Định lượng đồng thời acetaminophen, codein photphat trong thuốc actadol codein bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử (UV VIS)

Hiện nay trên thế giới và ở Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu áp dụng nhiều phương pháp định lượng khác nhau trong đó có phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC, phương pháp

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

(HPLC)

VÀ PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HẤP THỤ PHÂN TỬ (UV-VIS)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC VẬT CHẤT

THÁI NGUYÊN - 2015

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

VÀ PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HẤP THỤ PHÂN TỬ (UV-VIS)

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi cùng với sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS Mai Xuân Trường Các số liệu, kết quả nghiên cứu nêu trong luận văn là hoàn toàn trung thực Nếu sai tôi chịu hoàn toàn trách nhiệm

Thái Nguyên, tháng 4 năm 2015

PGS.TS NGUYỄN THỊ HIỀN LAN PGS.TS MAI XUÂN TRƯỜNG

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè những người đã luôn bên tôi, động viên và khuyến khích tôi trong quá trình thực hiện

đề tài nghiên cứu của mình

, chắc chắn luận văn không thể tránh khỏi những thiếu sót Tác giả rất mong nhận được các ý kiến đóng góp chân thành từ các thầy giáo, cô giáo và bạn đọc

Xin chân thành cảm ơn !

Thái Nguyên, tháng 4 năm 2015

Tác giả

Trần Quốc Chính

MỤC LỤC

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục các từ viết tắt của luận văn iv

Danh mục các bảng của luận văn v

Danh mục các hình của luận văn vi

MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 Tổng quan về acetaminophen, codein phot phat 2

