Thuật toán lọc Kalman đầu tiên được nghiên cứu trong vật lý vô tuyến nhằm loại bỏ các tín hiệu "nhiễu" và sau đó được ứng dụng vào hoá học trắc quang. Thuật toán lọc Kalman hoạt động trên cơ sở các file dữ liệu phổ ghi được của từng cấu tử riêng rẽ và của hỗn hợp các cấu tử, xác định sự đóng góp về phổ của từng cấu tử trong hỗn hợp tại các bước sóng. Khi chương trình chạy, những kết quả tính toán liên tiếp sẽ càng tiến gần đến giá trị thực. Trong thực tế, người ta sử dụng phương pháp bình phương tối thiểu để giảm sai số giữa phổ của hỗn hợp với phổ nhân tạo được dự đoán bởi phương pháp lọc Kalman. Kết quả tính toán là lý tưởng khi phổ của hỗn hợp trừ đi phổ nhân tạo được tính bởi lọc Kalman sẽ tạo ra một đường thẳng có độ lệch không đáng kể. Độ đúng của phép xác định phụ thuộc vào độ nhiễu của nền, vào việc tách các đỉnh phổ hấp thụ của các cấu tử và sự tương tác giữa các cấu tử. Hỗn hợp có càng ít cấu tử, các đỉnh hấp thụ càng cách xa nhau thì sai số của phép tính toán sẽ càng nhỏ.
Việc tính toán sẽ được thực hiện trên toàn bộ khoảng bước sóng được chọn. Nếu kết thúc quá trình tính toán, độ lệch chuẩn tương đối của giá trị nồng độ các cấu tử trong hỗn hợp vẫn lớn hơn giá trị sai số cho phép thì nồng độ của cấu tử đó sẽ phải xác định lại. Khi đó, cần phải tăng giá trị sai số mặc định hoặc giảm số giá trị nồng độ mặc định để tính giá trị nồng độ trung bình.
1.1. Mô hình hoạt động của bộ lọc Kalman
Một số tác giả đã sử dụng thuật toán lọc Kalman để xác định các cấu tử trong hỗn hợp bằng phương pháp trắc quang. Kết quả cho thấy sai số của phép xác định với hỗn hợp 2 cấu tử nhỏ hơn 1%, với hỗn hợp 3 cấu tử có sai số nhỏ hơn 2% [6, 18, 19].
1.4. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Phương pháp này ra đời từ năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển. Hiện nay phương pháp HPLC ngày càng phát triển và hiện đại hoá cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích. Nó áp dụng rất nhiều trong các ngành kiểm nghiệm đặc biệt là ứng dụng cho ngành kiểm nghiệm thuốc, máy phân tích HPLC là công cụ đắc lực trong phân tích các thuốc đa thành phần cho phép định tính và định lượng. Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt.
1.4.1. Nguyên tắc của phương pháp HPLC
Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp tách một hỗn hợp chất lỏng dựa trên sự phân bố chúng giữa hai pha, một pha đứng yên gọi là pha tĩnh, một pha di chuyển gọi là pha động. Do ái lực hấp thụ và giải hấp thụ khác nhau của các hợp phần có trong mẫu phân tích với pha tĩnh và pha động mà chúng di chuyển dọc theo pha tĩnh (cột sắc ký) tốc độ khác nhau nên lần lượt đi ra khỏi cột.
Tín hiệu cần đo Các nguồn nhiễu Bộ phận tiếp nhận tín hiệu Bộ lọc Giá trị đo được
1.4.1.1. Pha tĩnh
Khái niệm:
Pha tĩnh là chất nhồi cột để làm nhiệm vụ tách 1 hỗn hợp chất phân tích. Nó là những chất rắn, xốp, kích thước hạt rất nhỏ, đường kính cỡ hạt từ 3- 10 m, diện tích bề mặt thường từ 50-500 2
m /g.
Phân loại:
- Căn cứ theo bản chất chính của quá trình sắc ký trong cột tách, người ta chia nó thành nhiều loại như hấp phụ, phân bố, trao đổi ion và rây phân tử. Tương ứng với loại chất nhồi như thế người ta có một loại sắc kí riêng trong kĩ thuật HPLC.
- Căn cứ theo trạng thái rắn lỏng của pha tĩnh, người ta chia nó thành hai loại, nếu pha tĩnh là chất rắn ta có sắc kí lỏng rắn (LSC), nếu pha tĩnh là chất lỏng ta có sắc kí lỏng-lỏng (LLC).
