anti-bacterium…Chúng có khả năng ức chế và tiêu diệt vi khuẩn với phổ kháng khuẩn rất rộng

* Tác dụng làm giảm béo phì và lipid máu

Theo kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học Nhật Bản cho thấy khi chuột

béo phì được điều trị bằng dịch chiết lá bằng lăng (Lagerstroemia speciosa L.) thì

trọng lượng giảm đáng kể (~10%) [41] Thí nghiệm với flavonoid chiết xuất từ hoa kim ngân trên huyết tương chuột cống trắng uống cholesterol thực nghiệm, cũng cho thấy flavonoid có tác dụng làm giảm chỉ số cholesterol toàn phần, triglycerid và cholesterol tỷ trọng thấp hại cho tim, đồng thời làm tăng lipid-cholesterol có tỷ trọng cao (HDLc) có lợi cho tim [15] Naringin, một flavonoid có hàm lượng cao trong các cây họ Cam chanh (Rutaceae) đã được nhiều nhà nghiên cứu chiết suất cũng như thử tác dụng trên mô hình chuột béo phì (bằng chế độ ăn hàm lượng lipid

và cholesterol cao) Kết quả nghiên cứu cho thấy naringin có khả năng làm giảm cholesterol tự do, cholesterol tỷ trọng thấp (LDLc) cũng như giảm triglycerid trong máu của chuột béo phì [25, 29, 30]

1.1.3.2 Tannin

* Khái niệm: Tannin là những hợp chất phenolic rất phổ biến trong thực vật

bậc cao Horvath (1981) đã đưa ra khái niệm về tannin như sau: “ tannin là những hợp chất phenolic có trọng lượng phân tử cao, có chứa các nhóm hidroxyl và các nhóm chức khác (chẳng hạn như nhóm cacbonxyl), có khả năng tạo phức với protein và các phân tử lớn khác trong điều kiện đặc biệt” [5]

* Cấu tạo hoá học và tính chất: tannin được cấu tạo dựa trên acid tannic và

acid gallic, phổ biến trong cây ở dạng tự do hoặc ở dạng glycoside kết hợp với đường

và muối khoáng

* Chức năng sinh học: Tannin là các chất bảo vệ cho cây trước sự tấn công

của vi sinh vật gây bệnh, các loài động vật và côn trùng ăn lá [32], [37] Trong y học tannin được sử dụng làm thuốc cầm máu, thuốc chữa đi ngoài, chữa ngộ độc kim loại nặng, thuốc chống ung thư, thuốc chữa trĩ, viêm miệng, viêm hang, điều trị chứng cao huyết áp và chứng đột quỵ [21]

1.2 Bệnh béo phì

1.2.1 Bệnh béo phì và tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO) béo phì là tình trạng tích lũy mỡ quá mức

và không bình thường tại một vùng cơ thể hay toàn thân đến mức ảnh hưởng tới sức khỏe Người bị thừa cân và đạt mức bệnh béo phì có thể được đánh giá theo chỉ số thể trọng BMI (Body Mass Index) và được tính theo công thức sau:

Bảng 1.1 Phân loại BMI của người trưởng thành Châu Âu và Châu Á [2]

Quá cân ≥ 25-29.9  23 Nguy cơ tăng cân

Béo phì độ I 30-34.9 >23-24.9 Nguy cơ cao của bệnh béo phì

Béo phì độ II 35-39.9 25-29.9 Nguy cơ nặng của bệnh béo phì

Béo phì độ III ≥ 40 >30 Nguy cơ rất nặng của bệnh béo phì

Theo tổ chức Quốc tế theo dõi bệnh béo phì (Internation Obesity Tast Force- IOTF) cho biết, ngày nay trên thế giới đã có khoảng 1,7 tỷ người thừa cân và mắc bệnh béo phì Như vậy trên thế giới cứ 4 người trưởng thành thì có một người béo phì, chiếm khoảng 25% [2] Các kết quả điều tra được tiến hành gần đây cho thấy,

Mỹ chính là nước có số dân béo phì nhiều nhất trên thế giới Theo Hiệp hội Béo phì

Mỹ, hiện nay có khoảng 60 triệu người dân Mỹ bị béo phì, tăng gần gấp 3 lần so với năm 1991 (25 triệu người) Nước sát ngay Mỹ là Canada thì xu hướng tăng cân cũng đã trở nên rất phổ biến trong dân chúng nước này (1/3 người dân Canada bị béo phì) Còn ở châu Mỹ, chính phủ Braxil cho biết 40% dân chúng ở độ tuổi hơn

20 (khoảng 38,8 triệu người) bị thừa cân do tiêu thụ đường, đồ uống nhẹ và thực phẩm giàu chất béo tăng, khoảng 16% dân số (10,5 triệu người) bị béo phì

Trong khi đó, ở châu Á, theo báo cáo của chính phủ Trung Quốc, tốc độ gia tăng của tình trạng béo phì ở Trung Quốc đã lên tới 97% trong 10 năm qua Tổ chức dinh dưỡng chính thức đầu tiên của Trung Quốc và cơ quan khảo sát sức khỏe cho biết từ giữa năm 1992 đến năm 2002, đã có hơn 60 triệu người bị béo phì Đặc biệt