1.1.1 Acetaminophen 2

1.1.1.1 Giới thiệu chung 2

1.1.1.2 Tính chất 2

1.1.1.3 Dược lý cơ chế tác dụng 4

1.1.1.4 Dạng thuốc 5

1.1.2 Codein photphat 6

1.1.2.1 Giới thiệu chung 6

1.1.2.2 Tính chất 7

1.1.2.3 Tổng hợp 7

1.1.2.4 Dược lý và cơ chế tác dụng 7

1.1.2.5 Dạng thuốc 8

1.2 Các định luật cơ sở của sự hấp thụ ánh sáng 8

1.2.1 Định luật Bughe - Lămbe – Bia 8

1.2.2 Định luật cộng tính 8

1.2.3 Những nguyên nhân làm cho sự hấp thụ ánh sáng của dung dịch không tuân theo định luật Bughe – Lămbe – Bia 9

1.3 Một số phương pháp xác định đồng thời các cấu tử 10

1.3.1 Phương pháp Vierordt 10

1.3.2 Phương pháp phổ đạo hàm 12

1.3.3 Phương pháp lọc Kalman 14

1.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 15

1.4.1 Nguyên tắc của phương pháp HPLC 15

1.4.1.1 Pha tĩnh 16

1.4.1.2 Pha động 17

1.4.2 Các đại lượng đặc trưng của quá trình sắc kí 18

1.4.2.1 Thời gian lưu và thể tích lưu 18

1.4.2.2 Hệ số phân bố 19

1.4.2.3 Hệ số chọn lọc 19

1.4.2.4 Số đĩa lý thuyết và chiều cao đĩa lý thuyết 19

1.4.2.5 Độ phân giải (R S) 20

1.4.3 Hệ thống máy HPLC 21

1.4.4 Kết quả xác định một số chất theo phương pháp HPLC 21

Chương 2: THỰC NGHIỆM 23

2.1 Nội dung nghiên cứu 23

2.1.1 Phương pháp HPLC 23

2.1.2 Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử 23

2.2 Phương pháp nghiên cứu 24

24

24

2.2.2.1 Phương pháp HPLC 24

2.2.2.2 Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử 24

24

2.3 Đánh giá độ tin cậy của quy trình phân tích 25

2.3.1 Giới hạn phát hiện (LOD) 25

2.3.2 Giới hạn định lượng (LOQ) 25

2.3.3 Đánh giá độ tin cậy của phương pháp 25

2.3.4 Đánh giá kết quả phép phân tích theo thống kê 26

2.4 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 27

2.4.1 Thiết bị 27

2.4.2 Dụng cụ 27

2.4.3 Hóa chất 27

2.4.4 Chế phẩm actadol codeine 28

28

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 30

3.1 Phương pháp HPLC 30

3.1.1 Xây dựng điều kiện để xác định đồng thời 2 chất ACT và CĐI 30

3.1.1.1 Khảo sát lựa chọn pha động 30

3.1.1.2 Lựa chọn bước sóng 30

3.1.1.3 Lựa chọn tốc độ dòng 31

3.1.2 Đánh giá phương pháp định lượng 33

3.1.2.1 Chuẩn bị dung dịch hỗn hợp chuẩn 33

3.1.2.2 Kiểm tra tính thích hợp của hệ thống 33

3.1.2.3 Khảo sát độ tuyến tính của phương pháp 34

3.1.2.4 Khảo sát độ lặp lại của phương pháp sắc ký 36

3.1.3 Xác định ACT và CĐI trong thuốc Actadol codein 37

3.1.4 Khảo sát độ đúng của phép xác định ACT và CĐI theo phương pháp thêm chuẩn 38

3.2 Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử 39

3.2.1 Khảo sát phổ hấp thụ phân tử của ACT và CĐI 39

3.2.2 Kiểm tra sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của ACT và CĐI vào pH 40

3.2.3 Kiểm tra sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của ACT và CĐI theo thời gian 40

3.2.4 Kiểm tra sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của ACT và CĐI theo nhiệt độ 41

3.2.5 Khảo sát khoảng tuyến tính tuân theo định luật Bughe – Lambe – Bia của ACT và CĐI Xác định chỉ số LOD và LOQ 42

42

3 43

3.2.5.3 Khảo sát khoảng tuyến tính của CĐI 44

45

3.2.6 Khảo sát và đánh giá độ tin cậy của phương pháp nghiên cứu trên các mẫu tự pha 46

46

3.2.7 Xác định hàm lượng ACT và CĐI trong thuốc Actadol codein 48

3.2.8 Đ 49

KẾT LUẬN 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO 53

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CỦA LUẬN VĂN

Giới hạn phát hiện Limit Of Detection LOD Giới hạn định lượng Limit Of Quantity LOQ

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu

năng cao

High Performance Liquid

DANH MỤC CÁC BẢNG CỦA LUẬN VĂN

Bảng 3.1 Giá trị các đại lượng đặc trưng 33

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát thời gian lưu 34

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát diện tích pic 34

Bảng 3.4 Mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của ACT và CĐI 35

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát độ lặp lại 36

Bảng 3.6 Kết quả phân tích thuốc Actadol codein 37

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát độ đúng 38

40

41

theo nhiệt độ 41

Bảng 3 43

44

45

Bảng 3.14 Kết quả tính LOD và LOQ của CĐI 46

46

47

Bảng 3.17 Kết quả tính nồng độ, sai số ACT và CĐI trong mẫu thuốc Actadol codein 48

Bảng 3.18 Hàm lượng các chất chuẩn ACT và CĐI thêm vào mẫu thuốc Actadol codein 49

Bảng 3.19 Kết quả xác định độ thu hồi của ACT và CĐI trong mẫu thuốc Actadol codein 50

DANH MỤC CÁC HÌNH CỦA LUẬN VĂN

1.1 Mô hình hoạt động của bộ lọc Kalman 15

Hình 1.2 Thời gian lưu của cấu tử phân tích 19

Hình 1.3 Hình ảnh máy HPLC 21

Hình 2.1 Chế phẩm thuốc Actadol codein 28

Hình 3.1 Sắc kí đồ của ACT (500 µg/mL) 31

Hình 3.2 Sắc kí đồ của CĐI (8 µg/mL) 31

Hình 3.3 Sắc kí đồ của ACT (1) và CĐI (2) 32

Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của ACT 35

Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của CĐI 36

3.6 Phổ hấp thụ của các dung dịch chuẩn ACT và CĐI 39

Hình 3.7 Phổ hấp thụ quang của ACT ở các nồng độ 0,2 40,0 g/mL 42

3.8 43

Hình 3.9 Phổ hấp thụ quang của CĐI ở các nồng độ 0,2 40 g/mL 44

Hình 3.10 Đường hồi quy tuyến tính biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ quang A vào nồng độ CĐI 45

MỞ ĐẦU

Khi xã hội càng phát triển thì vấn đề bảo vệ sức khỏe của con người ngày càng được quan tâm, vì vậy ngành dược phẩm cũng phát triển không ngừng, hiện nay các nhà dược phẩm đã sản xuất ra rất nhiều loại thuốc như cảm cúm, giảm đau, hạ sốt, nhức đầu, ho… được bán rộng rãi với những tên gọi và thành phần rất khác nhau Việc định lượng các chất trong thuốc này theo tiêu chuẩn nhà sản xuất là rất cần thiết trong công tác kiểm nghiệm dược

Hiện nay trên thế giới và ở Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu áp dụng nhiều phương pháp định lượng khác nhau trong đó có phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC), phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử, những phương pháp này có độ lặp và độ chính xác cao, ngoài ra sử dụng phương pháp trắc quang dùng phổ toàn phần kết hợp với kĩ thuật tính toán và ứng dụng phần mềm máy tính đã bước đầu được nghiên cứu và cho nhiều ưu điểm như độ nhạy,

độ lặp, độ chính xác, độ tin cậy của phép phân tích, phân tích nhanh, tiện lợi

:

acetaminophen, codeine phosphate trong thuốc Actadol codeine bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao và phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử”

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về acetaminophen, codein phot phat

