Ở nước ta, phương pháp HPLC được ứng dụng nhiều trong phân tích các chế phẩm về dược cũng như hỗn hợp các chất vô cơ, hữu cơ. Các kết quả đều cho thấy phương pháp có độ tin cậy cao.
Phương pháp định lượng đồng thời acetaminophen và axit mefenamic: phương pháp có độ chính xác cao (sai số tương đối 0,51% – 1,42%), độ đúng tốt (tỷ lệ thu hồi 98,16% – 99,16%) [17].
Phương pháp định tính và định lượng đồng thời acetaminophen và ibuprofen: phương pháp có độ lặp lại tốt (sai số tương đối 0,81% - 1,03%), độ đúng cao (tỷ lệ thu hồi 98,0% – 98,4%). [2, 17]
Phương pháp định lượng đồng thời acetaminophen và cafein: phương pháp có độ lặp lại tốt (sai số tương đối 0,54% – 1,07%), độ đúng cao (tỷ lệ thu hồi 98,9% – 99,5%). [2]
Phương pháp định lượng đồng thời acetaminophen, phenylpropanolamin hidroclorit và clorphenylamin maleat: phương pháp có độ lặp lại cao (sai số tương đối của acetaminophen là 0,47%; phenylpropanolamin hidroclorid là 0,67% và clorphenylamin maleat là 1,19%), độ đúng cao (tỷ lệ thu hồi 99,61% – 100,65%). [17]
Chƣơng 2 THỰC NGHIỆM 2.1. Nội dung nghiên cứu
Áp dụng phương pháp HPLC và phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử để xây dựng quy trình xác định đồng thời acetaminophen, codein phosphat trong thuốc actadol codein trên thị trường.
2.1.1. Phương pháp HPLC
Lựa chọn các thông số của máy HPLC: - Thể tích bơm mẫu.
- Cột tách. - Nhiệt độ.
Khảo sát để lựa chọn các điều kiện sắc ký:
- Bước sóng thích hợp để phát hiện đồng thời 2 chất. - Pha động: thành phần, tỷ lệ pha động, tốc độ dòng... Đánh giá quy trình sắc ký đã xây dựng được:
- Khảo sát tính thích hợp của hệ thống.
- Khảo sát khoảng tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của các chất. - Khảo sát độ chính xác của phương pháp.
- Khảo sát độ đúng của phương pháp.
Xác định đồng thời ACT và CĐI trong thuốc Actadol codein theo phương pháp HPLC.
2.1.2. Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử
- Tiến hành quét phổ từ 200 nm đến 900 nm để xác định kiểm tra lại bước sóng hấp thụ quang cực đại của ACT và CĐI.
- Khảo sát sự ổn định độ hấp thụ quang của ACT, CĐI theo môi trường nền, pH, thời gian, nhiệt độ để lựa chọn khoảng thời gian, nhiệt độ và pH
- Khảo sát khoảng tuyến tính của ACT, CĐI từ đó xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ).
- ACT và CĐI
ACT: CĐI .
- Xây dựng quy trình phân tích mẫu thuốc Actadol codein,
.
- Định lượng đồng thời ACT và CĐI trong mẫu thuốc Actadol codein [5, 8, 10, 14, 16].
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
ACT, CĐI
ACT và CĐI [3, 4, 20, 22, 23].
2.2.2.1. Phương pháp HPLC
- ACT, CĐI và hỗn hợp dung dịch .
- Tiến hành chạy sắc kí theo các nội dung đã trình bày ở mục 2.1.1 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Xác định đồng thời các cấu tử trong hỗn hợp và trong mẫu thuốc Actadol codein
2.2.2.2. Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử
- ACT, CĐI .
- Xác định ACT và CĐI.
- .
- 2 Actadol codein.
- giá độ tin cậy của quá trình phân tích, để tính toán các kết quả thí nghiệm của luận văn
2.3. Đánh giá độ tin cậy của quy trình phân tích 2.3.1. Giới hạn phát hiện (LOD) 2.3.1. Giới hạn phát hiện (LOD)
LOD được coi là nồng độ thấp nhất của chất nghiên cứu mà hệ thống phân tích cho tín : 3.SD LOD = B Trong đó:
SD: độ lệch chuẩn của tín hiệu y trên đường chuẩn.
B: độ dốc của đường chuẩn chính là độ nhạy của phương pháp trắc quang.
2.3.2. Giới hạn định lượng (LOQ)
với tín hiệu nền và đạt độ tin cậy tối thiểu 95%, thông thường người ta sử dụng công thức:
10.SD LOQ =
B
2.3.3. Đánh giá độ tin cậy của phương pháp
- ACT và CĐI
tự pha chế thông qua sai số tương đối RE. Sai số tươ
: Tinh toan 0 0 C - C RE% = .100% C
Trong đó: RE% là sai số tương đối của phép xác định nồng độ các cấu tử.
CTinh toan (µg/mL) .
-
thông qua độ thu
: T C - Re = .100% a a C v
Trong đó: CT: nồng độ (µg/mL ACT CĐI xác định được trong mẫu sau khi thêm chuẩn;
Ca: nồng độ (µg/mL ACT ho CĐI .
a: nồng độ (µg/mL ACT CĐI thêm vào mẫu
(đã biết). - (RSD). n n 2 2 i i i=1 i=1 -μ -C S = = k k C C RSD = .100(%) C S
Trong đó: Ci (µg/mL) ACT CĐI
tính được lần thứ i; (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
là giá trị nồng độ thực của mẫu;
C là giá trị nồng độ trung bình tính được sau n lần xác định; k là số bậc tự do.
2.3.4. Đánh giá kết quả phép phân tích theo thống kê
Khoảng tin cậy của phép xác định nồng độ được tính theo công thức:
P,k
t .S X ± ε = X ±
n
Với tP, k là hệ số phân bố chuẩn Student ứng với xác suất P và bậc tự do k được tra trong bảng (t0,95; 3 = 3,18; t0,95; 4 = 2,78; t0,95; 5 = 2,57 ); X
trung b ; S là độ lệch chuẩn, n là số phép đo.
2.4. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất
2.4.1. Thiết bị
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Hitachi L-2000 với detector UV-VIS
- thuộc – Đại học Thái Nguyên.
- – thuộc
– Đại học Thái Nguyên, có khả năng quét phổ trong khoảng bước sóng 190nm – 900 nm, có kết nối máy tính.
- Bộ cuvet thạch anh.
- Cân điện tử có độ chính xác 0,0001g. - Bếp cách thủy.
- Máy rung siêu âm. - Máy đo pH.
2.4.2. Dụng cụ
- Pipet các loại: 1 mL; 2 mL; 5 mL; 10 mL; 20 mL; 25 mL.
- Bình định mức dung dịch: 10 mL; 25 mL; 50 mL; 100 mL; 250 mL; 500 mL; 1000 mL.
- Cốc thủy tinh, phễu thủy tinh, ống nghiệm...
- Chương trình lọc Kalman tính toán đồng thời nồng độ các cấu tử [18,19].
2.4.3. Hóa chất
- HCl, H2SO4, HNO3, H3PO4, KH2PO4,... dùng để pha chế các dung dịch đều thuộc loại tinh khiết của Merck.
- Nước cất 2 lần
- Chất chuẩn acetaminophen và codein phot phat nguyên chất do viện kiểm nghiệm dược sản xuất.
- Thuốc viên Actadol codeine sản xuất bởi Công ty TNHH một thành viên dược phẩm và sinh học y tế Quận Tân Phú, TP. Hồ Chí Minh; Số lô: III- 18; Ngày sản xuất: 08/3/2014; Hạn sử dụng: 08/3/2017.
2.4.4. Chế phẩm actadol codeine Thành Phần:
Mỗi viên nén chứa: Acetaminophen : 500mg (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Codein phosphat: 8mg
Hình 2.1. Chế phẩm thuốc Actadol codein
2.5. Chuẩn bị các dung
, chúng tôi đã sử dụng các dung môi sau: - Dung dịch đệm KH2PO4.
- Dung dịch pha động.
- Dung dịch HCl 10-1M; 10-2M; 10-3M.
- Dung dịch H2SO4 5.10-2M; 5.10-3M; 5. 10-4M. - Dung dịch HNO3 10-1M; 10-2M; 10-3M.
Dung dịch đệm KH2PO4 được chuẩn bị bằng cách Hòa tan 2,04 g kali dihydrophosphat trong 950 mL nước cất 2 lần. Thêm 1mL triethylamin, điều chỉnh về pH = 2,5 bằng axit phosphoric pha loãng với nước cất 2 lần định mức thành 1000 mL và trộn đều.
Dung dịch pha động chuẩn bị bằng cách lấy dung dich đệm KH2PO4 có lẫn triethylamin và acetonitrile ở các tỷ lệ về thể tích từ 85:15 đến 95:5.
Lấy 41,8 mL
500 mL thu được dung dịch HCl 0,001M.
Lấy 5,5 mL dung dịch H2SO4 97% 100 mL thu được dung dịch H2SO4
Lấy 7 mL dung dịch HNO3
100 mL thu được dung dịch HNO3 3
0,001M..
Các dung dịch đã được kiểm tra lại pH bằng phương pháp chuẩn độ axit- Bazơ
Chƣơng 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phƣơng pháp HPLC
3.1.1. Xây dựng điều kiện để xác định đồng thời 2 chất ACT và CĐI
Qua việc nghiên cứu tính chất lý hóa của 2 chất ACT và CĐI kết hợp với tài liệu tham khảo và điều kiện sẵn có của phòng thí nghiệm, chúng tôi lựa chọn kiểu sắc ký hấp phụ pha đảo (RP-HPLC), sử dụng cột silica C18, thể tích bơm mẫu là 20 µL, nhiệt độ 30o
C.
3.1.1.1. Khảo sát lựa chọn pha động
Để chọn được pha động thích hợp, chúng tôi đã tiến hành khảo sát tỉ lệ thành phần pha động là hỗn hợp đệm KH2PO4 có lẫn triethylamin: acetonitrile ở các tỷ lệ về thể tích lần lượt là: 85:15 cho đến 95:5 với tốc độ dòng là 1,5 mL/phút. Các dung dịch được lọc qua màng lọc 0,45 µm sau đó rung siêu âm để khử bọt khí.
Sự thay đổi tỉ lệ thành phần pha động làm thay đổi đáng kể kết quả sắc ký. Tuy nhiên tỷ lệ hỗn hợp đệm KH2PO4 có lẫn triethylamin : acetonitrile 93:7 cho kết quả tốt nhất với thời gian lưu của ACT là 8,243 giây CĐI là 9.237 giây
Vì vậy, chúng tôi chọn pha động để xác định đồng thời 2 chất là hỗn hợp đệm KH2PO4 có lẫn triethylamin : acetonitrile với tỷ lệ thể tích là 93:7.
3.1.1.2. Lựa chọn bước sóng
Việc lựa chọn bước sóng dựa trên cơ sở các tài liệu tham khảo kết hợp với khảo sát thực nghiệm tại 2 bước sóng λ = 243 nm và λ = 214 nm.
Tại λ = 243 nm: là bước sóng tại đó ACT có độ hấp thụ quang cực đại, CĐI có độ hấp thụ quang trung bình. Tuy nhiên kết quả thực nghiệm cho thấy các pic của ACT và CĐI hầu như không xuất hiện.
Tại λ = 214 nm: là bước sóng ACT có độ hấp thụ quang cực tiểu, CĐI có độ hấp thụ quang trung bình. Kết quả thực nghiệm cho thấy đường nền thẳng, xuất hiện cả 2 pic với thời gian lưu phù hợp. Kết quả được thể hiện ở các hình 3.1, 3.2. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.1. Sắc kí đồ của ACT (500 µg/mL)
Hình 3.2. Sắc kí đồ của CĐI (8 µg/mL)
Vì vậy, chúng tôi lựa chọn bước sóng λ = 214 nm để tiến hành phân tích.
3.1.1.3. Lựa chọn tốc độ dòng
Để lựa chọn được tốc độ dòng thích hợp, chúng tôi tiến hành sắc ký với các điều kiện ở trên nhưng với các tốc độ dòng là 1 mL/phút, 1,5 mL/phút và 2 mL/phút.
Với tốc độ dòng 1 mL/phút, đỉnh của các pic bị tù.
Với tốc độ dòng 1,5 mL/phút, kết quả tách tốt, các pic tách rời nhau và thời gian chạy sắc ký phù hợp.
Với tốc độ dòng 2 mL/phút, các pic có đỉnh nhọn, thời gian lưu ngắn và chân pic hẹp.
Vì vậy, chúng tôi lựa chọn tốc độ dòng là 1,5 mL/phút để tiến hành phân tích sắc ký.
Kết luận chung: Từ các kết quả trên, chúng tôi lựa chọn điều kiện tối ưu cho phương pháp xác định đồng thời ACT và CĐI là:
Pha động: hỗn hợp đệm KH2PO4 có lẫn triethylamin : acetonitrile với tỷ lệ thể tích là 93:7. Detector UV-VIS: λ = 214 nm. Cột: sử dụng cột C18 (250mm x 4,6). Tốc độ dòng: 1,5 mL/phút. Thể tích bơm mẫu: 20 µL. Nhiệt độ phân tích: 30o C.
Với các điều kiện trên, chúng tôi đã tiến hành phân tích và kết quả sắc ký được thể hiện ở hình 3.3.
Hình 3.3. Sắc kí đồ của ACT (1) và CĐI (2)
Kết quả phổ ở hình 3.3 cho thấy 2 pic đều được tách ra hoàn toàn, các pic gọn và cân đối, thời gian lưu của 2 chất là hợp lý với thời gian lưu của ACT là 8,243 phút, CĐI là 9,237 phút.
3.1.2. Đánh giá phương pháp định lượng
3.1.2.1. Chuẩn bị dung dịch hỗn hợp chuẩn
Dung dịch ACT 1: Cân chính xác 100 mg ACT cho vào bình định mức 100 mL, bổ sung thêm 50 mL dung dịch pha động, sau đó đem rung siêu âm trong 10 phút rồi định mức tiếp đến vạch, thu được dung dịch ACT có nồng độ là 1000 µg/mL (gọi là dung dịch ACT 1). Pha loãng dung dịch ACT 1 bằng dung dịch pha động thu được các dung dịch ACT có nồng độ 900 µg/mL, 700 µg/mL, 500 µg/mL, 300 µg/mL và 100 µg/mL.
Dung dịch CĐI 1: Cân chính xác 80 mg CĐI cho vào bình định mức 100 mL, hòa tan bằng 50mL dung dịch pha động sau đó đem rung siêu âm trong 10 phút rồi định mức tiếp đến vạch, thu được dung dịch CĐI có nồng độ 800 µg/mL, tiếp tục pha loãng bằng dung dịch pha động thu được dung dịch CĐI có nồng độ 80 µg/mL (gọi là dung dịch CĐI 1). Pha loãng dung dịch CĐI 1 bằng dung dịch pha động thu được các dung dịch CĐI có nồng độ 12 µg/mL, 10 µg/mL, 8 µg/mL, 6 µg/mL và 4 µg/mL
Dung dịch mẫu giả: lấy lần lượt 12,5 mL dung dịch ACT 1; 2,5 mL dung dịch CĐI 1 cho vào bình định mức 25 mL và định mức bằng dung dịch pha động được dung dịch mẫu giả có nồng độ: ACT : CĐI = 500 : 8 (µg/mL).
Các dung dịch được lọc qua màng lọc 0,45 µm.
3.1.2.2. Kiểm tra tính thích hợp của hệ thống
Để khảo sát tính thích hợp của hệ thống máy HPLC khi phân tích định lượng ACT và CĐI. Chúng tôi tiến hành khảo sát các đại lượng đặc trưng như: số đĩa lý thuyết, độ phân giải, thời gian lưu, diện tích pic qua việc bơm lặp lại 4 lần dung dịch chuẩn để sắc ký. Kết quả được chỉ ra ở bảng 3.1; 3.2 và 3.3.
Bảng 3.1. Giá trị các đại lƣợng đặc trƣng
Hoá chất Số đĩa lý thuyết ( N ) Độ phân giải ( RS )
CĐI 10533
2,15
Kết quả ở bảng 3.1, 3.2 và 3.3 cho thấy: các thông số hệ thống như số đĩa lý thuyết và độ phân giải nằm trong giới hạn cho phép [17]. Chỉ số %RSD của diện tích pic và thời gian lưu được tìm thấy đều nhỏ hơn 2%. Vì vậy hệ thống sắc ký đảm bảo tính thích hợp với cả 2 chất phân tích.
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát thời gian lƣu
Lần bơm
ACT CĐI (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thời gian lưu (phút)
Số liệu thống kê
Thời gian lưu
(phút) Số liệu thống kê 1 8,297 X = 8,257 S = 0,030 %RSD= 0,36 9,237 X = 9,235 S = 0,006 %RSD= 0,06 2 8,243 9,240 3 8,227 9,237 4 8,260 9,227
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát diện tích pic
Lần bơm ACT CĐI Diện tích pic (mAuxphút) Số liệu thống kê Diện tích pic
(mAuxphút) Số liệu thống kê 1 5467,3 X = 5465,5 S = 8,34 %RSD=0,15 157,2 X = 157,2 S = 0,57 %RSD= 0,36 2 5472,0 157,5 3 5469,3 156,4 4 5453,3 157,7
3.1.2.3. Khảo sát độ tuyến tính của phương pháp
Độ tuyến tính được khảo sát trên dung dịch các chất chuẩn với các nồng độ khác nhau:
Các dung dịch ACT có nồng độ từ 100 - 900 µg/mL, CĐI có nồng độ từ 4 - 12 µg/mL được pha loãng từ dung dịch ACT 1 và CĐI 1 bằng dung dịch pha động như ở mục 3.1.2.1
Tiến hành chạy sắc ký lần lượt từng dung dịch theo điều kiện sắc ký đã chọn ở trên. Xác định được sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic bằng phương trình hồi quy tuyến tính và hệ số tương quan R2
. Kết quả khảo sát độ tuyến tính của 2 chất được trình bày ở bảng 3.4
Bảng 3.4. Mối tƣơng quan giữa nồng độ và diện tích pic của ACT và CĐI
ACT
Dung dịch 1 2 3 4 5
Nồng độ (µg/mL) 100 300 500 700 900 Diện tích
(mAuxphút) 1114,7 3353,4 5467,2 7602,2 9647,7 Phương trình hồi quy tuyến tính: y = 10,657x +108,34 với R2
= 0,9998 CĐI Dung dịch 1 2 3 4 5 Nồng độ (µg/mL) 4 6 8 10 12 Diện tích (mAuxphút) 78,64 118,2 157,0 197,9 241,0 Phương trình hồi quy tuyến tính: y = 20,22x – 3,192 với R2
= 0,9996 Từ kết quả ở bảng 3.4. Biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích pic ACT và CĐI theo nồng độ. Kết quả được thể hiện ở hình 3.4 và 3.5 .
Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của ACT
Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của CĐI
Nhận xét: Từ kết quả ở bảng 3.4 , hình 3.4 và hình 3.5 ta thấy diện tích
pic của ACT và CĐI phụ thuộc tuyến tính tốt theo nồng độ được thể hiện ở phương trình hồi quy tuyến tính và hệ số R2
3.1.2.4. Khảo sát độ lặp lại của phương pháp sắc ký
Pha các dung dịch mẫu giả như ở mục 3.1.2.1
Đo các dung dịch mẫu giả trên trong điều kiện sắc ký đã chọn, so sánh diện tích pic từ phương trình đường chuẩn và dung dịch mẫu giả trong cùng