NGHIÊN cứu, xây DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH hàm LƯỢNG AXIT URIC BẰNG PHƯƠNG PHÁP sắc ký LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) và ỨNG DỤNG PTHỬ NGHIỆM TRONG PHÂN TÍCH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘIĐẶNG THANH HUYỀN NGHIÊN CỨU, XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG AXIT URIC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC VÀ ỨNG D

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI

ĐẶNG THANH HUYỀN

NGHIÊN CỨU, XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG AXIT URIC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) VÀ ỨNG DỤNG PTHỬ

NGHIỆM TRONG PHÂN TÍCH

HỌ VÀ TÊN

( Tác giả luận văn)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI

ĐẶNG THANH HUYỀN

NGHIÊN CỨU, XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG AXIT URIC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) VÀ ỨNG DỤNG PHÂN

TÍCH

HỌ VÀ TÊN

( Tác giả luận văn)

Lêi c¶m ¬n

Luận văn Thạc sĩ khoa học Hóa học này được hoàn thành tại phòng thí nghiệm Pp hân tích Hóa – Sinh thuộc bộ môn Hóa Phân tích, khoa Hóa học, trường Đại học Sư phạm Hà Nội với sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của cô giáo, TS Vũ Thị Hương cùng các thầy, các cô trong bộ môn Hóa Phân tích cũng như các thầy, các cô trong khoa Hóa học, sự giúp đỡ của các anh chị học viên K21 khoa Hóa học trường Đại học Sư phạm Hà Nội.

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc em xin chân thành cảm ơn cô giáo, TS Vũ Thị Hương, người đã giao đề tài, tận tình chỉ bảo, hướng dẫn

và tạo mọi điều kiện giúp đỡ em hoàn thành luận văn Thạc sĩ này.

Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến các thầy, các cô trong

Bộ môn Hóa Phân tích, các thầy, các cô trong khoa Hóa học – Trường Đại học Sư phạm Hà Nội, các anh chị cùng toàn thể các bạn học viên – khoa Hóa học đã giúp đỡ, đóng góp ý kiến, tạo điều kiện thuận lợi, nhiệt tình giúp đỡ và động viên trong suốt thời gian học tập và làm việc tại phòng thí nghiệm Cuối cùng em xin được gửi tới gia đình, người thân và bạn bè lời cảm

ơn chân thành nhất đã giúp đỡ em thu nhập thông tin, tư liệu và động viên, khích lệ tinh thần em trong suốt thời gian qua.

Hà Nội, tháng 10 năm 2013

Tác giả

Đặng Thanh Huyền

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI

ĐẶNG THANH

HUYỀN -& -TÊN ĐỀ TÀI:

NGHIÊN CỨU, XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG AXIT URIC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍKÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) VÀ ỨNG DỤNG PHÁT HIỆN NGUY CƠ MẮC BỆNH

Người hướng dẫn khoa học: TS Vũ Thị Hương

Họ và tên học viên : Đặng Thanh Huyền Giáo viên hướng dẫn : TS Vũ Thị Hương

Hà Nội -– 2013

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÍKÝ HIỆU VIẾT TẮT 4

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ 5

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU 6

MỞ ĐẦU 7

3 Nhiệm vụ nghiên cứu 8

4 Phương pháp nghiên cứu 8

5 Kết quả đạt được 9

6 Những điểm mới của đề tài 9

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 11

1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ AXIT URIC 11

1.1.1 Thông tin chung 11

1.1.2 Tính chất vật lý 11

1.1.3 Trạng thái tồn tại, quá trình tổng hợp và đào thải của axit uric 12

1.1.4 Cơ chế lắng đọng của axit uric và ảnh hưởng của nó đối với cơ thể 13

1.1.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của axit uric trong viêm khớp 14

1.1.6 Các yếu tố ảnh hưởng tới việc phân tích và định lượng axit uric 16 1.2 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 17

1.2.1 Khái niệm về sắc ký và sắc ký lỏng hiệu năng cao 17

1.2.2 Nguyên tắc cấu tạo của máy HPLC 18

1.2.3 Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký và các yếu tố ảnh hưởng 22

1.2.4 Pha tĩnh trong HPLC 26

1.2.5 Pha động trong HPLC 28

1.2.6 Chọn pH cho dung dịch đệm 29

1.2.7 Nguyên tắc lựa chọn pha tĩnh và pha động 29

1.2.8 Cách đánh giá picpíc 30

1.3 ỨNG DỤNG CỦA HPLC 30

1.3.1 Định tính 30

1.3.2 Phân tích định lượng 31

1.3.4 Sắc ký điều chế 31

1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ TRONG PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG AXIT URIC 32