- Căn cứ theo độ phân cực của pha tĩnh và pha động, có các loại: sắc ký pha thuận (pha tĩnh phân cực còn pha động ít phân cực), sắc kí pha đảo (pha tĩnh ít phân cực còn pha động thì phân cực), sắc kí pha đảo tạo cặp ion và sắc kí trao đổi ion.
- Căn cứ theo cấu trúc xốp của pha tĩnh là các hạt rắn, người ta chia nó thành 2 loại là xốp toàn phần hạt và xốp bề mặt hạt (xốp chỉ lớp vỏ ngoài)
Điều kiện đối với một pha tĩnh:
- Phải trơ và bền vững với các điều kiện của môi trường sắc kí.
- Có khả năng tách chọn lọc một hỗn hợp chất tan nhất định trong điều kiện sắc kí nhất định.
- Tính chất bề mặt phải ổn định (đặc biệt là đặc trưng xốp của nó). - Cân bằng động học của sự tách phải xảy ra nhanh và lặp lại tốt. - Cỡ hạt phải tương đối đồng nhất
1.4.1.2. Pha động
Khái niệm:
Pha động là dung môi dùng để rửa giải chất tan (chất cần phân tích) ra khỏi cột tách để thực hiện quá trình sắc ký. Đây là một yếu tố rất linh động và dễ dàng thay đổi. Nó có thể là một dung môi hoặc hỗn hợp nhiều dung môi trộn lẫn với nhau theo những tỉ lệ nhất định. Nó có thể là dung dịch hoặc các muối có chứa các chất đệm, chất tạo phức... Nói chung mỗi loại sắc ký sẽ có các hệ dung môi rửa giải riêng để có được hiệu quả phân tách tốt nhất.
Quá trình rửa giải :
- Rửa giải đẳng dòng: Pha động không thay đổi trong suốt quá trình rửa giải.
- Rửa giải gradient: pha động liên tục thay đổi (do tỉ lệ tạo nên các thành phần pha động thay đổi) trong suốt quá trình rửa giải. Lúc này độ phân cực của pha động cũng sẽ bị biến đổi và thường là tăng hiệu quả tách.
Các yếu tố chính cần chú ý trong lựa chọn pha động :
- Bản chất của dung môi lựa chọn làm pha động - Thành phần các chất tạo ra pha động
- Tốc độ dòng pha động
- pH của pha động (đặc biệt chú ý ở sắc ký trao đổi ion và sắc ký cặp ion)
Điều kiện đối với một pha động :
- Phải trơ đối với pha tĩnh.
- Hòa tan được chất cần phân tích. - Bền vững theo thời gian.
- Có độ tinh khiết cao.
- Phải nhanh đạt các cân bằng trong sắc ký.
- Phù hợp với các loại detector dùng để phát hiện các chất phân tích. - Có tính kinh tế và không khan hiếm.
Pha động là một trong những yếu tố quyết định hiệu suất tách sắc kí của một hỗn hợp mẫu. Nó quyết định thời gian lưu giữ các chất mẫu và hiệu quả sự tách sắc ký.
Pha động có thể ảnh hưởng đến: - Độ chọn lọc của hệ pha.
- Thời gian lưu giữ của chất tan. - Hiệu lực của cột tách.
- Độ phân giải các chất trong một pha tĩnh. - Độ rộng và sự cân đối của pic sắc ký.
Tất cả các dung môi dùng trong HPLC (kể cả pha động) đều được đuổi khí bằng cách đun nóng, hút chân không, lắc siêu âm... Vì không khí hòa tan trong dung môi sẽ tạo bọt khí trong detector và gây nhiễu tín hiệu.
1.4.2. Các đại lượng đặc trưng của quá trình sắc kí
1.4.2.1. Thời gian lưu và thể tích lưu
Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị nồng độ cực đại và cho ra pic trên sắc kí đồ.
Nếu gọi tR là thời gian lưu trữ của một chất thì:
,
R
t = tR - t0
Trong đó: tR, : là thời gian lưu thực (thời gian lưu hiệu chỉnh).
to : là thời gian chết ( thời gian không lưu trữ).
Trong cùng một điều kiện sắc kí đã chọn, thời gian lưu của mỗi chất là hằng định và các chất khác nhau thì thời gian lưu khác nhau tùy thuộc vào bản chất, cấu tạo vào tính chất của chất đó. Vì vậy thời gian lưu là đại lượng định tính các chất.