ở những thành phố lớn của Trung Quốc, 12% thanh thiếu niên và 8% trẻ em mắc bệnh béo phì Theo thống kê của Liên đoàn Đái tháo đường quốc tế (1991), tỷ lệ người thừa cân và béo phì ở một số nước Châu Á như sau: Thái Lan 3,58%, Philipin 4,27%, Malaysia 3,01%, Nam Triều Tiên 2,08%, Đài Loan 1,6%, Hồng Kông 3% [2]

Ở Việt nam tỉ lệ số người mắc thừa cân và béo phì đang có chiều hướng gia tăng cùng với sự phát triển của nền kinh tế xã hội Đây cũng chính là bằng chứng về nguyên nhân các bệnh huyết áp cao, rối loạn chuyển hóa lipid và đái tháo đường… đang tăng lên trong những năm gần đây

Theo Phan Sĩ Quốc, Lê Huy Liệu và cộng sự (1991) điều tra ngẫu nhiên 4.912 người từ 15 tuổi trở lên sống ở hai khu vực nội thành và ngoại thành Hà nội (1991) cho thấy tỷ lệ mắc bệnh thừa cân và béo phì chung ở Hà nội là 1,1%, trong nội thành 1,44% và ngoại thành là 0,63% [14]

Năm 1997, theo nghiên cứu của Mai Thế Trạch điều tra trên 5.416 người từ

15 tuổi trở lên ở thành phố Hồ Chí Minh, tỷ lệ người thừa cân và béo phì chung là 2,52%

Năm 2000, sau khi tiến hành điều tra ngẫu nhiên 2.017 người từ 16 tuổi trở lên sống ở Hà nội, dựa theo tiêu chuẩn chẩn đoán của Tổ chức y tế thế giới năm

1998, Tô Văn Hải và cộng sự đã xác định tỷ lệ người thừa cân và béo phì ở Hà nội

là 2,62%, tăng 2,5 lần trong vòng 10 năm

Điều tra mới nhất của Viện dinh dưỡng (2007) cho thấy tình trạng thừa cân, béo phì ở người Việt nam đang tăng nhanh, trong đó tỷ lệ béo phì ở người trưởng thành (từ 25-64 tuổi) lên tới 16,8% Theo Viện trưởng Viện Dinh dưỡng Nguyễn Công Khẩn, kết quả khảo sát cũng cho thấy tình trạng thừa cân, béo phì tăng nhanh nhất ở lứa tuổi từ 45 trở lên (chiếm 2/3 số người bị thừa cân, béo phì) và tỷ lệ béo phì ở người dân thành thị cao gấp 3 lần so với nông thôn [8]

1.2.2 Các yếu tố gây tình trạng thừa cân và béo phì

a Yếu tố di truyền [8], [33]

Theo một số nhà nghiên cứu đều cho rằng yếu tố di truyền có vai trò quan trọng trong việc xuất hiện bệnh thừa cân và béo phì Để minh chứng cho điều này bác sĩ Jeffrey Fridman (Đại học Rockefeller ở New York) khám phá ra một gien gọi

là OB ở loài chuột béo phì Tại mô mỡ của loài chuột này xuất hiện chất có tên là leptin - một loại protein hormon điều chỉnh cân nặng Leptin làm nhiệm vụ truyền lên não thông tin về sự no, thiếu leptin con vật ăn mãi mà không có cảm giác no gây

ra béo phì Vài tháng sau đó cũng nhóm nghiên cứu này tìm được gien tương ứng ở người, cũng gọi là OB, nằm ở nhiễm sắc thể số 7 Điều thú vị là khi định lượng leptin ở những người bị béo phì người ta thấy nồng độ chất này tăng cao Điều này

có 2 lý do: hoặc là sự suy giảm những thụ thể tiếp nhận leptin ở não, hoặc là cơ thể người béo phì sinh ra một chất kháng leptin khiến chất này không ức chế cảm giác thèm ăn được

Một nghiên cứu ở Thái Lan trên trẻ 6-13 tuổi (1996) cho thấy tỷ lệ con cái có cha mẹ béo phì bị béo phì nhiều gấp 3,1 lần so với những trẻ có cha mẹ không bị béo phì Trong số trẻ béo phì, khoảng 80% có cha hoặc mẹ không béo phì, 30% có

cả cha và mẹ béo phì Tuy nhiên trên cộng đồng, vai trò của những yếu tố di truyền này không lớn

b Yếu tố nội tiết [2]

Các nhà khoa học đã tìm thấy có nhiều hormon liên quan đến bệnh béo phì

và được chia thành hai nhóm chính sau:

- Nhóm làm giảm ăn gồm: Serotonin, Pro-opiomelanocortin (POMC), alpha Melatocyte Stimulating hormon (alpha MSH) và Cocain Amphetamin Regulated Transcrip (CART)

- Nhóm gây kích thích ăn gồm: Norepinephrine, Neuropeptid Y và Agouti Related protein (AgRP), Ghrelin

c Khẩu phần ăn và thói quen ăn uống [2],[ 8]

Khi chế độ ăn cung cấp năng lượng vượt quá nhu cầu, nếp sống làm việc tĩnh tại, ít tiêu hao năng lượng sẽ làm cân nặng cơ thể tăng lên Các nghiên cứu cho rằng chỉ cần ăn dư 70 calo mỗi ngày sẽ dẫn tới tăng cân mặc dù số calo này nhỏ có thể không nhận ra dễ dàng, nhất là khi ăn những thức ăn giàu năng lượng Thói quen ăn nhiều thức ăn giàu lipid, các chất bột, đường, ăn nhiều vào buổi tối…sẽ làm tăng tích luỹ năng lượng dự trữ dưới dạng triglycerid (mỡ) dẫn tới thừa cân và béo phì

d Yếu tố kinh tế xã hội [2]

Ở các nước đang phát triển, tỉ lệ người béo phì ở tầng lớp nghèo thường thấp (do nguồn cung cấp thực phẩm còn hạn chế, lao động chân tay nặng, phương tiện đi lại thô sơ) và béo phì được coi là bệnh của người giàu Ngược lại, ở các nước phát triển khi thiếu ǎn không còn phổ biến nữa thì tỉ lệ béo phì lại cao ở tầng lớp người lao động nghèo, ít học so với ở các tầng lớp khá giả hơn do thói quen ăn uống thiếu khoa học của họ

Ở Việt Nam, tỷ lệ người béo tuy còn thấp nhưng đang có khuynh hướng gia tǎng nhanh ở các đô thị và thành phố lớn Đây là điều cần được chú ý để có các can thiệp kịp thời nhằm nâng cao sức khỏe cộng đồng

1.2.3 Một số chỉ số hóa sinh liên quan đến rối loạn trao đổi chất lipid và glucid

Lipid là những este của acid béo Lipid chủ yếu có mặt trong huyết tương là acid béo, triglycerid, cholesterol và phospholipid Một số thành phần khác của lipid

có khả năng hòa tan trong huyết tương và có mặt với số lượng ít hơn rất nhiều nhưng giữ vai trò sinh lý quan trọng, bao gồm các hormon steroid, các vitamin tan trong mỡ

Nồng độ lipid trong huyết tương cao, đặc biệt là cholesterol liên quan đến nguyên nhân gây ra các trạng thái bệnh lý xơ vữa động mạch, bệnh lý tim mạch (bệnh mạch vành, bệnh mạch não, bệnh mạch ngoại vi…), béo phì, tiểu đường type 2…[12]

* Cholesterol

Cholesterol là steroid chính của con người, có mặt trong tất cả các tế bào và hầu hết các dịch trong cơ thể Trong cơ thể cholesterol chủ yếu ở dạng tự do (chưa este hóa), chính dạng này là thành phần cấu trúc của các màng tế bào Các cholesterol este trong tế bào bình thường là kho dữ liệu và xuất hiện trên vi thể là các giọt ở bên trong tế bào Cholesterol được tạo ra từ hai nguồn chính: cơ thể tự sản xuất ra (gan sản xuất , chiếm 80%) và do thức ăn cung cấp Cholesterol đóng vai trò là một tiền chất để tổng hợp các hormon steroid (các hormon sinh dục,

hormon tuyến thượng thận và vitamin D), các axit mật và muối mật

Cholesterol thực chất không hoà tan trong máu, nên khi lưu thông trong máu chúng được bao quanh bởi một lớp áo protein (lipoprotein), chúng giống như những chiếc xe vận tải chở cholesterol Có hai loại lipoprotein quan trọng là lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL – Low density lipoprotein) và lipoprotein tỷ trọng cao (HDL – Hight density lipoprotein) LDL có vai trò vận chuyển cholesterol một chiều từ gan đến các mô của cơ thể, vì vậy khi lượng LDL trong máu cao, thành mạch sẽ bị đóng

mỡ gây xơ vữa động mạch, do đó chúng được gọi là cholesterol “xấu” Ngược lại, HDL vận chuyển cholesterol dư thừa từ các mô và trong mạch máu đưa trở về gan, chuyển giao cho mật để thải ra ngoài, ngăn không cho chúng xâm nhập vào thành động mạch, chúng là cholesterol “tốt”

* Triglycerid

Triglycerid trong mô mỡ là nguồn dự trữ năng lượng chủ yếu của cơ thể Triglycerid có nguồn gốc ngoại sinh và nội sinh Khoảng 90% triglycerid trong huyết tương có nguồn gốc ngoại sinh từ các bữa ăn giàu lipid Triglycerid nội sinh được tổng hợp ở gan và mô mỡ Ở người béo phì, nồng độ acid béo tự do và triglycerid trong máu tăng cao gây ra hiện tượng “nhiễm độc mỡ”, có thể gây chết cho tế bào không phải là tế bào mỡ (trong đó có tế bào β tuyến tuỵ) [2], [33]

1.2.4 Rối loạn lipid máu và thuốc điều trị [12]

Người ta nhận thấy có mối tương quan thuận giữa mức tiêu thụ chất béo bão hòa với nồng độ cholesterol máu: người có thói quen ăn nhiều mỡ có hàm lượng cholesterol máu cao hơn người có thói quen ăn ít mỡ, đồng thời tỷ lệ người mắc bệnh lý liên quan tới tăng lipid máu như xơ vữa động mạch, bệnh tim mạch…cũng cao hơn

Năm 1965, Fredrickson căn cứ vào kỹ thuật điện di và siêu ly tâm đối với các thành phần lipid huyết thanh đã phân hội chứng tăng lipid máu làm 5 type dựa trên những thay đổi của thành phần lipid (bảng 1.2) Bảng phân loại này trở thành phân loại quốc tế của WHO từ năm 1970

Bảng 1.2 Phân loại rối loạn lipid máu theo Fredickson [12]

Nhóm thuốc làm giảm hấp thu và tăng thải trừ lipid: Cholestyramin,

colestipol, neomycin… là những thuốc có tính hấp thu mạnh, tạo phức hợp với acid mật, làm giảm quá trình nhũ hóa lipid ở ruột, dẫn đến sự giảm hấp thu và tăng đào thải lipid qua phân Ngoài ra, chúng còn có tác dụng tăng số lượng và hoạt tính của receptor LDLC ở màng tế bào

Nhóm thuốc ảnh hưởng đến sinh tổng hợp lipid: gồm dẫn xuất của acid

fibric, dẫn xuất của statin, acid nicotinic… Nhóm fibrat giảm vận chuyển acid béo

về gan, giảm tổng hợp và giảm sự oxy hóa LDLC, thuốc còn có tác dụng giảm sự kết tập của tiểu cầu, giảm fibrinogen và giảm acid uric máu Nhóm statin là loại thuốc ức chế cạnh tranh với enzym HMG-CoA reductase, dẫn đến ức chế sự tổng hợp cholesterol ở tế bào gan, tăng receptor LDLC và tăng thoái hóa LDLC

Một số thuốc từ nguồn thảo dược (nghệ, ngưu tất…) cũng có tác dụng trên sự rối loạn lipid máu Mỗi nhóm có cơ chế tác động riêng của nó Naringin, flavonoid

có nhiều trong các loài Citrus có tác dụng giảm cholesterol và triglycerid trong máu chuột gây béo phì thực nghiệm

1.2.5 Bệnh lý phát sinh do béo phì và chiến lược điều trị

Bệnh béo phì là một trong những nguyên nhân quan trọng gây rối loạn trao đổi chất lipid và glucid ở người trưởng thành thậm chí cả ở những trẻ em chưa đến tuổi trưởng thành Trong các năm 1991, Porter và Banks đã công bố các nghiên cứu cho thấy bệnh béo phì là nhân tố tiên đoán thường gây ra bệnh viêm tụy ác tính dễ dẫn đến tổn thương các tế bào  của đảo tụy Langerhan, là nơi chuyên tiết hormon

insulin điều hoà ổn định nồng độ glucose của máu Như vậy béo phì thường gây trạng thái bệnh lý đái tháo đường type 2 [36]

Béo phì là yếu tố gây ra sự rối loạn trao đổi lipid được đặc trưng bằng sự biến động bất thường các chỉ số mỡ máu như: làm tăng hàm lượng của triglycerid, tăng LDLc (Low Density Lipoprotein cholesterol) và làm hạ thấp HDLc (Hight density Lipoprotein cholesterol) so với người không bị bệnh Các rối loạn này gây

ra hiện tượng xơ vữa động mạch, dẫn tới chứng nhồi máu cơ tim…

Hiện nay, để phòng và điều trị bệnh béo phì cũng như các bệnh liên quan đến rối loạn trao đổi chất lipid-glucid người ta đã đưa ra một số giải pháp sau:

- Kết hợp chế độ ăn uống hợp lý (giảm khẩu phần ăn giàu lipid, chất bột, đường; tăng cường sử dụng nguồn thức ăn giàu vitamin như rau quả và các loại thức ăn đủ đạm) với luyện tập thể thao thường xuyên, khoa học

- Đối với bệnh nhân béo phì, có thể sử dụng một số loại thuốc giảm cân, tuy nhiên cũng cần phải khuyến cáo các bệnh nhân rằng: thuốc giảm cân không được sử dụng vì mục đích thẩm mỹ, mà chỉ được dùng cho những bệnh nhân có BMI > 27

và có các vấn đề về sức khoẻ chỉ có giảm cân mới cải thiện được và việc sử dụng thuốc giảm cân sẽ gây ra các tác dụng phụ không mong muốn [38] Chẳng hạn như:

+ Metformin: có tác dụng giảm mỡ máu, dẫn đến giảm trọng lượng, nhưng lại gây tác dụng phụ là buồn nôn, tiêu chảy, gây toan máu…

+ Orlistat (Xenical) làm ức chế lipase và sự hấp thu mỡ ở ruột, nhưng tác dụng phụ của nó là làm suy giảm khả năng hấp thụ vitamin tan trong mỡ máu

+ Các thuốc ức chế sự thèm ăn: ephedrine, caffeine [2]

- Phẫu thuật giảm cân: áp dụng với các bệnh nhân có BMI > 35, kèm theo các bệnh lý và rối loạn liên quan Kết quả mang lại từ phẫu thuật là rất lớn, tuy nhiên nó cũng gây ra nhiều tác dụng phụ như suy nhược, khô da, rụng tóc tạm thời…

Tuy nhiên, chi phí cho việc điều trị béo phì bằng thuốc tân dược và phẫu thuật rất lớn (bảng 1.3)

Bảng 1.3: Chi phí điều trị bệnh béo phì ở một số nước trên thế giới [2]

Tên nước Năm Dân số mắc bệnh

béo phì (triệu) Số tiền chi phí Newzealand 1996 3,6 135 triệu đô la NZ

Australia 1994 28,4 464 triệu AUD

Hà Lan 1995 25,7 1,0 tỷ NG (tiền Hà Lan)

Trong những năm gần đây có nhiều công trình nghiên cứu về sử dụng các hợp chất tự nhiên từ thực vật để chữa bệnh béo phì, đái tháo đường và các bệnh nhiễm trùng… Điều đáng chú ý là các loại thuốc này thường ít gây ra tác dụng phụ hơn so với tân dược và hơn nữa tác dụng của thuốc có hiệu quả trong thời gian dài [12], [15], [24], [28], [41], [42] Ở Việt Nam, hầu như chưa có công trình nghiên cứu về cơ chế hóa sinh và hiệu quả chữa bệnh béo phì liên quan đến rối loạn trao đổi lipid glucid theo hướng sử dụng các chất có hoạt tính sinh học từ măng cụt Do

đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu tác dụng của dịch chiết vỏ quả và lá măng cụt

lên trọng lượng của chuột gây béo phì thực nghiệm cũng như nghiên cứu trên một

số chỉ số lipid máu chuột

1.3 Đặc điểm của một số chủng vi sinh vật dùng trong phòng thí nghiệm 1.3.1 Bacillus subtilis [9]

Bacillus subtilis đại diện cho nhóm trực khuẩn gram(+), là vi khuẩn kiểm định, tác nhân gây ra một số bệnh cho cây trồng Nó sinh bào tử, sống hiếu khí, Bacillus subtilis không gây bệnh cho người

Salmonella typhi thuộc họ Enterobacteriaceae với chỉ một dòng họ duy nhất

là Salmonella và được lấy tên nhà khoa học người Mỹ, D E Salmon Đây là trực

khuẩn gram (-), hình que có nhiều lông, hiếu khí tuỳ nghi di động, không tạo bào tử,

có kích thước khoảng (2 – 3) x (0,4 – 0,6 µm)

Salmonella typhi có 3 loại kháng nguyên bề mặt (kháng nguyên thân O, kháng nguyên lông H, kháng nguyên độc) Salmonella typhi xâm nhập vào cỏ thể

theo đường miệng và hầu hêt là do ăn phải thức ăn bị nhiễm khuẩn như thực phẩm,

sữa, nước uống Salmonella typhi là thủ phạm gây ra bệnh thương hàn

1.4 Vài nét về cây măng cụt [1], [4], [11]

1.4.1 Đặc điểm thực vật học

* Phân loại khoa học:

- Giới (regnum): Plantae - Họ (familia): Clusiaceae

- Ngành (divisio): Magnoliophyta - Chi (genus): Garcinia

- Lớp (class): Magnoliopsida - Loài (species): G Mangostana

- Bộ (ordo): Malpighiales - Tên 2 thành phần: Garcinia mangostana

Măng cụt ( danh pháp khoa học: Garcinia mangostana), họ bứa (Clusiaceae), là loài cây nhiệt đới ăn quả được Cây to, cao từ 7 – 25 m, lá dày, dai,

màu lục sẫm, hình thuôn dài Hoa đực cụm 3 – 9 hoa có lá bắc Hoa lưỡng tính có cuống có đốt Quả hình cầu, to trung bình, khi chín có vỏ ngoài dày cứng, màu đỏ tím đậm, trong đỏ tươi như rượu vang, dày xốp, phía dưới có lá đài, phía đỉnh có đầu nhuỵ Trong quả có từ 6 - 18 hạt, quanh hạt có áo hạt trắng ngà

1.4.3 Tác dụng dược lý

- Tác dụng kháng histamin: ức chế dị ứng

- Tác dụng kháng khuẩn, kháng vi sinh vật: chống vi khuẩn gây bệnh tả, lỵ, tiêu chảy, bệnh sâu răng, chống viêm nhiễm

- tác dụng làm giãn phế quản trong điều trị hen xuyễn

- Tác dụng chống suy giảm miễn dịch

1.4.4 Tính vị và công năng

Lá măng cụt có vị chát

Vỏ quả măng cụt có vị chua, chát, tính bình, đi vào hai kinh phế và đại tràng,

có công năng thu liễn, sáp trường, chi huyết, dùng trị tiêu chảy, ngộ độc chất ăn, khi bệnh thuyên giảm thì thôi, dùng lâu sinh táo bón Có tác dụng trị tiểu đường; nước sắc vỏ măng cụt chữa lỵ, đau bụng, đi tiêu chảy, bệnh vàng da Những khảo cứu mới cho biết những tính chất của vỏ trái cây: nhờ chất epicatechin, nó chống oxi hoá; flavonoid, nó ức chế hoạt động sản xuất acid của vi khuẩn Streptococcus muntans GS – 5

Thịt quả măng cụt có vị chua ngọt, có mùi thơm thu hút, mát, có tác dụng thanh nhiệt, giải khát

1.4.5 Thành phần hoá học

Thịt quả măng cụt (áo hạt) không thấy được khảo cứu

Vỏ quả măng cụt có thành phần chính là các thành phần chính là các xanthon

mà những chất chính là các mangostin, tươi, không vị, tan trong rượu, ete, chất kiềm, không tan trong nước, nhiệt nóng chảy 175oC như: a - mangostin, b - mangostin, g - mangostin, những iso mangostin, nor mangostin, trioxi xanthon, pyrano xanthon, dihydroxi methyl butenyl xanthon, trihydroxi methyl butenyl xanthon Có 7 – 13% tanin Một lượng nhỏ các chất: những garcinon A, B, C, D, E; mangostin; garcimangoson A, B, C; gartanin; egonol; epicatechin, procy anidin được tìm ra từ măng cụt nguồn gốc Việt Nam

Lá măng cụt chứa: 7,8% protein; 11,2% tannin; các chất khác như: trihydroxi methoxy methyl butenyl xanthon, ethyl methyl maleimid gluco pyranosid, các triterpenoid như cycloathenol, fliedlin, b – sitosterol, betulin, mangiferadiol, acid mangiferolic, cyclolanostendiol, hydroxi cyclolanostenon

Ruột thân cây chứa tetra hydroxi xanthon và dẫn xuất O – glucosid của nó cùng penta hydroxi xanthon, maclurin

Tinh dầu măng cụt có khoảng 50 hoá chất hữu cơ, trong số ấy đã có hơn 30 chất được xác định Nhiều nhất là % hexanol, tiếp đến là octan, hexyl acetat, a – copaen, aceton, furfuran, methyl butenol, toluen

chương 2 đối tượng và phương pháp nghiên cứu

2.1 Đối tượng nghiờn cứu

2.1.1 Mẫu thực vật

Lỏ măng cụt (Garcinia mangostana L.) được thu hỏi vào thỏng 5 năm 2008,

tại Vĩnh Long Lỏ tươi được rửa sạch, sấy khụ ở 50oC, nghiền nhỏ thành bột mịn và bảo quản trong tỳi nilon đúng kớn Thẩm định tờn khoa học là Tiến sỹ phõn loại học

2.1.3 Mẫu vi sinh vật

Chủng vi khuẩn Gram (-): Escherichia coli, Salmonella typhi

Chủng vi khuẩn Gram (+): Bacillus subtillis, Staphylococcus aureu

Các chủng vi khuẩn này được phân lập từ phòng thí nghiệm vi sinh vật trường Đại học Khoa học tự nhiên - Đại học Quốc Gia Hà Nội

- Các dung môi: Ethanol 90o, n- Hexan, Chlorofor, Ethyl acetat

- Các hoá chất thử định tính, định lượng polypenol tổng số

- Bản mỏng tráng sẵn silicagel (Merck)

- Các hoá chất dùng để pha môi trường nuôi cấy vi sinh vật: thạch aga, nước mắm, đường, pepton…

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Qui trình chiết xuất

- 1,5 kg lá măng cụt khô được ngâm chiết với ethanol 80o ở nhiệt độ phòng trong 3 tuần (qui trình được lặp lại 3 lần: 2 lần sau ngâm trong 2 tuần) Gộp các dịch chiết, lọc qua giấy lọc và cất loại dung môi dưới áp suất thấp bằng máy cất quay chân không thu cặn ethanol Cặn ethanol được hoà tan trong nước nóng và chiết lần lượt với các dung môi n- hexan, chloroform và ethyl acetate, cất loại dung môi dưới

áp suất thấp bằng máy cất quay chân không thu cặn chiết tương ứng

- 2,0 kg vỏ quả măng cụt tươi ngâm chiết với ethanol 96o ở nhiệt độ phòng trong 4 tuần( qui trình được lặp lại 3 lần: 2 lần sau ngâm trong 2 tuần) Gộp các dịch chiết, lọc qua giấy lọc và cất loại dung môi dưới áp suất thấp bằng máy cất quay chân không thu cặn ethanol Cặn ethanol được hoà tan trong nước nóng và chiết lần lượt với các dung môi n- hexan, chloroform và ethyl acetate, cất loại dung môi dưới

áp suất thấp bằng máy cất quay chân không thu cặn chiết tương ứng

2.3.2 Khảo sát thành phần hoá học của lá và vỏ quả măng cụt

2.3.2.1 Định tính flavonoid [19]

Pha mẫu thử trong ethanol với một lượng thích hợp Sau đó cho vài giọt HCl đặc vào, chia dung dịch nhận được vào hai ống nghiệm rồi tiến hành các thí nghiệm sau:

a Phản ứng Shinoda:

Ống 1: ống đối chứng Ống 2: cho một vài mảnh Mg

Phản ứng cho kết quả dương tính khi trong ống nghiệm xuất hiện màu hồng,

đỏ hay da cam

b Phản ứng diazo hóa:

Ống 1: ống đối chứng Ống 2: nhỏ thêm vài giọt thuốc thử diazo

Phản ứng cho mầu da cam là dương tính

c Phản ứng với acid sunfuric

Ống 1: ống đối chứng Ống 2: nhỏ thêm vài giọt acid sunfuric Phản ứng cho mầu vàng đậm cho thấy sự có mặt của favon và flavonol, mầu đỏ hay nâu cho thấy

sự có mặt của chalcol và auron

d Phản ứng với dung dịch kiềm:

Ống 1: ống đối chứng Ống 2: nhỏ thêm vài giọt dung dịch NaOH 10% Phản ứng có kết quả dương tính khi xuất hiện màu vàng cam

Dung dịch được pha như trên Chia dung dịch nhận được vào hai ống:

Ống 1: ống đối chứng Ống 2: nhỏ thêm vài giọt thuốc thử vanilin/H2SO4 Phản ứng dương tính khi dung dịch thu được mầu đỏ đậm

b Phản ứng với gelatin/NaCl: gelatin 1% trong NaCl 10% Cho vài giọt thuốc thử vào 1ml dung dịch mẫu, phản ứng dương tính khi trong dung dịch xuất hiện tủa

c Phản ứng với acetate chì: cho vài giọt dung dịch acetate chì 10% vào dung dịch mẫu, phản ứng dương tính khi xuất hiện kết tủa

Cho 0.01g cặn dịch chiết vào ống nghiệm Thêm 1ml dung dịch A lắc cho tan hết mẫu, nghiêng ống nghiệm cho từ từ vào Phản ứng dương tính khi xuất hiện vòng nâu đỏ giữa 2 lớp chất lỏng

2.3.2.5 Định tính alkaloid

Mẫu thử được pha trong dung dịch axit acetic 2% với một lượng thích hợp

để làm các phản ứng Chia mẫu thử làm đôi cho vào :

- Ống 1: đối chứng Ống 2: thử với các thuốc thử

a Phản ứng với thuốc thử Bouchardat (hỗn hợp KI và I2 trong dung dịch HCl): alkaloid cho kết tủa mầu nâu sẫm

b Phản ứng với thuốc thử Vans-Mayer (10g HgCl2 +40g KI trong 1000ml nước cất): alkaloid phản ứng cho kết tủa mầu trắng hay vàng nhạt

c Phản ứng với thuốc thử Drogendorf

Dung dịch A: 17g Bi(NO3)3 + 400ml H2O + 100ml acetic đặc

Dung dịch B: 200g KI trong 500ml nước

Trộn dung dịch A và B ta được dung dịch gốc Lấy 20ml dung dịch gốc +

100 ml H2O cất + 20ml acid acetic đặc ta được thuốc thử Drogendorf

Cho mẫu vào ống nghiệm (2ml), rồi cho vài giọt thuốc thử vào nếu thấy kết tủa màu da cam thì kết luận dương tính

2.3.3 Sắc ký lớp mỏng

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Aflolien 60

F254 (Merck), RP18 F254 (Merck) bằng hệ dung môi T:E:A:F (Toluen:Ethylacetat:Aceton: axit formic 5:3:1:1) Xông hơi I2, sấy khô trên bếp điện

từ đến khi hiện màu

Xác định hệ số Rf theo công thức Rf = a/b Trong đó, a là khoảng di chuyển của chất nghiên cứu; b là khoảng di chuyển của dung môi

2.3.4 Định lượng polyphenol tổng số

Chuẩn bị mẫu: cõn chớnh xỏc 10mg cao ethanol, phõn đoạn nước, phõn đoạn ethylacetat và hũa loóng trong 1 ml ethanol 80% Cỏc dung dịch trờn sau đú được hũa loóng ở cỏc nồng độ thớch hợp để làm phản ứng định lượng hợp chất phenolic theo phương phỏp Folin-Ciocalteau [31], [35]

Phương phỏp này được thực hiện dựa trờn nguyờn tắc cỏc hợp chất phenolic trong dung dịch phản ứng với thuốc thử Folin-Ciocalteau cho sản phẩm mầu xanh lam, đo độ hấp thụ ở bước súng = 765nm, dựng chất chuẩn là axit gallic để tớnh lượng poly phenol tổng số

- Dung dịch axit gallic: 0,5g axit gallic + 10 ml C2H5OH + 90 ml H2O bảo quản lạnh

- Dung dịch Na2CO3: 200g Na2CO3 + 800 ml H2O đun sụi Thờm một vài tinh thể

Na2CO3, sau 24h đem lọc và dẫn nước cất tới 1000 ml

Tiến hành:

- Chuẩn bị cúng định lượng theo tỉ lệ 0, 1, 2, 3, 5 và 10 ml sau đú dẫn nước cất tới 100 ml sẽ thu được cỏc nồng độ 0, 50, 100, 150, 250, 500 mg/l axit gallic Dựng đường chuẩn axit gallic

- Cho vào mỗi cóng định lượng 20l mẫu thử + 1,58ml H2O + 100l thuốc thử Folin - Ciocalteau sau 30 giây đến 8 phút cho thêm 300l Na2CO3 Để hỗn hợp dung dịch trong 2h ở 200C rồi xác định ở bước sóng 765nm Dựa vào đồ thị chuẩn axit galic để xỏc định lượng mẫu đo

Bảng 2.1 Bảng kết quả xây dựng đường chuẩn acid gallic

2.3.5 Tạo mô hình chuột gây béo phì thực nghiệm

Chuột được chia thành 7 lô (mỗi lô gồm 6 con), trong đó lô 1 ăn thức ăn bình thường (do Viện vệ sinh dịch tễ cung cấp), lô 2-7 ăn thức ăn với hàm lượng lipid và cholesterol cao [40]

Sau 21 ngày nuôi, kiểm tra cân nặng và đo một số chỉ số hóa sinh máu của các lô chuột

2.3.6 Nghiên cứu tác dụng giảm trọng lượng cơ thể chuột bằng một số phân đoạn dịch chiết lá và vỏ quả măng cụt

2.3.6.1 Thử độc tính cấp, xác định LD 50 bằng đường uống [32]

Xác định LD50 của lá và vỏ quả măng cụt trên chuột bằng đường uống Chuột nhịn đói trước 16h thí nghiệm được phân lô ngẫu nhiên N = 10 và cho uống theo liều tăng dần đến 8g/1kg (thể tích và khối lượng tối đa có thể cho phép) Theo dõi biểu hiện và số chuột chết trong 72h để đánh giá mức độ độc của dịch chiết lá

và vỏ quả măng cụt

2.3.6.2 Mô hình bố trí thí nghiệm nuôi chuột béo phì thực nghiệm

Để nghiên cứu tác dụng của một số dịch chiết lên trọng lượng chuột gây béo phì thực nghiệm, chúng tôi thiết kế các lô chuột thí nghiệm như sau:

y = 0,001x + 0,0128

Lô 1: Chuột ăn thức ăn chuẩn do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp, không điều trị, uống nước (đối chứng âm)

Lô 2: Chuột ăn thức ăn có hàm lượng lipid và cholesterol cao, không điều trị, uống nước (đối chứng dương)

Lô 3: Chuột ăn thức ăn có hàm lượng lipid cholesterol cao, uống metformin (liều 500mg/kg thể trọng)

Lô 4: Chuột ăn thức ăn có hàm lượng lipid cholesterol cao, uống dịch chiết ethanol vỏ quả măng cụt (liều 600mg/kg thể trọng)

Lô 5: Chuột ăn thức ăn có hàm lượng lipid cholesterol cao, uống dịch chiết ethyl acetat vỏ quả măng cụt (liều 600mg/kg thể trọng)

Lô 6: Chuột ăn thức ăn có hàm lượng lipid cholesterol cao, uống dịch chiết ethanol lá măng cụt (liều 600mg/kg thể trọng)

Lô 7: Chuột ăn thức ăn có hàm lượng lipid cholesterol cao, uống dịch chiết ethyl acetat lá măng cụt (liều 600mg/kg thể trọng)

2.3.6.3 Xác định một số chỉ số hóa sinh trong máu chuột trước và sau khi điều trị bằng dịch chiết

a Xác định glucose huyết [13]

Xác định nồng độ glucose huyết bằng kỹ thuật enzyme Sau khi oxy hóa glucose bằng enzyme glucose oxidase (GOD), H2O2 được tạo thành tác dụng với 4-aminoantipyrin và phenol nhờ xúc tác của peroxidase (POD) tạo thành phức màu quinoneimine theo các phản ứng sau:

Glucose + O2 Gluconic acid + H2O2

H2O2 + 4-aminoantipyrine + phenol quinoneimine + H2O

Đo mật độ quang ở bước sóng 500nm (bằng máy Olympus AU400), so với glucose chuẩn sẽ tính được kết quả

b Xác định triglycerid trong máu [20]

GOD

POD

Thủy phân triglycerid bằng enzyme lipase, định lượng glycerol giải phóng ra bằng phương pháp đo màu của quinonimin tạo thành từ 4-aminoantipyrin và 4-chlorophenol phản ứng với peroxide hydrogen theo các phản ứng sau:

Triglycerides Glycerol + acid béo

Glycerol + ATP Glycerol-3-phosphate + ADP

Glycerol-3-phosphate + O2 Dihydroxyaceton phosphate + H2O2

H2O2 + Aminoantipyrine + 4-Chlorophenol Quinoneimine + HCl + 4H2O

Đo mật độ quang ở bước sóng 500nm (bằng máy Olympus AU400), so với chuẩn sẽ tính được kết quả

c Xác định cholesterol trong máu [18]

Định lượng cholesterol sau khi thủy phân cholesterol este bằng enzyme cholesterol esterase (CHE) và oxy hóa bằng cholesterol oxidase (CHO) Đo mật độ quang của quinoneimine tạo nên từ phản ứng của H2O2 với 4-aminoantipyrine và phenol nhờ sự xúc tác của peroxidase (POD) Các phản ứng xảy ra như sau:

Cholesterol ester + H2O Cholesterol + acid béo

Cholesterol + O2 Cholesterol-3-one + H2O2

2H2O2 + 4-aminoantipyrine + Phenol Quinoneimine + 4H2O

Đo mật độ quang ở bước sóng 500nm (bằng máy Olympus AU400), so với ống chuẩn để tính kết quả

2.3.7 Phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

Mục đích: xác định khả năng kháng khuẩn của các phân đoạn dịch chiết từ lá

và vỏ quả măng cụt đối với vi sinh vật (đại diện là 4 chủng vi khuẩn:

Escherichiacoli, Salmonella typhi, Bacillus subtillis, Staphylococcus aureus) theo

CHE

Lipase

- Chuẩn bị môi trường nuôi cấy: Cho 20g agar hoà tan trong 800 ml nước cất, thêm 5g pepton, 20 ml nước mắm, sau đó thêm nước cất cho đủ 1000 ml Đun hỗn hợp trên sôi trong 1h rồi chia vào các bình tam giác đem khử trùng ở 1 atm trong 2h Sau khi khử trùng , môi trường được đổ vào các đĩa petri (cũng đã được khử trùng)

- Giống: Giống được nuôi cấy lắc trong môi trường thạch thường dịch thể trong 24h để khởi động giống Giống khởi động được cấy gạt vào môi trường rắn trên các đĩa petri đã được chuẩn bị sẵn Sau đó đục giếng trên đĩa petri

- Mẫu: Pha mẫu với nước vô trùng, rồi tra vào các giếng Để các đĩa petri trong tủ mát ở 4oC cho mẫu khuếch tán đều trong thạch, rồi cho vào tủ ấm 37oC Đọc kết quả vòng kháng khuẩn sau 24 - 36h

2.3.8 Xác suất thống kê toán học xử lí số liệu:

Sử dụng chương trình Microsoft Office– Excell: nạp các số liệu, dùng hàm AVERAGE để tính giá trị trung bình và hàm VAR để tính sai số, vẽ biểu đồ, lập các bảng biểu