1.4.1 Phương pháp quang phổ phân tử 32

1.4.2 Sơ lược về các phương pháp cực phổ và von ampe 34

1.5 YÊU CẦU CỦA ĐỊNH LƯỢNG THUỐC TRONG KIỂM NGHIỆM DƯỢC PHẨM 41

1.5.1 Tính đặc hiệu của phương pháp 41

1.5.2 Đường chuẩn và khoảng tuyến tính 41

1.5.3 Độ đúng 42

1.5.4 Độ chính xác 42

1.5.5.Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 42

CHƯƠNG II: THỰC NGHIỆM 45

2.1 HÓA CHẤT, DỤNG CỤ 45

2.1.1 Hóa chất 45

2.1.2 Dụng cụ và thiết bị 45

2.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 45

2.3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 46

2.3.1 Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký 47

2.4 XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN 49

2.4.1 Chuẩn bị dung dịch mẫu chuẩn axit uric 49

2.4.2 Khảo sát tìm khoảng nồng độ axit uric tuyến tính với diện tích picpíc sắc ký 49

2.5 ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP VÀ KIỂM TRA ĐƯỜNG CHUẨN 50

2.5.1 Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký 50

2.5.2 Khảo sát độ lặp lại của phương pháp 50

2.5.3 Khảo sát độ đúng của phương pháp 51

2.5.4 Khảo sát độ tuyến tính của phương pháp 51

2.6 ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP HPLC VÀO ĐỊNH LƯỢNG AXIT URIC TRONG MẪU NƯỚC TIỂU 52

2.6.1 Xử lý nước tiểu 52

2.6.2 Phương pháp đo mẫu 52

2.7 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ KẾT QUẢ 52

2.7.1 Nguyên tắc xử lý kết quả 52

2.7.2 Cách xử lý 53

CHƯƠNG III : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 56

3.1 Xây dựng điều kiện để định tính axit uric 56

3.1.1 Lựa chọn phương pháp sắc ký 56

3.1.1.1 Chọn bước sóng cực đại 56

3.1.2 Đánh giá phương pháp định lượng 65

3.2 Ứng dụng phương pháp HPLC để xác định định tính và định lượng axit uric trong nước tiểu người nhằm phát hiện nguy cơ mắc bệnh Gout 72

3.2.1.Nước tiểu 72

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 74

TÀI LIỆU THAM KHẢO 75

PHỤ LỤC 76

DANH MỤC CÁC KÍKÝ HIỆU VIẾT TẮT

KíKý hiệu

viết tắt

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Sơ đồ sinh tổng hợp axit uric trong cơ thể người

Hình 1.3 Sắc ký đồ của hai chất và các thông số đặc trưng

pH=8,0

1.10-2 M

người ở độ tuổi từ 18 – 30 tuổi

người ở độ tuổi từ 30 - 50 tuổi

người ở độ tuổi ngoài 50 tuổi

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 1.2 Độ nhạy của các loại detector

tiểu

tích pícpic của axit uric

pícpic của axit uric

pícpic của axit uric

tích pícpic của axit uric

tích pícpic của axit uric

của axit uric

với axit uric

Bảng 3.11 Kết quả kiểm tra độ lặp lại của phương pháp sắc ký pic

sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Bảng 3.13 Kết quả phân tích hàm lượng axit uric trong nước tiểu ở độ

tuổi từ 18 - 30 tuổi

tuổi từ 30 – 50 tuổi

tuổi ngoài 50 tuổi

MỞ ĐẦU

1I Lý do chọn đề tài

Axit uric là một hợp chất dị vòng chứa cacbon, nitơ, oxi và hiđro cócông thức phân tử là C5H4N4O3 Axit uric là sản phẩm cuối cùng của quá trìnhchuyển hóa purine nucleotit Trong cơ thể người và động vật, axit uric đượcđào thải qua đường nước tiểu, n Nhưng do quá trình cung cấp quá nhiều đạmlàm tăng quá trình tổng hợp axit uric hoặc do chức năng suy thận giảm khiếnquá trình đào thải axit uric không hoàn toàn làm tăng hàm lượng axit urictrong máu Khi hàm lượng axit uric trong máu tăng dẫn đến một số bệnh củaviêm khớp gọi là bệnh Gut (bệnh Gout) Các hạt lắng đọng xung quanh cáckhớp dẫn đến hậu quả sưng viêm và đau khớp, bên cạnh đó, một số lắng đọngtại thận là nguyên nhân gây bệnh sỏi thận

Nồng độ axit uric trong nước tiểu và trong huyết thanh quá cao sẽ đượctìm thấy trong các bệnh nhân mắc một số bệnh như bệnh Gout, sỏi thận, timmạch, tiểu đường loại 2 Nếu nồng độ axit uric trong huyết tương quá thấpgây nên bệnh đa xơ cứng ở ngoài Do đó việc xác định hàm lượng của axituric trong cơ thể người có nghĩa vô cùng quan trọng trong việc xác định bệnhcũng như dự đoán những bệnh này

Trong những năm gần đây đã có rất nhiều kĩ thuật hiện đại ứng dụng đểxác định hàm lượng axit uric như phương pháp huỳnh quang, phương phápquang phổ, phương pháp hấp thụ mol phân tử, phương pháp enzim, Phương

nhiều nhà khoa học sử dụng trong phân tích dược phẩm nói riêng và phân tíchnói chung với các ưu điểm nổi bật của phương pháp là có độ nhạy cao, tươngđối chọn lọc với chất ta cần xác định Việc nghiên cứu, xây dựng quy trìnhphân tích hàm lượng axit uric và ứng dụng quy trình phân tích đó vào xácđịnh hàm lượng axit uric trong thực tế không những có ý nghĩa sâu sắc về mặt

lý thuyết mà còn có ý nghĩa sâu sắc về mặt thực tế Chính vì những lý do trên

tích hàm lượng axit uric bằng phương pháp sắc kíký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và ứng dụng phân tích”.