1.1.1 Acetaminophen

1.1.1.1 Giới thiệu chung

- Tên quốc tế: Pracetamol

- Tên khác: Acetaminophen

- Mã giải phẫu - điều trị - hóa học: NO2B EO1

- Biệt dược: Panadol, Pradon, Efferalgan, Pandol

- Công thức phân tử: C8H9O2N

- Khối lượng mol phân tử: 151,17g/mol

- Công thức cấu tạo:

- Tên IUPAC: N-(4-hydroxyphenyl) acetamit hoặc p-hydroxy acetanilit hoặc 4-hydroxy acetanilit

- Tên gọi acetaminophen được lấy từ tên hóa học của hợp chất para- acetyl aminophenol [1-4]

1.1.1.2 Tính chất

Tính chất vật lý

- ACT là chất bột kết tinh màu trắng, không mùi, vị đắng nhẹ

- Khối lượng riêng: 1,263 g/cm3

- Nhiệt độ nóng chảy: 1690

C

- Độ tan trong nước: 0,1÷0,5g/100mL nước tại 220

C Ngoài ra còn có khả năng tan trong etanol, dung dịch kiềm, dung dịch axit

- Chế phẩm tan ít trong nước, tan nhiều hơn trong nước sôi, khó tan trong clorofom, ete, etanol và các dung dịch kiềm dung dịch bão hòa trong nước có

muối sắt (III) cho màu tím

-, thêm nước thì không có kết tủa vì p-aminophenol tạo thành tan trong axit Thêm thuốc thử kali dicromat thì có kết tủa màu tím khác với phenacetin là không chuyển sang đỏ

Quá trình xảy ra chủ yếu là:

HO NHCOCH3 HCl

K2Cr2O7[O]

đắng Năm 1948, Brodie và Axelrod đã nghiên cứu việc sử dụng thuốc acetanilide và họ phát hiện ra rằng, tác dụng giảm đau của acetanilide là do acetaminophen – một chất chuyển hóa của acetanilide và họ chủ trương tổng hợp và sử dụng như một thuốc giảm đau hạ sốt Sau này, acetaminophen trở thành thuốc giảm đau hạ sốt được sử dụng rộng rãi nhất với rất nhiều tên biệt dược được lưu hành

Acetaminophen được tổng hợp theo 4 bước từ nguyên liệu đầu là phenol:

- Phenol được nitro hóa bởi axit sunfuric và natri nitrit tạo ra hỗn hợp 2 đồng phân o, p-nitro phenol

- Đồng phân para được tách ra khỏi đồng phân ortho bằng phản ứng thủy phân

- Khử para-nitro phenol bằng NaBH4

para-aminophenol

- Para-aminophenol phản ứng với anhidrit axetic cho ra acetaminophen

Đem kết tinh acetaminophen lại trong hỗn hợp etanol-nước

1.1.1.3 Dược lý cơ chế tác dụng

Acetaminophen là chất chuyển hóa có hoạt tính của phenacetin, thuộc nhóm thuốc giảm đau hạ sốt Acetaminophen làm giảm đau bằng cách làm tǎng ngưỡng đau Thuốc làm hạ sốt thông qua tác động trên trung khu điều

nhiệt của não

Acetaminophen được dùng để làm giảm tạm thời sốt, nhức và đau do cảm lạnh thông thường và các nhiễm virus khác Thuốc cũng được dùng để giảm đau đầu, đau lưng, đau rǎng, nhức cơ Acetaminophen làm giảm đau trong viêm khớp nhẹ nhưng không có tác dụng trên tình trạng viêm, đỏ và sưng khớp Gần đây thuốc được cho là có hiệu quả ngang với thuốc chống viêm không teroit trong làm giảm đau khớp gối do viêm xương khớp

Cách dùng: Có thể uống cùng hoặc không cùng đồ ǎn Acetaminophen được chuyển hóa ở gan và cần giảm liều ở bệnh nhân rối loạn chức nǎng gan thận

Nói chung acetaminophen được dung nạp tốt với ít tác dụng phụ Khi dùng quá liều acetaminophen có thể gây ra ngộ độc gan, suy gan và thậm chí tử vong Bệnh nhân bị quá liều acetaminophen cần đi khám cấp cứu ngay Điều trị sớm bằng acetylcystein có thể ngǎn ngừa hủy hoại gan hoặc tử vong Các dấu hiệu và triệu chứng ngộ độc gan có thể không rõ trong 2-3 ngày sau khi dùng quá liều Những người thường xuyên uống quá nhiều rượu thường bị ngộ độc gan ở liều acetaminophen thấp hơn Những người hay phải uống acetaminophen không nên uống rượu vì tǎng nguy cơ tổn thương gan Bệnh nhân bị bệnh gan

và thận cũng cần thận trọng khi uống acetaminophen để tránh ngộ độc Acetaminophen không gây quen thuốc

Tác dụng phụ: Khi dùng đúng, tác dụng phụ hiếm gặp Các tác dụng phụ bao gồm vàng da hoặc mắt, phát ban, ngứa, xuất huyết, sốt, đau họng và thiểu niệu

1.1.1.4 Dạng thuốc

- Chế phẩm viên nén: Acetaminophen, Panadol, Donodol…

- Chế phẩm viên đạn: Efferalgan, Panadol…

- Chế phẩm viên sủi: Efferalgan, Donodol, Panadol…

- Chế phẩm gói bột Efferalgan

- Chế phẩm dạng bột tiêm: Pro-Dafalgan 2g pro acetaminophen

- Chế phẩm dạng dung dịch uống

- Các chế phẩm kết hợp với các thuốc khác

1.1.2 Codein photphat

1.1.2.1 Giới thiệu chung

- Tên quốc tế: Codeine phosphate

- Loại thuốc: Giảm đau gây ngủ và giảm ho

- Mã giải phẫu - điều trị - hóa học: R05D A04

- Biệt dược: Codeine phosphate

1.1.2.2 Tính chất

- Tinh thể nhỏ không màu hoặc bột kết tinh trắng, không mùi

- Dễ tan trong nước, khó tan trong ethanol 96%

- Khối lượng riêng: 1,32g/cm3

Codein là methylmorphin, nhóm methyl thay thế vị trí của hydro ở nhóm hydroxyl liên kết với nhân thơm trong phân tử morphin, do vậy codein có tác dụng dược lý tương tự morphin, tức là có tác dụng giảm đau và giảm ho Tuy nhiên codein được hấp thu tốt hơn ở dạng uống, ít gây co thắt mật hơn so với morphin Ở liều điều trị, ít gây ức chế hô hấp (60% thấp hơn so với morphin)

và ít gây nghiện hơn morphin

Codein có tác dụng giảm đau trong trường hợp đau nhẹ và vừa (tác dụng giảm đau của codein có thể là do sự biến đổi khoảng 10 % liều sử dụng thành morphin), vì vậy nên dùng codein kết hợp với các thuốc chống viêm, giảm đau không steroit để tăng tác dụng giảm đau

Codein có tác dụng giảm ho do tác dụng trực tiếp lên trung tâm gây ho ở hành não; codein làm khô dịch tiết đường hô hấp và làm tăng độ quánh của dịch tiết phế quản Codein không đủ hiệu lực để giảm ho nặng Codein là thuốc trấn ho trong trường hợp ho khan

Sau khi uống, chu kỳ bán phân hủy là 2 - 4 giờ, tác dụng giảm ho xuất hiện trong vòng 1 - 2 giờ và có thể kéo dài 4 - 6 giờ Codein được chuyển hóa ở

gan và thải trừ ở thận dưới dạng tự do hoặc kết hợp với acid glucuronic Codein hoặc sản phẩm chuyển hóa bài tiết qua đường tiêu hóa rất ít Codein qua được nhau thai và một lượng nhỏ qua được hàng rào máu - não

1.1.2.5 Dạng thuốc

Viên nén: 15 mg, 30 mg, 60 mg Siro 25 mg/mL

Thuốc nước: 3 mg, 15 mg/5 mL ống tiêm:15 mg, 30 mg, 60 mg/mL

1.2 Các định luật cơ sở của sự hấp thụ ánh sáng

1.2.1 Định luật Bughe - Lămbe – Bia

và bề dày lớp dung dịch mà ánh sáng truyền qua

Phương trình toán học biểu diễn định luật Bughe - Lămbe - Bia

A = b C Trong đó :

A : độ hấp thụ quang của dung dịch ở bước sóng (A không có thứ nguyên)

: hệ số hấp thụ mol phân tử của cấu tử tại bước sóng b: bề dày lớp dung dịch (cm)

C: nồng độ của cấu tử trong dung dịch (mol/lít)

Định luật Bughe – Lămbe – Bia là sự tổ hợp của hai định luật thứ nhất và thứ hai của sự hấp thụ ánh sáng

1.2.2 Định luật cộng tính

Định luật cộng tính là một sự bổ sung quan trọng cho các định luật hấp thụ ánh sáng Định luật cộng tính là cơ sở định lượng cho việc xác định nồng

độ của hệ trắc quang nhiều cấu tử

Bản chất của định luật cộng tính là sự độc lập của đại lượng độ hấp thụ quang của một chất riêng biệt khi có mặt của các chất khác có sự hấp thụ ánh sáng riêng

Biểu diễn tính cộng tính về độ hấp thụ quang của dung dịch hỗn hợp chứa n cấu tử tại bước sóng bằng phương trình toán học:

n

i=1

A =A +A + +A + +A = A Trong đó :

A : độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch hỗn hợp chứa n cấu tử ở bước sóng

A i, : độ hấp thụ ánh sáng của cấu tử thứ i ở bước sóng ; n là số cấu tử hấp thụ ánh sáng có trong hỗn hợp ; với i = 1 n

1.2.3 Những nguyên nhân làm cho sự hấp thụ ánh sáng của dung dịch không tuân theo định luật Bughe – Lămbe – Bia

Xuất phát từ biểu thức của định luật Bughe – Lămbe – Bia A= f( , b, C) nghĩa là độ hấp thụ quang A là hàm số của ba biến:

) Do đó mọi sự sai lệch của các tham số này đều có thể đưa đến làm sai lệch quy luật hấp

- Các điều kiện đo quang như: bề dày cuvet, độ trong suốt của bề mặt cuvet không thật đồng nhất, bề mặt cuvet gây các hiện tượng quang học phụ như tán xạ, hấp thụ

- Sự có mặt của các chất điện giải lạ trong dung dịch màu làm biến dạng các phần tử hoặc các ion phức màu làm ảnh hưởng đến sự hấp thụ ánh sáng của các tiểu phân hấp thụ ánh sáng

- Hiệu ứng solvat hóa: sự solvat hóa (hay hydrat hóa) làm giảm nồng độ các phần tử dung môi tự do, do đó làm thay đổi nồng độ của dung dịch màu và làm ảnh hưởng đến sự hấp thụ ánh sáng của dung dịch màu

- Hiệu ứng liên hợp: trong một số trường hợp có sự tương tác của chính các tiểu phân hấp thụ ánh sáng để tạo ra các tiểu phân polime làm thay đổi nồng độ hợp chất màu

- Ảnh hưởng pH của dung dịch: sự thay đổi nồng độ của ion H+ (tức thay đổi pH) của dung dịch sẽ ảnh hưởng đến sự tuân theo định luật Bughe – Lămbe – Bia theo các trường hợp sau:

+ Thuốc thử có đặc tính axit: sự thay đổi nồng độ ion H+

làm chuyển dịch cân bằng tạo thành chất màu

+ Thay đổi pH kéo theo sự thay đổi thành phần hợp chất màu

+ Khi tăng pH phức màu có thể bị phân hủy do sự tạo thành phức hydroxo + Dưới ảnh hưởng của ion H+

trạng thái tồn tại và màu của dung dịch cũng thay đổi

- Ảnh hưởng của sự pha loãng dung dịch phức màu: khi pha loãng các dung dịch phức màu sẽ gây ra sự lệch khỏi định luật Bughe – Lămbe – Bia

- Nhiệt độ môi trường và dung dịch đo phổ trong cuvet là không hằng định suốt trong thời gian đo Vì trong một mức độ nhất định độ hấp thụ quang

A phụ thuộc vào nhiệt độ

1.3 Một số phương pháp xác định đồng thời các cấu tử

1.3.1 Phương pháp Vierordt

Để xác định nồng độ của các cấu tử trong hỗn hợp, lần đầu tiên Vierordt đã

đo độ hấp thụ quang của dung dịch hỗn hợp ở các bước sóng khác nhau, sau đó

thiết lập hệ phương trình bậc nhất mà số phương trình bằng số ẩn số (số cấu tử trong hỗn hợp), giải hệ phương trình này sẽ tính được nồng độ của các cấu tử Điều kiện

để áp dụng phương pháp này là các cấu tử trong hỗn hợp phải tuân theo định luật Bughe - Lămbe - Bia và thỏa mãn tính cộng tính của độ hấp thụ quang

Với hỗn hợp chứa n cấu tử ta cần phải lập hệ n phương trình n ẩn Hệ phương trình này được thiết lập bằng cách đo độ hấp thụ quang của hỗn hợp ở

b: bề dày lớp dung dịch (cm)

Ci: nồng độ của cấu tử thứ i trong hỗn hợp (mol/lít) Với i, j = 1 n

Giải hệ n phương trình với n ẩn số là C1, C2 Cn sẽ tìm được nồng độ của các cấu tử Khi số cấu tử trong hỗn hợp ít thì việc giải hệ n phương trình tuyến tính khá đơn giản Tuy nhiên khi số cấu tử lớn thì việc giải hệ phương trình phức tạp hơn

Phương pháp Vierordt chủ yếu được vận dụng để tìm cách giải hệ phương trình như: giải bằng đồ thị, giải bằng phép ma trận vuông, phương pháp khử Gauss, để xác định nồng độ của mỗi cấu tử

Một số tác giả sử dụng phương pháp Vierordt để xác định đồng thời Acetaminophen và clopheninamin maleat trong thuốc viên nén bằng cách đo độ

hấp thụ quang ở các bước sóng 242 và 264 nm, còn một số tác giả khác đã xác định đồng thời axit salixylic và chloramphenilcol bằng cách đo độ hấp thụ quang ở các bước sóng 278nm và 297 nm.[17]

Phương pháp Vierordt đơn giản, dễ thực hiện nhưng chỉ áp dụng được khi số cấu tử trong dung dịch hỗn hợp ít, phổ hấp thụ quang phân tử xen phủ nhau không nhiều, tính chất cộng tính độ hấp thụ quang được thoả mãn nghiêm ngặt, thiết bị đo quang tốt thì phương pháp cho kết quả khá chính xác Đối với

hệ nhiều cấu tử, đặc biệt là khi phổ của các cấu tử xen phủ nhau nhiều, tính chất cộng tính độ hấp thụ quang không được thoả mãn nghiêm ngặt, thiết bị đo

có độ chính xác không cao thì phương pháp không chính xác và có sai số lớn [17] Bởi vậy mặc dù phương pháp Vierordt tuy ra đời đã lâu, nhưng ứng dụng trong thực tế còn rất ít Tuy nhiên đây là cơ sở lý thuyết cơ bản nhất, đặt nền móng cho các nhà khoa học sau này phát triển, cải tiến để xây dựng nên các phương pháp mới

1.3.2 Phương pháp phổ đạo hàm

Độ hấp thụ quang của các cấu tử là hàm của độ dài bước sóng của ánh sáng tới A = f( ) Phổ đạo hàm của độ hấp thụ quang theo bước sóng được biểu diễn bằng phương trình toán học:

Đạo hàm bậc 1 của độ hấp thụ quang: 1 ,

Và đạo hàm bậc n của độ hấp thụ quang: n n (n)

d A

dλTheo định luật Bughe - Lămbe - Bia thì: 0

λ

A = A = .C.b Với C và b là hằng số, không phụ thuộc vào bước sóng nên:

1 λ

A = a0 + a1 + a2 2 + + ak k Các hệ số a0, a1 ak tại mỗi bước sóng tương ứng là các giá trị đạo hàm bậc 0, 1, 2 k Để có phổ đạo hàm đối với tập số liệu phổ bậc không, đầu tiên

ta phải sử dụng phương pháp hồi quy bình phương tối thiểu để tìm được hàm hồi quy là đa thức bậc cao Sau đó lấy đạo hàm của hàm này ta sẽ được các phổ đạo hàm

Đối với phổ đạo hàm bậc 0, 1 n ta thấy có những đặc điểm như sau: đỉnh của phổ đạo hàm bậc n là điểm uốn của phổ đạo hàm bậc (n - 1), còn tại đỉnh của phổ đạo hàm bậc (n-1) thì phổ đạo hàm bậc n có giá trị bằng 0 Số đỉnh của phổ đạo hàm bậc n nhiều hơn số đỉnh của phổ đạo hàm bậc (n - 1)

Như vậy, dùng phương pháp phổ đạo hàm ta có thể tách phổ gần trùng nhau thành những phổ mới và khi đó ta có thể chọn được những bước sóng mà tại đó chỉ có duy nhất 1 cấu tử hấp thụ quang còn các cấu tử khác không hấp thụ, nhờ đó mà có thể xác định được từng chất trong hỗn hợp Bằng toán học, người ta xây dựng được phần mềm khi đo phổ của dung dịch hỗn hợp có thể ghi ngay được phổ đạo hàm các bậc của phổ đó Căn cứ vào các giá trị phổ đạo hàm ta lựa chọn được bước sóng xác định đối với từng cấu tử

Ở nước ta, một số tác giả đã sử dụng phương pháp phổ đạo hàm xác định đồng thời các vitamin tan trong nước cũng như xác định đồng thời các chế phẩm dược dụng khác

Các kết quả thu được có sai số trong khoảng 1,7 5% [19, 17, 7]

Trên thế giới, phương pháp phổ đạo hàm được ứng dụng để phân tích các chế phẩm dược dụng cũng như hỗn hợp các chất vô cơ, hữu cơ Hầu hết các kết quả đều cho thấy phương pháp có độ tin cậy cao Tuy nhiên phương pháp phổ đạo hàm chỉ được áp dụng khi số cấu tử trong dung dịch ít và phổ hấp thụ quang phân tử của chúng không trùng nhau [9,12]

1.3.3 Phương pháp lọc Kalman

Thuật toán lọc Kalman đầu tiên được nghiên cứu trong vật lý vô tuyến nhằm loại bỏ các tín hiệu "nhiễu" và sau đó được ứng dụng vào hoá học trắc quang Thuật toán lọc Kalman hoạt động trên cơ sở các file dữ liệu phổ ghi được của từng cấu tử riêng rẽ và của hỗn hợp các cấu tử, xác định sự đóng góp về phổ của từng cấu tử trong hỗn hợp tại các bước sóng Khi chương trình chạy, những kết quả tính toán liên tiếp sẽ càng tiến gần đến giá trị thực Trong thực tế, người ta

sử dụng phương pháp bình phương tối thiểu để giảm sai số giữa phổ của hỗn hợp với phổ nhân tạo được dự đoán bởi phương pháp lọc Kalman Kết quả tính toán là

lý tưởng khi phổ của hỗn hợp trừ đi phổ nhân tạo được tính bởi lọc Kalman sẽ tạo

ra một đường thẳng có độ lệch không đáng kể Độ đúng của phép xác định phụ thuộc vào độ nhiễu của nền, vào việc tách các đỉnh phổ hấp thụ của các cấu tử và

sự tương tác giữa các cấu tử Hỗn hợp có càng ít cấu tử, các đỉnh hấp thụ càng cách xa nhau thì sai số của phép tính toán sẽ càng nhỏ

Việc tính toán sẽ được thực hiện trên toàn bộ khoảng bước sóng được chọn Nếu kết thúc quá trình tính toán, độ lệch chuẩn tương đối của giá trị nồng

độ các cấu tử trong hỗn hợp vẫn lớn hơn giá trị sai số cho phép thì nồng độ của cấu tử đó sẽ phải xác định lại Khi đó, cần phải tăng giá trị sai số mặc định hoặc giảm số giá trị nồng độ mặc định để tính giá trị nồng độ trung bình.

1.1 Mô hình hoạt động của bộ lọc Kalman

Một số tác giả đã sử dụng thuật toán lọc Kalman để xác định các cấu tử trong hỗn hợp bằng phương pháp trắc quang Kết quả cho thấy sai số của phép xác định với hỗn hợp 2 cấu tử nhỏ hơn 1%, với hỗn hợp 3 cấu tử có sai số nhỏ hơn 2% [6, 18, 19]

1.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Phương pháp này ra đời từ năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển Hiện nay phương pháp HPLC ngày càng phát triển và hiện đại hoá cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích Nó áp dụng rất nhiều trong các ngành kiểm nghiệm đặc biệt là ứng dụng cho ngành kiểm nghiệm thuốc, máy phân tích HPLC là công

cụ đắc lực trong phân tích các thuốc đa thành phần cho phép định tính và định lượng Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều

lý do: có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt

1.4.1 Nguyên tắc của phương pháp HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp tách một hỗn hợp chất lỏng dựa trên sự phân bố chúng giữa hai pha, một pha đứng yên gọi là pha tĩnh, một pha di chuyển gọi là pha động Do ái lực hấp thụ và giải hấp thụ khác nhau của các hợp phần có trong mẫu phân tích với pha tĩnh và pha động mà chúng di chuyển dọc theo pha tĩnh (cột sắc ký) tốc độ khác nhau nên lần lượt đi ra khỏi cột

Tín hiệu cần đo

Các nguồn

nhiễu

Bộ phận tiếp nhận tín hiệu

Bộ lọc

Giá trị

đo được

- Căn cứ theo trạng thái rắn lỏng của pha tĩnh, người ta chia nó thành hai loại, nếu pha tĩnh là chất rắn ta có sắc kí lỏng rắn (LSC), nếu pha tĩnh là chất lỏng ta có sắc kí lỏng-lỏng (LLC)

- Căn cứ theo độ phân cực của pha tĩnh và pha động, có các loại: sắc ký pha thuận (pha tĩnh phân cực còn pha động ít phân cực), sắc kí pha đảo (pha tĩnh ít phân cực còn pha động thì phân cực), sắc kí pha đảo tạo cặp ion và sắc kí trao đổi ion

- Căn cứ theo cấu trúc xốp của pha tĩnh là các hạt rắn, người ta chia nó thành 2 loại là xốp toàn phần hạt và xốp bề mặt hạt (xốp chỉ lớp vỏ ngoài)

Điều kiện đối với một pha tĩnh:

- Phải trơ và bền vững với các điều kiện của môi trường sắc kí

- Có khả năng tách chọn lọc một hỗn hợp chất tan nhất định trong điều kiện sắc kí nhất định

- Tính chất bề mặt phải ổn định (đặc biệt là đặc trưng xốp của nó)

- Cân bằng động học của sự tách phải xảy ra nhanh và lặp lại tốt

- Cỡ hạt phải tương đối đồng nhất

Quá trình rửa giải :

- Rửa giải đẳng dòng: Pha động không thay đổi trong suốt quá trình rửa giải

- Rửa giải gradient: pha động liên tục thay đổi (do tỉ lệ tạo nên các thành phần pha động thay đổi) trong suốt quá trình rửa giải Lúc này độ phân cực của pha động cũng sẽ bị biến đổi và thường là tăng hiệu quả tách

Các yếu tố chính cần chú ý trong lựa chọn pha động :

- Bản chất của dung môi lựa chọn làm pha động

- Thành phần các chất tạo ra pha động

- Tốc độ dòng pha động

- pH của pha động (đặc biệt chú ý ở sắc ký trao đổi ion và sắc ký cặp ion)

Điều kiện đối với một pha động :

- Phải trơ đối với pha tĩnh

- Hòa tan được chất cần phân tích

- Bền vững theo thời gian

- Có độ tinh khiết cao

- Phải nhanh đạt các cân bằng trong sắc ký

- Phù hợp với các loại detector dùng để phát hiện các chất phân tích

- Có tính kinh tế và không khan hiếm

Pha động là một trong những yếu tố quyết định hiệu suất tách sắc kí của một hỗn hợp mẫu Nó quyết định thời gian lưu giữ các chất mẫu và hiệu quả sự tách sắc ký

Pha động có thể ảnh hưởng đến:

- Độ chọn lọc của hệ pha

- Thời gian lưu giữ của chất tan

- Hiệu lực của cột tách

- Độ phân giải các chất trong một pha tĩnh

- Độ rộng và sự cân đối của pic sắc ký

Tất cả các dung môi dùng trong HPLC (kể cả pha động) đều được đuổi khí bằng cách đun nóng, hút chân không, lắc siêu âm Vì không khí hòa tan trong dung môi sẽ tạo bọt khí trong detector và gây nhiễu tín hiệu

1.4.2 Các đại lượng đặc trưng của quá trình sắc kí

1.4.2.1 Thời gian lưu và thể tích lưu

Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị nồng độ cực đại và cho ra pic trên sắc kí đồ

Nếu gọi tR là thời gian lưu trữ của một chất thì:

,

R

t = tR - t0

Trong đó: tR, : là thời gian lưu thực (thời gian lưu hiệu chỉnh)

t o : là thời gian chết ( thời gian không lưu trữ)

Trong cùng một điều kiện sắc kí đã chọn, thời gian lưu của mỗi chất là hằng định và các chất khác nhau thì thời gian lưu khác nhau tùy thuộc vào bản chất, cấu tạo vào tính chất của chất đó Vì vậy thời gian lưu là đại lượng định tính các chất

Hình 1.2 Thời gian lưu của cấu tử phân tích

Khi pha động chảy qua cột với một tốc độ không đổi thì thời gian lưu có thể thay thế bằng thể tích lưu Thể tích lưu là thể tích pha động thu được sau cột trong khoảng thời gian tương ứng với thời gian lưu

Trong đó : là nồng độ của chất phân tích tương ứng trong pha tĩnh

và pha động ở thời điểm cân bằng

1.4.2.4 Số đĩa lý thuyết và chiều cao đĩa lý thuyết

Hiệu lực cột thường biểu thị qua hai thông số: Số đĩa lý thuyết (N) hoặc chiều cao đĩa lý thuyết (H) Cột sắc ký được coi như có N tầng lý thuyết, ở mỗi

tầng sự phân bố chất tan vào 2 pha lại đạt đến một trạng thái cân bằng mới Mỗi tầng được giả định như một lớp pha tĩnh có chiều cao H Đĩa lý thuyết được định nghĩa như một khu vực của hệ thống phân tách mà trong đó thiết lập một cân bằng nhiệt động giữa nồng độ trung bình của chất tan trong pha tĩnh và trong pha động

Số đĩa lý thuyết N được tính theo các công thức:

Trong đó: W là chiều rộng pic ở đáy pic

là chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của pic

Chiều cao của đĩa lý thuyết được tính theo công thức:

H=

N L

Trong đó: L là chiều cao cột sắc kí

Với một điều kiện sắc kí nhất định, chiều cao đĩa lý thuyết (H) và số đĩa

lý thuyết (N) là hằng định đối với mỗi chất phân tích

1.4.2.5 Độ phân giải ( R S )

Độ phân giải là đại lượng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trong điều kiện sắc kí đã cho Độ phân giải của hai pic cạnh tranh được tính theo 1 trong 3 công thức sau:

=

Trong đó:

, : thời gian lưu tương ứng của chất A, chất B

, : Chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao pic của chất A, chất B , : Chiều rộng pic ở đáy pic

α: Hệ số chọn lọc

1.4.3 Hệ thống máy HPLC

Hệ thống máy HPLC có các bộ phận chính sau:

- Bình chứa dung môi (pha động)

- Bộ khử khí

- Bơm cao áp: đẩy pha động qua cột sắc kí

- Bộ tiêm mẫu: tiêm vào cột một thể tích mẫu nhất định

1.4.4 Kết quả xác định một số chất theo phương pháp HPLC

Ở nước ta, phương pháp HPLC được ứng dụng nhiều trong phân tích các chế phẩm về dược cũng như hỗn hợp các chất vô cơ, hữu cơ Các kết quả đều

cho thấy phương pháp có độ tin cậy cao

Phương pháp định lượng đồng thời acetaminophen và axit mefenamic: phương pháp có độ chính xác cao (sai số tương đối 0,51% – 1,42%), độ đúng tốt (tỷ lệ thu hồi 98,16% – 99,16%) [17]

Phương pháp định tính và định lượng đồng thời acetaminophen và ibuprofen: phương pháp có độ lặp lại tốt (sai số tương đối 0,81% - 1,03%), độ đúng cao (tỷ lệ thu hồi 98,0% – 98,4%) [2, 17]

Phương pháp định lượng đồng thời acetaminophen và cafein: phương pháp có độ lặp lại tốt (sai số tương đối 0,54% – 1,07%), độ đúng cao (tỷ lệ thu hồi 98,9% – 99,5%) [2]

Phương pháp định lượng đồng thời acetaminophen, phenylpropanolamin hidroclorit và clorphenylamin maleat: phương pháp có độ lặp lại cao (sai số tương đối của acetaminophen là 0,47%; phenylpropanolamin hidroclorid là 0,67% và clorphenylamin maleat là 1,19%), độ đúng cao (tỷ lệ thu hồi 99,61% – 100,65%) [17]