Hình 1.2. Thời gian lưu của cấu tử phân tích
Khi pha động chảy qua cột với một tốc độ không đổi thì thời gian lưu có thể thay thế bằng thể tích lưu. Thể tích lưu là thể tích pha động thu được sau cột trong khoảng thời gian tương ứng với thời gian lưu.
1.4.2.2. Hệ số phân bố
Trong quá trình sắc kí luôn có sự phân bố của chất tan giữa pha động và pha tĩnh. Sự phân bố này đặc trưng bởi cân bằng phân bố với hệ số phân bố được tính theo công thức sau:
K =
Trong đó : là nồng độ của chất phân tích tương ứng trong pha tĩnh và pha động ở thời điểm cân bằng.
1.4.2.3. Hệ số chọn lọc
Hai chất chỉ được tách ra khi chúng có giá trị k' khác nhau, hệ số chọn lọc cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc kí.
α = = = =
Ở đây ta quy ước chất B bị lưu giữ mạnh hơn chất A như vậy luôn lớn hơn 1, càng lớn thì khả năng tách của 2 chất càng rõ. Thường phân tích trong điều kiện trong khoảng 1,5 đến 2.
1.4.2.4. Số đĩa lý thuyết và chiều cao đĩa lý thuyết
Hiệu lực cột thường biểu thị qua hai thông số: Số đĩa lý thuyết (N) hoặc chiều cao đĩa lý thuyết (H). Cột sắc ký được coi như có N tầng lý thuyết, ở mỗi
tầng sự phân bố chất tan vào 2 pha lại đạt đến một trạng thái cân bằng mới. Mỗi tầng được giả định như một lớp pha tĩnh có chiều cao H. Đĩa lý thuyết được định nghĩa như một khu vực của hệ thống phân tách mà trong đó thiết lập một cân bằng nhiệt động giữa nồng độ trung bình của chất tan trong pha tĩnh và trong pha động.
Số đĩa lý thuyết N được tính theo các công thức:
N = 16× hoặc 5,54× Trong đó: W là chiều rộng pic ở đáy pic
là chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của pic Chiều cao của đĩa lý thuyết được tính theo công thức:
H= N L
Trong đó: L là chiều cao cột sắc kí.
Với một điều kiện sắc kí nhất định, chiều cao đĩa lý thuyết (H) và số đĩa lý thuyết (N) là hằng định đối với mỗi chất phân tích.
1.4.2.5. Độ phân giải (RS)
Độ phân giải là đại lượng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trong điều kiện sắc kí đã cho. Độ phân giải của hai pic cạnh tranh được tính theo 1 trong 3 công thức sau:
=
hoặc ×
Trong đó:
, : thời gian lưu tương ứng của chất A, chất B.
, : Chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao pic của chất A, chất B. , : Chiều rộng pic ở đáy pic.
1.4.3. Hệ thống máy HPLC
Hệ thống máy HPLC có các bộ phận chính sau: - Bình chứa dung môi (pha động).
- Bộ khử khí.
- Bơm cao áp: đẩy pha động qua cột sắc kí.
- Bộ tiêm mẫu: tiêm vào cột một thể tích mẫu nhất định. - Cột tách (pha tĩnh).
- Detector.
- Máy ghi tín hiệu hoặc máy vi tính. - Máy in.
Hình 1.3. Hình ảnh máy HPLC
1.4.4. Kết quả xác định một số chất theo phương pháp HPLC
Ở nước ta, phương pháp HPLC được ứng dụng nhiều trong phân tích các chế phẩm về dược cũng như hỗn hợp các chất vô cơ, hữu cơ. Các kết quả đều cho thấy phương pháp có độ tin cậy cao.
Phương pháp định lượng đồng thời acetaminophen và axit mefenamic: phương pháp có độ chính xác cao (sai số tương đối 0,51% – 1,42%), độ đúng tốt (tỷ lệ thu hồi 98,16% – 99,16%) [17].
Phương pháp định tính và định lượng đồng thời acetaminophen và ibuprofen: phương pháp có độ lặp lại tốt (sai số tương đối 0,81% - 1,03%), độ đúng cao (tỷ lệ thu hồi 98,0% – 98,4%). [2, 17]
Phương pháp định lượng đồng thời acetaminophen và cafein: phương pháp có độ lặp lại tốt (sai số tương đối 0,54% – 1,07%), độ đúng cao (tỷ lệ thu hồi 98,9% – 99,5%). [2]
Phương pháp định lượng đồng thời acetaminophen, phenylpropanolamin hidroclorit và clorphenylamin maleat: phương pháp có độ lặp lại cao (sai số tương đối của acetaminophen là 0,47%; phenylpropanolamin hidroclorid là 0,67% và clorphenylamin maleat là 1,19%), độ đúng cao (tỷ lệ thu hồi 99,61% – 100,65%). [17]
Chƣơng 2 THỰC NGHIỆM 2.1. Nội dung nghiên cứu
Áp dụng phương pháp HPLC và phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử để xây dựng quy trình xác định đồng thời acetaminophen, codein phosphat trong thuốc actadol codein trên thị trường.