2 Mục đích nghiên cứu

- - Xây dựng quy trình phân tích axit uric bằng phương pháp sắc kíkýlỏng hiệu năng cao

trong mẫu nước tiểu của một số đối tượng

khác nhau, thông qua tiêu chuẩn kiểm nghiệm của Bộ Y Tế Bộ Y Tế để xétxem mức độ nguy hiểm của bệnh Gout đối với từng người, từng lứa tuổi

3 Nhiệm vụ nghiên cứu

uric bằng phương pháp vừa xây dựng

nước tiểu của các đối tượng khác nhau, thông qua tiêu chuẩn kiểm nghiệmcủa Bộ Y Tế để xét xem mức độ nguy hiểm của bệnh Gout đối với từngngười, từng lứa tuổi

4 Phương pháp nghiên cứu

- - Áp dụng phương pháp thực nghiệm vào nghiên cứu gồm hai nội dung lànghiên cứu cơ bản và ứng dụng lấy mẫu thật để phân tích đánh giá.

- - Xây dựng quy trình chương trình sắc ký định tính và định lượng axituric, để xây dựng quy trình chương trình sắc ký thích hợp Các điều kiệnsau được tiến hành khảo sát:

+ Kiểu sắc ký áp dụng

+ Cột tách sử dụng

+ Bước sóng thích hợp phát hiện axit uric

được tín hiệu tốt nhất.để cho kết quả tách tốt nhất

Để đánh quy trìnhgiá chương trình sắc ký đã xây dựng được, các thíì nghiệm sau được tiến hành:

+ Khảo sát độ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic thu được

+ Đánh giá độ chính xác của đường chuẩn

+ Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký

Khảo sát độ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích picpic thu được.+ Khảo sát độ lặp lạichính xác của phương pháp phân tích

+ Khảo sát độ đúng của phương pháp phân tích

Thông qua việc xử lý thống kê các kết quả thực nghiệm để đánh giá chương trình sắc ký đã xây dựng (Đánh giá cái gì???)

Xây dựng thành công điều kiện sắc ký để phân tích xác định quy trình phân tích axit uric và ứng dụng quy trình để xác định hàm lượng axit uric trong mẫu nước tiểu của người (Phần này sẽ viết lại sau khi kết thúc các thí nghiệm)

6 Những điểm mới của đề tài

hiện đại nhất hiện nay trong phân tích và kiểm nghiệm để nghiên cứu xâydựng quyi trình phân tích hàm lượng axit uric

- Xây dựng được quy trình phương pháp định lượng ổn định, chính xác

sắc ký lỏng hiệu năng cao

- Ứng dụng quy trình sắc ký phương pháp định lượng đã xây dựng

cho kết quả tốt (Viết không rõ ràng)

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ AXIT URIC

1.1.1 Thông tin chung

1a Công thức phân tử: C5H4N3O3

2b Công thức cấu tạo:

3c Tên khoa học: 7,9-dihidro–purine–2,6,8–trione hay 2,6,8 –trioxypurine [2] [3]

1.1.2 Tính chất vật lý

- Là tinh thể màu trắng, không mùi, nhiệt độ nóng chảy là 300C

- Độ tan trong nước là 60 mg/l (ở 20C), độ tan trong etanol rất thấp vàđược coi là không đáng kể

- Giới hạn hoà tan của muối uraturate khoảng 6,8 mg/dl ở nhiệt độ37C Ở nồng độ cao hơn các tinh thể uraturatee sẽ bị kết tủa Tuy nhiên,trong một số trường hợp các tinh thể uraturate có trong huyết thanh không bịkết tủa [20]

- Trong nước tiểu, axit uric hòa tan dễ dàng hơn trong nước, pH củanước tiểu ảnh hưởng lớn đến sự hòa tan axit uric, bình thường lượng axit uric

thải qua nước tiểu là trên 800 mg/ngày Do vậy, pH càng kiềm càng thuận lợicho việc thải axit uric và ngược lại nước tiểu càng có môi trường axit thì khókhăn cho việc đào thải axit uric [20].

- pH = 5,0: Axit uric bão hòa với nồng độ từ 390-900 μmol/L.mol/L

- pH= 7,0: Axit uric bão hòa với nồng độ từ 9480-12000 μmol/L.mol/L

1.1.3 Trạng thái tồn tại, quá trình tổng hợp và đào thải của axit uric

- Axit uric là một hợp chất khác vòng của cacbon, nito, oxi, và hydrovới công thức C5H4N4O3 Là một axit yếu nên thường bị ion hóa thành muối

sodium uraturatee [20] Axit uric kết tủa trong môi trường pH axit

- Axit uric là một chất có nguồn gốc từ quá trình dị hóa các bazơ purin(ademin và guanidin) của các axit nucleic

- Các nguồn gốc chính tạo axit uric trong cơ thể bao gồm:

a Các thức ăn chứa purin (100 – 200 mg/ngày)

b Từ nguồn axit uric nội sinh do quá trình thoái biến các axit nucleiccủa cơ thể (600 mg/ngày)

Ribose-5p + ATP PRPP + Glutamin

5

7

4 1

3

Hình 1.1 Sơ đồ sinh tổng hợp axit uric trong cơ thể người

1: Amidophoribosyl ferase

2: Hypoxanthine- Guanine phospho ribosyl Transferase

3: Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase- (PRPP Synthetase)

hơn tại niêm mạc ruột Quá trình tổng hợp axit uric cần tới sự xúc tác củaenzym xanthin oxydase Allopurinol ức chế enzym này và được sử dụng đểđiều trị tình trạng tăng axit uric máu

- Axit uric được tạo thành trong cơ thể do quá trình thoái giáng cácnhân purin, sau đó chúng được hòa tan trong máu và đưa đến thận và thải rangoài qua nước tiểu Axit uric tăng có thể do quá trình tăng cung cấp, tăng tạohoặc giảm thải trừ axit uric qua thận hoặc cả hai quá trình này

- Các con đường thải trừ chính của axit uric trong cơ thể gồm:

a Qua nước tiểu (400 – 1000 mg/ngày): Ở thận, axit uric được lọc quacầu thận, 95% lượng lọc được tái hấp thu ở các ống lượn gần, rồi được bàixuất tích cực ở các ống lượn xa

b Qua đường tiêu hóa (100 – 200 mg/ngày): Mặc dù đây là con đườngthải trừ chủ yếu, tuy vậy có thể thấy axit uric trong mật, dịch vị và các dịchtiết của ruột [21] [1].

1.1.4 Cơ chế lắng đọng của axit uric và ảnh hưởng của nó đối với cơ thể

Phần lớn axit uric trong máu ở dạng tự do, chỉ khoảng < 4% gắn vớiprotein huyết thanh Nồng độ axit uric máu trung bình ở :

Cơ chế lắng đọng axit uric trong cơ thể chủ yếu là do tăng axit uric máukéo dài, cơ thể có hàng loạt phản ứng thích nghi nhằm giảm axit uric trongmáu bằng cách: tăng bài tiết qua thận,; lắng đọng muối uraturate trong các tổchức như màng hoạt dịch, da, kẽ thận, gân, Từ đó, dẫn đến sự biến đổi vềhình thái học của các tổ chức này Tăng axit uric trong dịch khớp dẫn đến kếttủa thành các tinh thể hình kim gây tổn thương sụn, màng hoạt dịch và baokhớp Qua chỗ sụn bị tổn thương các tinh thể xâm nhập xuống tận lớp xươngdưới sụn, hình thành các hạt tophi, gây phá huỷ xương dưới dạng ổ khuyếtxương hình cầu Viêm màng hoạt dịch, tăng sinh màng hoạt dịch, thâm nhiễmcác tế bào lympho là tổn thương thứ phát Sự lắng đọng các tinh thể ở tổ chứctạo thành các hạt tophi kíkích thước to nhỏ khác nhau, lắng đọng ở kẽ thậndẫn đến tổn thương thận như sỏi thận, viêm thận kẽ, xơ hóa cầu thận Tổnthương lan rộng dẫn đến suy thận, tăng huyết áp Từ đó có thể thấy, sự lắng

đọng axit uric là yếu tố tiên lượng quan trọng [20] Có tình trạng gây nên mộtquay vòng tế bào (turnover) nhanh hoặc gây chậm trễ bài tiết axit uric củathận có thể gây tăng nồng độ axit uric huyết thanh Lượng axit uric trongnước tiểu tăng quá mức có thể gây kết tủa và hình thành sỏi uraturate trong hệtiết niệu Các nguyên nhân gây tích tụ axit uric trong cơ thể thường gặp nhất

là cơ địa di truyền với khuynh hướng gây tăng sản xuất quá mức axit uric vàsuy giảm chức năng thận gây giảm khả năng bài tiết axit uric Mặt khác, khinồng độ axit uric trong cơ thể quá thấp gây nên bệnh đa xơ cứng ở người

1.1.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của axit uric trong viêm khớp

- Axit uric tăng cao: Nguyên nhân chính gây bệnh Gout

Khả năng hòa tan của axit uric là đóng vai trò quan trọng là nguyênnhân gây bệnh Gout Độ tan trong nước của các muối được hình thành từ axituric với kim loại kiềm và kiềm thổ là khá thấp Tất cả các muối này thể hiệntính tan tốt trong nước nóng hơn là nước lạnh, do đó cho phép kết tinh lại dễdàng Khả năng hòa tan thấp này là một nguyên nhân gây nên bệnh Gout Nóthể hiện ở việc tăng quá mức nồng độ axit trong huyết thanh có thể gây tìnhtrạng lắng đọng chất này tại các khớp và mô mềm gây bệnh Gout (một tìnhtrạng đáp ứng viêm đối với sự lắng đọng của các tinh thể uraturate)

Có thể nói, chỉ số axit uric là chỉ số quyết định trong việc chẩn đoánmột bệnh nhân có bị bệnh Gout hay không và mức độ nguy hiểm của bệnhđang ở giai đoạn nào Axit uric là sản phẩm chuyển hóa của chất đạm có nhânpurin Chất đạm có nhân purin được tìm thấy nhiều trong một số loại thựcphẩm và đồ uống như phủ tạng động vật, cá biển, đậu Hà Lan, bia, rượu,…

Như đã phân tích ở trên, axit uric được thận đào thải qua đường nướctiểu nhưng do chúng ta ăn các đồ ăn nhiều đạm, uống nhiều bia rượu khiếntăng tổng hợp axit uric hoặc do chức năng của thận suy giảm khiến giảm đàothải axit uric làm cho lượng axit uric trong máu tăng cao Ban đầu, nồng độaxit uric trong máu tăng cao tuy nhiên chưa xuất hiện các triệu chứng, chưaxuất hiện các cơn Gout cấp, giai đoạn này thường gọi là “tăng axit uric máu”,chưa phải Gout Tuy nhiên, khi lượng axit uric trong máu tăng cao kéo dài sẽlắng đọng tinh thể uraturate ở các khớp gây ra các đợt viêm khớp cấp hay còngọi là cơn Gout cấp, khi đó tăng axit uric máu đã tiến triển thành bệnh Gout[20]

Chỉ số axit uric phải là một con số chính xác không phải là một kết quảđịnh tính như cao, bình thường, hay thấp Bởi vì mỗi mức chỉ số axit uric mô

tả tình trạng bệnh của bệnh nhân Gout đang ở mức độ nguy hiểm nào Tuynhiên, mỗi cơ sở khám chữa bệnh đều dùng những loại máy của riêng mình

và cho kết quả ở những đơn vị đo lường khác nhau khiến cho các bệnh nhânkhó hiểu trong quá trình theo dõi tiến triển của bệnh Bệnh nhân có thể dựavào chỉ số axit uric được chỉ ra ở bảng 1.1 dưới đây để xác định mức độ diễnbiến của bệnh Gout

Bảng 1.1 Các chỉ số axit với các cảnh báo về mức độ của bệnh Gout

mg/

< 60 < 350 Tốt: Ở mức độ này sẽ không cho hình thành các tinh thể

uraturate và giải phóng các tinh thể uraturate lắng đọng ởkhớp.

60

Cảnh báo: Xuất hiện một vài biểu hiện như tê, ngứa và đỏ

da, hoặc các triệu chứng thông thường của bệnh Gout.gút

> 70 > 400

Tình trạng xấu: Các tinh thể uraturate hình thành nhiềuhơn, các tinh thể uraturate lắng đọng không được giảiphóng tạo nên các cục tophy (tophi) Tình trạng ngày càngxấu

Bảng 1.1: Các chỉ số axit với các cảnh báo về mức độ của bệnh Gout

Từ đó có thể thấy, chỉ số axit uric nên được duy trì ở mức dưới 60 mg/dl

để tránh những diễn biến theo chiều hướng xấu của bệnh Gout bằng cách trongquá trình điều trị, ngoài dùng thuốc theo chỉ định, bệnh nhân Gout cần chú ý

cả việc ăn kiêng và tăng cường chức năng của thận để duy trì lượng axit urictrong ngưỡng cho phép

1.1.6 Các yếu tố ảnh hưởng tới việc phân tích và định lượng axit uric

- Các thuốc có thể làm tăng nồng độ axit uric máu là:

Adrenalin, acetaminophon, ampicpicllin, axit ascorbic, thuốc chặn bêtagiao cảm, caffein, các hóa chất điều trị ung thư, ciclosporin, diltiazem, thuốclợi tiểu, nhóm THIAZID, G-CSF, isoniazid, levodoba, lisinoprin, methyldopa,niacin, thuốc kháng viêm không phải Steroid, phenothiazin, risampin

- Các thuốc có thể làm giảm nồng độ axit uric máu là:

Acetazolamid, allopurinol, corticosteroid, analapril, estrogen, lithium,mannitol, probenecid, salicylat,…

Vì vậy mà khi nghiên cứu cũng như theo dõi nồng độ axit uric trong cơthể người cần chú ý tới những ảnh hưởng trên [211]

1.2 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 1.2.1 Khái niệm về sắc ký và sắc ký lỏng hiệu năng cao [3,8]

1.2.1.1 Khái niệm về sắc ký

Sắc ký là môt nhóm các phương pháp hóa lý dùng để tách các thànhphần của một hỗn hợp Sự tách sắc ký được dựa trên sự phân chia khác nhauvào hai pha luôn tiếp xúc và không hòa lẫn vào nhau: một pha tĩnh và mộtpha động

1.2.1.2 Khái niệm về sắc ký lỏng hiệu năng cao

HPLC (High performance liquid chromatoghraphy) là một phươngpháp hóa lý dựa vào ái lực khác nhau của các chất khác nhau giữa hai phaluôn tiếp xúc và không đồng tan với nhau Pha động là chất lỏng chảy qua cộtvới một tốc độ nhất định dưới áp suất cao, còn pha tĩnh là chất rắn dưới dạnghạt mịn hoặc chất lỏng được bao trên một chất mang rắn, hoặc một chất mangrắn đã được liên kết hóa học với các nhóm hữu cơ Pha động cùng với mẫuthử được bơm qua cột dưới áp suất cao, các chất phân tích sẽ di chuyển theopha động qua cột với tốc độ khác nhau tùy theo ái lực của chúng với hai pha

và dẫn đến sự tách các chất Các chất sau khi ra khỏi cột được nhận biết bởi

bộ phận phát hiện là detector Quá trình sắc ký dựa trên cơ chế hấp phụ, phân

bố, trao đổi ion hay rây phân tử là tùy thuộc loại pha tĩnh sử dụng

1.2.2 Nguyên tắc cấu tạo của máy HPLC

Do bản chất hóa học của chất phân tích khác nhau nên có nhiều kỹthuật để tách định lượng bằng sắc ký lỏng Tuy vậy, nguyên tắc cấu tạo củamột máy sắc ký lỏng đều giống nhau, có cùng một số bộ phận kết nối vớinhau, được thể hiện ở hình 1.2:

Hình 1.2.2: Sơ đồ hoạt động của thiết bị HPLC

Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao gồm các bộ phận sau: Bình chứa pha động,bơm đẩy pha động qua hệ thống sắc ký ở áp suất cao, hệ bơm mẫu để đưa mẫuvào pha động, cột sắc ký, detector, máy tính hay máy phân tích hoặc máy ghi

1.2.2.1 Hệ thống bơm

Hệ thống bơm của HPLC là “bơm cao áp” có nhiệm vụ bơm pha động

qua cột tách với tốc độ xác định phục vụ quá trình rửa giải các chất ra khỏicột sắc ký, nó phải có độ ổn định và lặp lại cao của tốc độ bơm Có bơm 1

có áp suất từ 0 - 400 bar, nhưng bơm 2 kênh cho độ ổn định hơn

Hệ bơm hiện đại này được điều khiển bằng máy tính có thể lập trươngtrình để thay đổi tỷ lệ của thành phần pha động theo yêu cầu (sắc ký gradient)

Bơm HPLC cần phải đáp ứng một số yêu cầu sau:

- Tạo được áp suất cao 3000 -6000 psi (250 -500 atm)

- Không bị ăn mòn với các thành phần pha động

- Có tốc độ bơm không đổi

1.2.2.2 Hệ bơm mẫu

Để đưa mẫu vào cột có thể bơm mẫu bằng tay hay bơm mẫu bằng hệbơm mẫu tự động Thể tích bơm được xác định nhờ vòng chứa mẫu (bơm tay)hay trong hệ bơm mẫu tự động Sai số bơm mẫu dùng van khoảng 0,5%

1.2.2.3 Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao

Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao thường được chế tạo bằng thép không gỉ,

mm Thường có cột nhồi và cột bảo vệ

Cột nhồi thường có hạt cỡ 5 ÷ 10 µm Gần đây có loại cột nhỏ với

đạt hiệu quả phân tách tốt hơn, nhưng hiếm khi tiến hành ở nhiệt độ trên 600C

vì nhiệt độ có thể làm suy giảm hiệu lực cột hoặc làm pha động bay hơi

Chất nhồi cột thường là Silicagel có bao một lớp mỏng chất hữu cơ(hoặc liên kết hóa học với một chất hữu cơ) Bên cạnh Silicagel người ta còndùng những hạt khác: nhôm oxit, polyme xốp, chất trao đổi ion

Cột bảo vệ được đặt trước cột sắc ký để loại các chất có mặt trong phađộng và trong mẫu phân tích làm giảm tuổi thọ của cột

1.2.2.4 Detector

Detector là bộ phận để thu nhận và phát hiện tín hiệu và đo các tín hiệusinh ra khi có chất ra khỏi cột và các tín hiệu này được ghi dưới dạngpicpícpic trên sắc kíký đồ

Detector trong sắc ký lỏng cần đáp ứng các yêu cầu sau:

- Đáp ứng nhanh và lặp lại

- Độ nhạy cao, có thể phát hiện chất phân tích ở khối lượng hoặc nồng

độ thấp

- Vận hành ổn định, sử dụng dễ dàng

- Khoảng hoạt động tuyến tính rộng

- Ít thay đổi theo nhiệt độ và tốc độ dòng

Các loại detector được dùng phổ biến là:

- Sự hấp thụ quang phân tử vùng UV-VIS

Detector tử ngoại (UV) dùng đèn thủy ngân cho các vạch 254 nm và

280 nm (chủ yếu 254 nm) Loại này được sử dụng chủ yếu trong quá trìnhtiến hành do các hợp chất hữu cơ độc hại chứa vòng thơm thường hấp thụ ởbước sóng 275 nm

Các loại detector được dùng phổ biến là:

- Sự hấp thụ quang phân tử vùng UV-VIS

Detector tử ngoại (UV) dùng đèn thuỷ ngân cho các vạch 254 nm và 280 nm(chủ yếu là 254 nm) Loại này được sử dụng chủ yếu trong quá trình tiến hành

do các hợp chất hữu cơ độc hại chứa vòng thơm thường hấp thụ ở bước sóng 275

nm

Detector khả kiến (đèn Deuterium) và khả kiến (đèn Vonfram) có thể làm việc

ở bước sóng tuỳ ý chọn theo tính chất hấp thụ ánh sáng của chất muốn pháthiện Loại này hiện nay được dùng nhiều nhất

- Sự hấp thụ hay phát xạ của nguyên tử

- Tính chất phát huỳnh quang của nguyên tử hay phân tử

- Detector đo chỉ số khúc xạ (RI) là detector vạn năng nhưng kém nhạy

- Bộ dẫn nhiệt của các chất

- Sự biến thiên dòng điện giữa 2 điện cực

- Độ dẫn điện của chất

- Sự biến thiên chiết suất của dung dịch mẫu

Nhưng dù loại nào nó cũng phải đạt được những yêu cầu nhất định và

cứ ứng với mỗi loại tính chất đó thì ta có một loại detector Ví dụ như:

detector phổ hấp thụ phân tử UV-VIS (190-1000 nm), detector huỳnh quang,

detector đo độ dẫn điện của dung dịch Độ nhạy của các loại detertor được ghitrong bảng 1.2

Bảng 1.2 Độ nhạy của các loại detertor

- Hay computer với video

computer và có cài chương trình chạy sắc ký, hệ thống bơm mẵu mẫu tự dộngđộng,… …

1.2.3 Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký và các yếu tố ảnh hưởng

Hình 1.3.: Sắc ký đồ của hai chất và các thông số đặc trưng

1.2.3.1 Hệ số phân bố K (Partition coefficient)

Tốc độ di chuyển của chất tan qua pha tĩnh xác định bởi hệ số phân bố K:

Trị số K càng lớn, sự di chuyển của chất tan qua pha tĩnh càng chậm.Nếu các chất trong hỗn hợp có hằng số K khác nhau càng nhiều, thì khả năngtách diễn ra càng dễ dàng hơn

1.2.3.2 Thời gian lưu t R (Retention time)

Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ lúc bơm mẫu vào cộtcho đến khi chất tan ra khỏi cột sắc ký đạt giá trị nồng độ cực đại, tới detector

và cho picpícpic trên sắc ký đồ

tR’: là thời gian lưu hiệu chỉnh (thời gian lưu thực).

t0: là thời gian lưu của một chất không bị lưu giữ (thời gian chết)

Trong cùng một điều kiện sắc ký đã chọn, thời gian lưu của mỗi chất làhằng định Các chất khác nhau thì thời gian lưu khác nhau phụ thuộc vào bảnchất, cấu tạo và tính chất của chất đó Vì vậy, thời gian lưu là đại lượng địnhtính các chất

1.2.3.3 Hệ số dung lượng k’

Hệ số k’ là một thông số quan trọng mô tả tốc độ di chuyển của chấtphân tích A qua cột Hệ số k’ còn được gọi là hệ số phân bố khối lượng giữahai pha

Ta có:

M

S M

S

V

V K Q

0 '

t t

tR nhỏ do đó khả năng tách kém Thường chọn điều kiện phân tích sao cho k’nằm trong khoảng từ 1-5 là tốt nhất.

1.2.3.4 Hệ số chọn lọc α

Hai chất chỉ được tách ra khỏi nhau khi chúng có giá trị k’ khác nhau, hệ

số chọn lọc cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc ký:

' ' 0

0 '

'

RA

RB RA

RB A

B

t

t t t

t t k

k

0

RB RA

t t

(1.5)Theo qui ước, ở đây B là chất lưu giữ mạnh hơn A, vì vậy α luôn lớnhơn 1, α càng lớn thì khả năng tách của hai chất càng rõ, để Để tách riêng haichất thường chọn 1,5 ≤ α ≤ 2,0

1.2.3.5 Lý thuyết đĩa

- Số đĩa lý thuyết N và chiều cao đĩa lý thuyết H:

Cột sắc ký được coi là có N lớp mỏng, ở mỗi lớp có sự phân bố chất tanvào hai pha được coi là đạt đến một trạng thái cân bằng Những lớp mỏng nàyđược gọi là đĩa lý thuyết

H N L H = (1.6)Trong đó:

H: chiều cao đĩa lý thuyết

2

54 , 5 16

t

Trong đó: tR:là thời gian lưu (phút).

W0.5: chiều rộng của picpícpic đo ở nửa chiều cao picpícpic W: chiều rộng đo ở đáy picpícpic

Cột có N lớn hay H nhỏ là cột có hiệu lực cao, khi đó độ doãngpicpícpic nhỏ Trong thực tế N nằm trong khoảng 2500 đến 5500 là được

- Độ phân giải R S RS:

Độ phân giải là đại lượng đo mức độ tách hai chất ra khỏi nhau trongcùng một điều kiện sắc ký Độ phân giải của hai pic píc pic cạnh nhau đượctính như sau:

 A  B

RA RB B

A

RA RB S

W W

t t W

W

t t R

5 , 0 5

, 0

18 , 1 2

B

k N

Khi: R SRS= 0,75 hai picpícpic tách không tốt, còn xen phủ nhau nhiều

RSR S = 1,0 hai picpícpic tách khá tốt, còn xen phủ 4%

R SRS = 1,5 hai picpícpic tách gần hoàn toàn, chỉ xen phủ 0,3%.Như vậy, để tăng độ phân giải R S RS có các biện pháp sau:

- Tăng số đĩa lý thuyết N: dùng cột dài hơn hoặc giảm tốc độ dòngpha động

- Tăng α: thay loại pha tĩnh hoặc thay đổi thành phần pha động.

X W

mép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao picpícpic

1.2.4 Pha tĩnh trong HPLC

Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi cột có nhiệm vụ tách một hỗn hợpchất phân tích Pha tĩnh có bản chất là chất rắn, xốp và kíkíých thước hạt rấtnhỏ, đường kíkýính cỡ hạt từ 3-10 µm, diện tích bề mặt riêng từ 50 - 500

m2/g

1.2.4.1 Phân loại pha tĩnh

- Căn cứ theo bản chất chính của quá trình sắc ký trong cột tách, người

ta chia nó thành nhiều loại như hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, rây phân tử.Tương ứng với các loại chất nhồi như thế người ta có một loại sắc ký riêngtrong kỹ thuật HPLC

- Căn cứ theo trạng thái rắn hoặc lỏng của pha tĩnh Nếu pha tĩnh làchất rắn, người ta có sắc ký lỏng-rắn (LSC) Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta

có sắc ký lỏng-lỏng (LLC)

- Căn cứ theo cấu trúc xốp của pha tĩnh là các hạt rắn, người ta chia nólàm hai loại là xốp toàn phần hạt và xốp chỉ ở lớp vỏ ngoài (xốp bề mặt)

1.2.4.2 Yêu cầu của pha tĩnh trong HPLC

- Phải trơ và bền vững với môi trường sắc ký

- Có khả năng tách một hỗn hợp chất tan nhất định

- Tính chất bề mặt ổn định, đặc biệt là đặc trưng xốp của nó

- Cân bằng động học của sự tách phải xảy ra nhanh và lặp lại tốt

- Cỡ hạt phải tương đối đồng nhất

- Vì Silica là loại pha tĩnh hay dùng và ưu việt nên trong sắc ký thườngdùng một số loại Silica:

- Silica trung tính, trên bề mặt còn có các nhóm ( –OH) phân cực(ưa nước)

- Loại này sử dụng làm pha tĩnh cho sắc ký hấp phụ pha thuận để phântích các chất ít phân cực

- Silica đã alkyl hóa, được điều chế bằng cách alkyl hóa các nhóm

( –OH) trên bề mặt Silica bằng các gốc alkyl của mạch cacbon (C2, C8, C18)hay các gốc cacbon vòng

- Silica sulfon hóa hay nitro hóa để làm pha tĩnh trong trao đổi cation.Silica amin hóa dùng làm pha tĩnh trong sắc ký trao đổi anion Trong bảng 1.3đưa ra một vài ví dụ về pha tĩnh được dùng trong HPLC

Trên

3 Micropack CH C18 Silica Hấp phụ pha ngược (RP)

Pha động có thể ảnh hưởng tới:

- Độ chọn lọc của hệ pha động

- Thời gian lưu giữ của chất tan

- Hiệu lực tách của cột

- Độ phân giải của chất tan

- Độ rộng của picpícpic sắc ký

Do vậy việc lựa chọn pha động thích hợp là rất quan trọng Yêu cầu củapha động:

- Phải trơ với pha tĩnh

- Phải hòa tan được chất mẫu

- Phải bền vững theo thời gian.

- Phải có độ tinh khiết cao

- Nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký

- Phù hợp với loại detector

- Phải có tính kinh tế và phù hợp với môi trường

Bốn vấn đề cần được xem xét và chọn pha động cho phù hợp:

- Bản chất của dung môi để pha chế pha động

- Thành phần các chất tạo ra pha động

- Tốc độ dòng pha động

- pH của pha động

1.2.6 Chọn pH cho dung dịch đệm

Trong nhiều trường hợp của sắc ký hấp phụ pha đảo thường phải cho

phải ổn định trong trường hợp sắc ký tạo cặp ion, sắc ký đổi ion, sắc ký hấpphụ mà chất tan có tính chất axit hay bazơ

1.2.7 Nguyên tắc lựa chọn pha tĩnh và pha động

Cách lựa chọn pha tĩnh và pha động thích hợp để tách được hỗn hợpchất cần phân tích là rất quan trọng Dựa vào tính chất của mỗi pha đã nêutrên người ta chọn pha tĩnh, pha động phù hợp nhau, chẳng hạn:

- Sắc ký pha thuận: Pha động là các dung môi hữu cơ kị nước, khôngphân cực hay ít phân cực Cột hay sử dụng là cột Lichrosorb Si 60

- Sắc ký pha đảo: Pha động là hệ dung môi phân cực, các dung môi tanđược trong nước, điển hình là methanol, acetonitril Nói chung dung môi cho

dịch đệm pH (hay sử dụng dung dịch đệm photphat) để ổn định cho quá trìnhsắc ký Sắc ký pha đảo thường dùng để tách các chất phân cực Có nhiều cột