2.1.1. Phương pháp HPLC
Lựa chọn các thông số của máy HPLC: - Thể tích bơm mẫu.
- Cột tách. - Nhiệt độ.
Khảo sát để lựa chọn các điều kiện sắc ký:
- Bước sóng thích hợp để phát hiện đồng thời 2 chất. - Pha động: thành phần, tỷ lệ pha động, tốc độ dòng... Đánh giá quy trình sắc ký đã xây dựng được:
- Khảo sát tính thích hợp của hệ thống.
- Khảo sát khoảng tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của các chất. - Khảo sát độ chính xác của phương pháp.
- Khảo sát độ đúng của phương pháp.
Xác định đồng thời ACT và CĐI trong thuốc Actadol codein theo phương pháp HPLC.
2.1.2. Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử
- Tiến hành quét phổ từ 200 nm đến 900 nm để xác định kiểm tra lại bước sóng hấp thụ quang cực đại của ACT và CĐI.
- Khảo sát sự ổn định độ hấp thụ quang của ACT, CĐI theo môi trường nền, pH, thời gian, nhiệt độ để lựa chọn khoảng thời gian, nhiệt độ và pH
- Khảo sát khoảng tuyến tính của ACT, CĐI từ đó xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ).
- ACT và CĐI
ACT: CĐI .
- Xây dựng quy trình phân tích mẫu thuốc Actadol codein,
.
- Định lượng đồng thời ACT và CĐI trong mẫu thuốc Actadol codein [5, 8, 10, 14, 16].
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
ACT, CĐI
ACT và CĐI [3, 4, 20, 22, 23].
2.2.2.1. Phương pháp HPLC
- ACT, CĐI và hỗn hợp dung dịch .
- Tiến hành chạy sắc kí theo các nội dung đã trình bày ở mục 2.1.1
- Xác định đồng thời các cấu tử trong hỗn hợp và trong mẫu thuốc Actadol codein
2.2.2.2. Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử
- ACT, CĐI .
- Xác định ACT và CĐI.
- .
- 2 Actadol codein.
- giá độ tin cậy của quá trình phân tích, để tính toán các kết quả thí nghiệm của luận văn
2.3. Đánh giá độ tin cậy của quy trình phân tích 2.3.1. Giới hạn phát hiện (LOD) 2.3.1. Giới hạn phát hiện (LOD)
LOD được coi là nồng độ thấp nhất của chất nghiên cứu mà hệ thống phân tích cho tín : 3.SD LOD = B Trong đó:
SD: độ lệch chuẩn của tín hiệu y trên đường chuẩn.
B: độ dốc của đường chuẩn chính là độ nhạy của phương pháp trắc quang.
2.3.2. Giới hạn định lượng (LOQ)
với tín hiệu nền và đạt độ tin cậy tối thiểu 95%, thông thường người ta sử dụng công thức:
10.SD LOQ =
B
2.3.3. Đánh giá độ tin cậy của phương pháp
- ACT và CĐI
tự pha chế thông qua sai số tương đối RE. Sai số tươ
: Tinh toan 0 0 C - C RE% = .100% C
Trong đó: RE% là sai số tương đối của phép xác định nồng độ các cấu tử.
CTinh toan (µg/mL) .
-
thông qua độ thu
: T C - Re = .100% a a C v
Trong đó: CT: nồng độ (µg/mL ACT CĐI xác định được trong mẫu sau khi thêm chuẩn;
Ca: nồng độ (µg/mL ACT ho CĐI .
a: nồng độ (µg/mL ACT CĐI thêm vào mẫu
(đã biết). - (RSD). n n 2 2 i i i=1 i=1 -μ -C S = = k k C C RSD = .100(%) C S
Trong đó: Ci (µg/mL) ACT CĐI
tính được lần thứ i;
là giá trị nồng độ thực của mẫu;
C là giá trị nồng độ trung bình tính được sau n lần xác định; k là số bậc tự do.
2.3.4. Đánh giá kết quả phép phân tích theo thống kê
Khoảng tin cậy của phép xác định nồng độ được tính theo công thức: