Định lượng đồng thời paracetamol, cafein trong thuốc panadol extra và hapacol extra bằng phương pháp HPLC và phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM BÙI ĐỨC NGỌC ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI PARACETAMOL VÀ CAFEIN TRONG THUỐC PANADOL EXTRA VÀ HAPACOL EXTRA BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC VÀ PHƯƠNG PHÁP QUAN

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

BÙI ĐỨC NGỌC

ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI PARACETAMOL VÀ CAFEIN TRONG THUỐC PANADOL EXTRA VÀ HAPACOL EXTRA BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC VÀ PHƯƠNG PHÁP

QUANG PHỔ HẤP THỤ PHÂN TỬ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC VẬT CHẤT

THÁI NGUYÊN - 2015

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

BÙI ĐỨC NGỌC

ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI PARACETAMOL VÀ CAFEIN TRONG THUỐC PANADOL EXTRA VÀ HAPACOL EXTRA BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC VÀ PHƯƠNG PHÁP

QUANG PHỔ HẤP THỤ PHÂN TỬ Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 60.44.01.18

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC VẬT CHẤT

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Mai Xuân Trường

THÁI NGUYÊN - 2015

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN i http://www.lrc.tnu.edu.vn

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này

Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này

đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc

Xác nhận của giáo viên

hướng dẫn khoa học

PGS.TS Mai Xuân Trường

Thái Nguyên, tháng 04 năm 2015

Tác giả luận văn

Bùi Đức Ngọc

XÁC NHẬN CỦA KHOA HÓA HỌC

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo, cán bộ phòng thí nghiệm Khoa Hóa học - đã tận tình giảng dạy, giúp đỡ tôi về chuyên môn trong quá trình nghiên cứu và thực hiện luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng Đào tạo - Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi tronng suốt quá trình tôi học tập cũng như nghiên cứu và thực hiện luận văn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến bố mẹ, những người thân trong gia đình tôi, Ban giám hiệu và đồng nghiệp trường THPT số 2 Sa Pa đã giúp đỡ động viên trong quá trình tôi học tập, nghiên cứu và thực hiện luận văn này

Tôi xin trân trọng cảm ơn!

Thái Nguyên, tháng 4 năm 2015

Tác giả

Bùi Đức Ngọc

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN iii http://www.lrc.tnu.edu.vn

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CỦA LUẬN VĂN iv

DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN v

DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG LUẬN VĂN vi

MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về paracetamol và cafein 2

1.1.1 Paracetamol 2

1.1.2 Cafein 5

1.2 Các định luật cơ sở của sự hấp thụ ánh sáng 11

1.2.1 Định luật Bughe - Lămbe - Bia 11

1.2.2 Định luật cộng tính 12

1.2.3 Những nguyên nhân làm cho sự hấp thụ ánh sáng của dung dịch không tuân theo định luật Bughe - Lămbe - Bia 13

1.3 Một số phương pháp xác định đồng thời các cấu tử 14

1.3.1 Phương pháp Vierordt 14

1.3.2 Phương pháp phổ đạo hàm 15

1.3.3 Phương pháp lọc Kalman 17

1.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC 18

1.4.1 Nguyên tắc của phương pháp HPLC 19

ắc ký 19

1.4.3 Kết quả xác định một số chất theo phương pháp HPLC 22

Chương 2: THỰC NGHIỆM 23

2.1 Nội dung nghiên cứu 23

2.1.1 Phương pháp HPLC 23

2.1.2 Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử 24

2.2 Phương pháp nghiên cứu 24

2.3 Đánh giá độ tin cậy của quy trình phân tích 24

2.3.1 Giới hạn phát hiện (LOD) 24

2.3.2 Giới hạn định lượng (LOQ) 25

2.3.3 Đánh giá độ tin cậy của phương pháp 25

2.3.4 Đánh giá kết quả phép phân tích theo thống kê 26

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 30

3.1 Phương pháp HPLC 30

3.1.1 Xây dựng điều kiện để xác định đồng thời 2 chất PRC và CFI 30

3.1.2 Đánh giá phương pháp định lượng 32

3.1.3 Xác định PRC và CFI trong thuốc PANADOL extra và kiểm tra độ đúng bằng phương pháp thêm chuẩn 37

3.1.4 Xác định PRC và CFI trong thuốc HAPACOL extra và kiểm tra độ đúng bằng phương pháp thêm chuẩn 39

3.2 Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử 41

3.2.1 Kiểm tra phổ hấp thụ phân tử của paracetamol và cafein 41

3.2.2 Kiểm tra sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của PRC và CFI vào pH 42

3.2.3 Kiểm tra sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của PRC và CFI theo thời gian 43

3.2.5 Khảo sát khoảng tuyến tính tuân theo định luật Bughe - Lambe - Bia của PRC và CFI Xác định chỉ số LOD và LOQ 45

3.2.6 Khảo sát đánh giá độ tin cậy của phương pháp nghiên cứu trên các mẫu tự pha 48

3.3 Xác định đồng thời PRC và CFI trong thuốc PANADOL extra 50

3.4 Xác định đồng thời PRC và CFI trong thuốc HAPACOL extra 54

KẾT LUẬN 58

TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN v http://www.lrc.tnu.edu.vn

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CỦA LUẬN VĂN

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu

năng cao

High Performance Liquid

DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN

Bảng 3.1 Giá trị các đại lượng đặc trưng 33

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát thời gian lưu 33

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát diện tích pic 33

Bảng 3.4 Mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của PRC và CFI 34

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát độ lặp lại 36

Bảng 3.6 Kết quả phân tích thuốc PANADOL extra 37

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát độ đúng bằng phương pháp thêm chuẩn với thuốc PANADOL extra 38

Bảng 3.8 Kết quả phân tích thuốc HAPACOL extra 39

Bảng 3.9 Kết quả khảo sát độ đúng bằng phương pháp thêm chuẩn với thuốc HAPACOL extra 40

Bảng 3.10 Độ hấp thụ quang của PRC và CFI theo PH 42

43

I theo nhiệt độ 44

Bảng 3 46

LOD và LOQ của PRC 46

Bảng 3 47

nh LOD và LOQ của CFI 48

Bảng 3.17: Pha chế các dung dịch hỗn hợp PRC và CFI 49

49

Bảng 3.19 Kết quả tính nồng độ, sai số PRC và CFI trong mẫu thuốc PANADOL Extra 51

Bảng 3.20 Hàm lượng PRC và CFI thêm vào mẫu thuốc 52

Bảng 3.21 Kết quả xác định độ thu hồi của PRC và CFI trong mẫu thuốc PANADOL extra được quy về một viên thuốc 53

Bảng 3.22 Kết quả tính nồng độ, sai số PRC và CFI trong mẫu thuốc 53

Bảng 3.23 Kết quả xác định độ thu hồi của PRC và CFI trong mẫu thuốc HAPACOL extra được quy về 1 viên thuốc 56

DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG LUẬN VĂN

Hình 3.1 Sắc ký đồ của PRC (400 µg/mL) 31Hình 3.2 Sắc ký đồ của CFI (60 µg/mL) 31Hình 3.3 Sắc ký đồ của PRC và CFI 31Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện

tích pic của PRC 35Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện

tích pic của CFI 363.6 Phổ hấp thụ của các dung dịch chuẩn PRC (1) và CFI (2) 42Hình 3.7

PRC 453.8

48

MỞ ĐẦU

Trong cuộc sống hiện đại ngày nay xuất hiện nhiều loại dược phẩm khác nhau và được phân phối rộng rãi trên thị trường Các loại thuốc tân dược ngày các phát triển mạnh và có nhiều công dụng khác nhau như kháng sinh, giảm đau, hạ sốt với nhiều thành phần có trong thuốc như amoxilin, paracetamol, codein photphat, cafein Việc xác định chính xác hàm lượng các loại thuốc này theo tiêu chuẩn của nhà sản xuất cần tách riêng từng loại chất và định lượng chúng bằng các phương pháp khác nhau Do đó để đánh giá đúng chất lượng sản phẩm một cách nhanh chóng, chính xác, an toàn và hiệu quả thì công tác kiểm nghiệm để xác định các thành phần của thuốc bằng các phương pháp hiện đại có độ chính xác cao ngày càng được quan tâm Nhiều phương pháp có

độ lặp và độ chính xác cao đã được ứng dụng Các công trình nghiên cứu trước đây cho thấy việc sử dụng phương pháp HPLC, phương pháp UV-VIS dùng phổ toàn phần kết hợp với kỹ thuật tính toán và ứng dụng phần mềm máy tính

đã được nghiên cứu và cho nhiều ưu điểm như độ nhạy, độ lặp, độ chính xác,

độ tin cậy của phép phân tích cao, phân tích nhanh, tiện lợi [3, 9, 14]

ọ : "Định lượng đồng thời paracetamol, cafein trong thuốc panadol extra và hapacol extra bằng phương pháp HPLC và phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử"

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về paracetamol và cafein

1.1.1 Paracetamol

1.1.1.1 Giới thiệu chung

- Tên quốc tế: Paracetamol

- Tên khác: Acetaminophen

- Biệt dược: panadol, Efferalgan, paracetamol

- Công thức phân tử: C8H9O2N

- Khối lượng phân tử: 151,17g/mol

- Công thức cấu tạo:

- Tên IUPAC: N-(4-hydroxyphenyl) acetamit hoặc p-hydroxy acetaninit hoặc 4-hydroxy acetanilit

- Tên gọi paracetamol được lấy từ tên hóa học cảu hợp chất para- acetyl aminophenol

1.1.1.2 Tính chất

Tính chất vật lý

- Paracetamol là chất bột, kết tinh màu trắng, không mùi, vị đắng nhẹ

- Khối lượng riêng: 1,263 g/cm3

Nhóm -OH làm cho chế phẩm có tính axit và khi tác dụng với muối sắt (III) cho màu tím

Đun nóng với dung dịch HCl thì bị thủy phân, thêm nước thì không có kết tủa vì p-aminophenol tạo thành tan trong axit Thêm thuốc thử kali dicromat thì có kết tủa màu tím khác với phenacetin là không chuyển sang màu đỏ

ít nhiều được hoạt hóa như nhau Sự liên kết cũng làm giảm đáng kể tính bazơ của oxi và nitơ, khi tạo hydroxyl có tính axit

Paracetamol được tổng hợp 4 bước từ nguyên liệu đầu là phenol:

- Phenol được nitro hóa bởi axit sunfuric và natri nitrit tạo ra 2 đồng phân ortho và para - nitro phenol

- Đồng phân para được tách ra khỏi đồng phân ortho bằng phản ứng thủy phân

- Khử para-nitro phenol bằng NaBH4 trong môi trường kiềm cho ra aminophenol

para Parapara aminophenol phản ứng với anhidrit axetic cho ra paracetamol

Đem kết tinh lại paracetamol trong hỗn hợp etanol-nước

1.1.1.3.Tác dụng dược lý

Paracetamol ức chế ezyme cyclooxinat (COX) là một enzym xúc tác việc tổng hợp prostagladin, nên làm giảm tính cảm thụ của ngọn dây thần kinh cảm giác với các chất gây đau, có tác dụng giảm đau Giảm tổng hợp prostagladin

và E2 do đó ức chế quá trình sinh nhiệt tăng cường quá trình thải nhiệt và lập lại cân bằng cho trung tâm điều nhiệt, có tác dụng hạ sốt PRC không có tác dụng chống viêm, chống ngưng kết ở tiểu cầu

Chỉ định: hạ sốt do mọi nguyên nhân gây sốt Giảm các cơn đau ngoại vi

từ nhẹ đến trung bình

PRC ít tác động đến hệ thần kinh tim mạch và hô hấp, không làm thay đổi đến cân bằng axit - bazơ, không gây kích ứng, xước hoặc chảy máu dạ dày

vì nó không ảnh hưởng lên COX toàn thân mà chỉ tác động đến COX của hệ thần kinh trung ương

PRC không có tác dụng trên tiểu cầu và đông máu, không có tác dụng trị đông máu, không thải trừ axit uric, không có tác dụng chống viêm Khi sử dụng với liều lượng quá liều ( >10g) làm tổn thương gan và có thể đến chết người

Chống chỉ định: người bệnh nhiều lần thiếu máu, có bệnh tim phổi, thận

và gan Người bệnh quá mẫn cảm với paracetamol Người bệnh thiếu hụt glucozo-6-photphat dehydrogenat

1.1.1.4 Dạng thuốc

- Chế phẩm viên nén: Paracetamol, panadol, donodol

- Chế phẩm viên đạn: Efferagan, panadol

- Chế phẩm viên sủi: Efferagan, panadol, donodol

1.1.2.1 Giới thiệu chung

- Tên quốc tế: Cafein

- Một số tên khác: trimethylxanthine, coffeine, theine, mateine, guaranine, methyltheobromine và 1,3,7-trimethylxanthine

- Công thức phân tử: C8H10N4O2

- Khối lượng mol phân tử: 194,19 g/mol

- Công thức cấu tạo:

- Tên IUPAC: 1,3,7 - trimetyl xanthin

- Một tách cà phê 250 mL chứa khoảng 40 - 170 mg cafein

- Một tách cà phê tan chứa khoảng 40 - 100 mg cafein

- Một tách cà phê loại bỏ cafein vẫn chứa khoảng 3 - 5 mg cafein

Chè

- Chè đen (Mỹ) chứa khoảng 17 - 75 mg cafein/200mL

- Chè đen (nước khác) chứa khoảng 20 - 100 mg cafein/200mL

- Chè ô long chứa khoảng 12 - 55 mg cafein mỗi túi nhỏ (pha được một tách 150 - 250 mL)

- Chè xanh chứa khoảng 8 - 30 mg cafein mỗi túi nhỏ (pha được một tách 150 - 250 mL)

- Chè tuyết chứa khoảng 6 - 25 mg cafein mỗi túi nhỏ (pha được một tách 150 - 250 mL)

1.1.2.4 Công dụng của cafein

Cafein có tác dụng kích thích hoạt động hệ thần kinh trung ương chọn lọc trên vỏ não, làm tăng khả năng nhận thức, tăng khả năng làm việc trí óc, làm giảm cảm giác mệt mỏi, buồn ngủ Thuốc có tác dụng kích thích, liều cao làm tim đập nhanh, co bóp mạnh, tăng lưu lượng máu qua tim Thuốc có tác dụng lợi tiểu nhưng kém theophyllin và theobromin

Ảnh hưởng của cafein: khi dùng với liều lượng nhiều sẽ gây các ảnh hưởng như căng thẳng thần kinh, hưng phấn, tăng huyết áp, giãn nở phế quản, lợi tiểu (từ 300mg/ ngày trở lên), kích thích nhu động ruột, mất ngủ

Tổ chức y tế thế giới không xếp cafein vào nhóm chất gây nghiện Đến nay vẫn không có dấu hiệu gì rõ ràng chứng minh cafein nguy hại đến sức khỏe, ngay cả những trường hợp sử dụng thường xuyên cafein trong thời gian dài Tuy nhiên việc dùng cafein nhiều có thể dẫn tới sự phụ thuộc về tâm lý, trong trường hợp này mùi vị cà phê, khẩu vị người uống và truyền thống cũng đóng vai trò quan trọng

Sự phụ thuộc vào cafein có thể dẫn tới các biểu hiện như nhức đầu, căng thẳng, run rẩy, hồi hộp, thiếu tập trung, cáu giận Cơ thể cần khoảng 3 ngày để loại

bỏ cafein, sau thời gian này những tác dụng phụ trên sẽ hoàn toàn mất đi Nếu dùng cafein với liều lượng cao có thể làm tăng nhịp tim và lợi tiểu Tuy vậy, nếu uống những loại đồ uống chậm giải phóng caffein như guarana hay chè đen thì có thể hạn chế được các ảnh hưởng tiêu cực của caffein cũng như tận dụng được các tác dụng của nó

Cafein có chứa trong sôcôla hay chè đen không hẳn là vô hại đối với trẻ em: ví dụ như lượng cafein có trong 3 lon cola và 3 thanh sôcôla cũng tương

đương với lượng cafein trong 2 tách cà phê (khoảng 200 mg) Một đứa trẻ nặng

30 kg nếu dùng một liều lượng tương đương 7 mg/1 kg cơ thể có thể bị căng thẳng

và mất ngủ

Cafein có trong danh sách doping của Uỷ ban Thế vận hội Quốc tế Tuy nhiên, hàm lượng tiếp thu vào trong người đủ để bị cấm là rất cao, vì vậy các vận động viên có thể uống cà phê trong bữa sáng

Liều gây độc của cafein khoảng 10 g, tương đương với 100 tách cà phê Liều gây độc của cafein cho một con chuột cống nặng 1 kg là 381 mg

Được biết rằng, nước bưởi có khả năng kéo dài thời gian bán huỷ của cafein, bởi chất đắng trong quả bưởi sẽ kìm hãm quá trình trao đổi chất của cafein trong gan

1.1.2.5.Dược lý và cơ chế tác động

Cafein gây ra sự hưng phấn và kéo dài thời gian tỉnh táo bằng cách ngăn cản hoạt động bình thường của adenosine và photphodiesterat

Adenosine được tạo ra trong quá trình hoạt động của cơ thể Khi nồng độ

đủ cao, nó sẽ gắn với receptor (thụ thể) làm cho hệ thần kinh phát ra tín hiệu nghỉ ngơi dẫn đến mệt mỏi và buồn ngủ do cấu trúc phân tử gần giống nhau, cafein cạnh tranh với adenosine trong việc liên kết với receptor đặc hiệu, điều này làm hệ thần kinh sẽ chỉ đạo cho cơ thể tiếp tục làm việc thay vì việc phát ra tín hiệu nghỉ ngơi

Cafein cũng ngăn chặn photophodiesterat không cho tổng hợp chất truyền tin thứ cấp

1.1.2.6 Điều chế

Cafein là một ancaloit có nhân purin được tìm thấy trong nhiều loại thực vật như chè, cà phê, cacao Nó đã được Runge chiết xuất vào năm 1920, Pelletier và Caventou chiết vào năm 1921 Do nhu cầu sử dụng lớn nên hiện nay cafein được điều chế chủ yếu bằng phương pháp tổng hợp hóa học

Phương pháp đi từ dẫn xuất của ure và axit xyanoaxetic theo sơ đồ sau:

Trong công nghiệp dược phẩm còn sử dụng nguyên liệu có nhân purin để tổng hợp cafein, ví dụ axit uric lấy từ phân gà, phân chim

Cafein còn được điều chế bằng cách metyl hóa theobromin lấy từ công nghiệp chế biến cacao và bán tổng hợp từ xanthin

Các dẫn xuất của xanthin:

Dạng enol Dạng ceto

Xanthin Purin

Xanthin là dẫn xuất hidroxy của nhân purin

Bản thân xanthin không có tác dụng sinh học nhưng dẫn chất metyl hóa của nó là những chất có tác dụng tốt như:

Cafein

Cafein, theophylin, theobromin đều là những bazơ yếu do nguyên tử ni tơ

ở vị trí 9 Hai chất sau còn có tính axit vì chúng có một nguyên tử hidro linh động ở nhóm imit (vị trí 7 đối với theophilin và vị trí 1 đối với theobromin) Các hidro này có thể chuyển thành dạng enol với nguyên tử oxi bên cạnh Vì vậy theophilin và theobromin là những chất lưỡng tính (vừa có tính kiềm vừa có tính axit) Chúng có thể tạo ra muối dễ tan trong nước và với các axit và kiềm:

Trong môi trường kiềm chúng có thể tạo muối với các muối kim loại khác như muối bạc cho kết tủa trắng, muối coban cho kết tủa có màu (ứng dụng

để định tính các chất này) Cafein trong phân tử không có hidro linh động nên

không có tính axit mà chỉ là một bazơ yếu Dựa vào sự khác nhau này để xác định giới hạn tạp chất theophylin và theobromin trong cafein

Phản ứng chung của các alcaloit có nhân xanthin là phản ứng với amoniac Cho các chế phẩm tác dụng với chất oxy hóa (như Br2, H2O2, HNO3

) bằng cách đun trên nồi điện đến cạn, sau đó cho tác dụng với amoniac thì có màu đỏ tía do tạo thành muối amoni của axit puric

Trong số các dẫn xuất của xanthin thì cafein có tác dụng kích thích thần kinh trung ương tốt nhất

1.2 Các định luật cơ sở của sự hấp thụ ánh sáng

1.2.1 Định luật Bughe - Lămbe - Bia

và bề dày lớp dung dịch mà ánh sáng truyền qua

Phương trình toán học biểu diễn định luật Bughe - Lămbe - Bia

Trong đó:

A : độ hấp thụ quang của dung dịch ở bước sóng (A không có thứ nguyên)

: hệ số hấp thụ mol phân tử của cấu tử tại bước sóng b: bề dày lớp dung dịch (cm)

C: nồng độ của cấu tử trong dung dịch (mol/lít)

Định luật Bughe - Lămbe - Bia là sự tổ hợp của hai định luật thứ nhất và thứ hai của sự hấp thụ ánh sáng

1.2.2 Định luật cộng tính

Định luật cộng tính là một sự bổ sung quan trọng cho các định luật hấp thụ ánh sáng vừa xét Định luật cộng tính là cơ sở định lượng cho việc xác định nồng độ của hệ trắc quang nhiều cấu tử

Bản chất của định luật cộng tính là sự độc lập của đại lượng độ hấp thụ quang của một chất riêng biệt khi có mặt của các chất khác có sự hấp thụ ánh sáng riêng

Biểu diễn tính cộng tính về độ hấp thụ quang của dung dịch hỗn hợp chứa n cấu tử tại bước sóng bằng phương trình toán học:

1.2.3 Những nguyên nhân làm cho sự hấp thụ ánh sáng của dung dịch không tuân theo định luật Bughe - Lămbe - Bia

Xuất phát từ biểu thức của định luật Bughe - Lămbe - Bia A= f( , b, C) nghĩa là độ hấp thụ quang A là hàm số của ba biến:

- Sự có mặt của các chất điện giải lạ trong dung dịch màu làm biến dạng các phần tử hoặc các ion phức màu làm ảnh hưởng đến sự hấp thụ ánh sáng của các tiểu phân hấp thụ ánh sáng

- Hiệu ứng solvat hóa: sự solvat hóa (hay hydrat hóa) làm giảm nồng độ các phần tử dung môi tự do, do đó làm thay đổi nồng độ của dung dịch màu và làm ảnh hưởng đến sự hấp thụ ánh sáng của dung dịch màu

- Hiệu ứng liên hợp: trong một số trường hợp có sự tương tác của chính các tiểu phân hấp thụ ánh sáng để tạo ra các tiểu phân polime làm thay đổi nồng độ hợp chất màu

- Ảnh hưởng pH của dung dịch: sự thay đổi nồng độ của ion H+ (tức thay đổi pH) của dung dịch sẽ ảnh hưởng đến sự tuân theo định luật Bughe - Lămbe - Bia theo các trường hợp sau:

+ Thuốc thử có đặc tính axit: sự thay đổi nồng độ ion H+

làm chuyển dịch cân bằng tạo thành chất màu

+ Thay đổi pH kéo theo sự thay đổi thành phần hợp chất màu

+ Khi tăng pH phức màu có thể bị phân hủy do sự tạo thành phức hydroxo + Dưới ảnh hưởng của ion H+

trạng thái tồn tại và màu của dung dịch cũng thay đổi

- Ảnh hưởng của sự pha loãng dung dịch phức màu: khi pha loãng các dung dịch phức màu sẽ gây ra sự lệch khỏi định luật Bughe - Lămbe - Bia

- Nhiệt độ môi trường và dung dịch đo phổ trong cuvet là không hằng định suốt trong thời gian đo Vì trong một mức độ nhất định độ hấp thụ quang

A phụ thuộc vào nhiệt độ

1.3 Một số phương pháp xác định đồng thời các cấu tử

1.3.1 Phương pháp Vierordt

Để xác định nồng độ của các cấu tử trong hỗn hợp, lần đầu tiên Vierordt đã

đo độ hấp thụ quang của dung dịch hỗn hợp ở các bước sóng khác nhau, sau đó thiết lập hệ phương trình bậc nhất mà số phương trình bằng số ẩn số (số cấu tử trong hỗn hợp), giải hệ phương trình này sẽ tính được nồng độ của các cấu tử Điều kiện

để áp dụng phương pháp này là các cấu tử trong hỗn hợp phải tuân theo định luật Bughe - Lămbe - Bia và thỏa mãn tính cộng tính của độ hấp thụ quang

Với hỗn hợp chứa n cấu tử ta cần phải lập hệ n phương trình n ẩn Hệ phương trình này được thiết lập bằng cách đo độ hấp thụ quang của hỗn hợp ở

in: hệ số hấp thụ mol phân tử của cấu tử i tại bước sóng n (được xác định bằng cách đo độ hấp thụ quang của dung dịch chỉ chứa cấu tử i ở bước sóng n )

b: bề dày lớp dung dịch (cm)

Ci: nồng độ của cấu tử thứ i trong hỗn hợp (mol/lít) Với i, j = 1 n

Giải hệ n phương trình với n ẩn số là C1, C2 Cn sẽ tìm được nồng độ của các cấu tử Khi số cấu tử trong hỗn hợp ít thì việc giải hệ n phương trình tuyến tính khá đơn giản Tuy nhiên khi số cấu tử lớn thì việc giải hệ phương trình phức tạp hơn

Phương pháp Vierordt chủ yếu được vận dụng để tìm cách giải hệ phương trình như: giải bằng đồ thị, giải bằng phép ma trận vuông, phương pháp khử Gauss, để xác định nồng độ của mỗi cấu tử

Một số tác giả sử dụng phương pháp Vierordt để xác định đồng thời paracetamol và clopheninamin maleat trong thuốc viên nén bằng cách đo độ hấp thụ quang ở các bước sóng 242 và 264 nm, còn một số tác giả khác đã xác định đồng thời axit salixylic và chloramphenilcol bằng cách đo độ hấp thụ quang ở các bước sóng 278 và 297 nm[3]

Phương pháp Vierordt đơn giản, dễ thực hiện nhưng chỉ áp dụng được khi số cấu tử trong dung dịch hỗn hợp ít, phổ hấp thụ quang phân tử xen phủ nhau không nhiều, tính chất cộng tính độ hấp thụ quang được thoả mãn nghiêm ngặt, thiết bị đo quang tốt thì phương pháp cho kết quả khá chính xác Đối với

hệ nhiều cấu tử, đặc biệt là khi phổ của các cấu tử xen phủ nhau nhiều, tính chất cộng tính độ hấp thụ quang không được thoả mãn nghiêm ngặt, thiết bị đo

có độ chính xác không cao thì phương pháp không chính xác và có sai số lớn Bởi vậy mặc dù phương pháp Vierordt tuy ra đời đã lâu, nhưng ứng dụng trong thực tế còn rất ít Tuy nhiên đây là cơ sở lý thuyết cơ bản nhất, đặt nền móng cho các nhà khoa học sau này phát triển, cải tiến để xây dựng nên các phương pháp mới[3]

1.3.2 Phương pháp phổ đạo hàm

Độ hấp thụ quang của các cấu tử là hàm của độ dài bước sóng của ánh sáng tới A = f( ) Phổ đạo hàm của độ hấp thụ quang theo bước sóng được biểu diễn bằng phương trình toán học:

Đạo hàm bậc 1 của độ hấp thụ quang: 1 ,

1 λ

A = a0 + a1 + a2 2 + + ak k (1.8) Các hệ số a0, a1 ak tại mỗi bước sóng tương ứng là các giá trị đạo hàm bậc 0, 1, 2 k Để có phổ đạo hàm đối với tập số liệus phổ bậc không, đầu tiên ta phải sử dụng phương pháp hồi quy bình phương tối thiểu để tìm được hàm hồi quy là đa thức bậc cao Sau đó lấy đạo hàm của hàm này ta sẽ được các phổ đạo hàm

Đối với phổ đạo hàm bậc 0, 1 n ta thấy có những đặc điểm như sau: đỉnh của phổ đạo hàm bậc n là điểm uốn của phổ đạo hàm bậc (n - 1), còn tại

đỉnh của phổ đạo hàm bậc (n-1) thì phổ đạo hàm bậc n có giá trị bằng 0 Số đỉnh của phổ đạo hàm bậc n nhiều hơn số đỉnh của phổ đạo hàm bậc (n - 1)

Như vậy, dùng phương pháp phổ đạo hàm ta có thể tách phổ gần trùng nhau thành những phổ mới và khi đó ta có thể chọn được những bước sóng mà tại đó chỉ có duy nhất 1 cấu tử hấp thụ quang còn các cấu tử khác không hấp thụ, nhờ đó mà có thể xác định được từng chất trong hỗn hợp Bằng toán học, người ta xây dựng được phần mềm khi đo phổ của dung dịch hỗn hợp có thể ghi ngay được phổ đạo hàm các bậc của phổ đó Căn cứ vào các giá trị phổ đạo hàm ta lựa chọn được bước sóng xác định đối với từng cấu tử

Ở nước ta, một số tác giả đã sử dụng phương pháp phổ đạo hàm xác định đồng thời các vitamin tan trong nước cũng như xác định đồng thời các chế phẩm dược dụng khác Các kết quả thu được có sai số trong khoảng 1,7 5%[8]

Trên thế giới, phương pháp phổ đạo hàm được ứng dụng để phân tích các chế phẩm dược dụng cũng như hỗn hợp các chất vô cơ, hữu cơ Hầu hết các kết quả đều cho thấy phương pháp có độ tin cậy cao Tuy nhiên phương pháp phổ đạo hàm chỉ được áp dụng khi số cấu tử trong dung dịch ít và phổ hấp thụ quang phân tử của chúng không trùng nhau[3, 8]

1.3.3 Phương pháp lọc Kalman

xỉ Kalman

1.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

Phương pháp này ra đời từ năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển Hiện nay phương pháp HPLC ngày càng phát triển và hiện đại hoá cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành

chế tạo máy phân tích Nó áp dụng rất nhiều trong các ngành kiểm nghiệm đặc biệt là ứng dụng cho ngành kiểm nghiệm thuốc, máy phân tích HPLC là công

cụ đắc lực trong phân tích các thuốc đa thành phần cho phép định tính và định lượng Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều

lý do: có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt

1.4.1 Nguyên tắc của phương pháp HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp tách một hỗn hợp chất lỏng dựa trên sự phân bố chúng giữa hai pha, một pha đứng yên gọi là pha tĩnh, một pha di chuyển gọi là pha động Do ái lực hấp thu và giải hấp thu khác nhau của các hợp phần có trong mẫu phân tích với pha tĩnh và pha động mà chúng di chuyển dọc theo pha tĩnh (cột sắc ký) tốc độ khác nhau nên lần lượt đi ra khỏi cột

Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột:

+ Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc

ký và lọai sắc ký

- Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ pha thuận hoặc pha đảo

- Nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion thì ta có sắc ký trao đổi ion

- Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc ký phân bố hay sắc ký chiết

- Nếu pha tĩnh là gel thì ta có sắc ký gel hay rây phân tử

+ Để rửa rải chất phân tích ra khỏi cột, ta cần có một pha động Nếu nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp chất phân tích A, B, C vào cột phân tích, kết quả

là các chất A, B, C sẽ được tách ra khỏi nhau sau khi đi qua cột

1.4.2

1.4.2.1 Hệ số phân bố

Cân bằng của một cấu tử X trong hệ sắc ký có thể được mô tả bằng phương trình như sau:

Hằng số cân bằng K cho cân bằng này được gọi là tỉ lệ phân bố hay hằng

số phân bố (partition coefficient) và được tính như sau:

Với CS : nồng độ cấu tử trong pha tĩnh

CM : nồng độ cấu tử trong pha động

Hệ số K tùy thuộc vào bản chất pha tĩnh, pha động và chất phân tích

1.4.2.2 Thời gian lưu

tR: thời gian lưu của một cấu tử từ khi vào cột đến khi tách ra ngồi cột

tO: thời gian để cho chất nào đó không có ái lực với pha tĩnh đi qua cột;

đó cũng là thời gian pha động đi từ đầu cột đến cuối cột và còn gọi là thời gian lưu chết

tR': thời gian lưu thật của một cấu tử

Thời gian lưu của cấu tử phân tích

1.4.2.3 Hệ số dung lượng k’

k’ được định nghĩa theo công thức sau:

Với VS: thể tích pha tĩnh

VM: thể tích pha động

Nếu k’~ 0, tR~ tO: chất ra rất nhanh, cột không có khả năng giữ chất lại Nếu k’ càng lớn (tR càng lớn): hay trong cột càng lâu, thời gian phân tích càng lâu, đỉnh pic có khả năng bị tù

Khoảng k’ lý tưởng là 2-5, nhưng khi phân tích một hỗn hợp phức tạp, k’

có thể chấp nhận trong khoảng rộng 1-20

1.4.2.4 Hiệu năng

Hiệu năng hay số đĩa lý thuyết N của cột đặc trưng cho khả năng tách mũi sắc ký của các cấu tử trên cột N càng lớn, hiệu năng tách càng cao

Số đĩa lý thuyết có thể đo trên sắc ký đồ Người ta chứng minh được:

Với W1/2 là chiều rộng mũi sắc ký ở vị trí ½ chiều cao mũi (phút)

W là chiều rộng mũi sắc ký ở vị trí đáy mũi (phút)

1.4.2.5 Độ chọn lọc

Đặc trưng cho khả năng tách hai chất của cột

Trong đó: α: là độ chọn lọc

k1’: hệ số dung lượng của chất thứ nhất

k2’: hệ số dung lượng của chất thứ hai

1.4.2.6 Độ phân giải

Đây là đại lượng biểu thị rõ cả ba khả năng của cột sắc ký: sự giải hấp,

sự chọn lọc và hiệu quả tách Nó được xác định qua phương trình sau:

Trong đó: tR1: thời gian lưu chất thứ nhất

tR2: thời gian lưu của chất thứ hai

R: độ phân giải

k’: Hiệu độ phân giải của hai chất

1.4.3 Kết quả xác định một số chất theo phương pháp HPLC

Ở nước ta, phương pháp HPLC được ứng dụng nhiều trong phân tích các chế phẩm về dược cũng như hỗn hợp các chất vô cơ, hữu cơ Các kết quả đều

cho thấy phương pháp có độ tin cậy cao

Phương pháp định lượng đồng thời paracetamol và axit mefenamic: phương pháp có độ chính xác cao (sai số tương đối 0,51% - 1,42%), độ đúng tốt (tỷ lệ thu hồi 98,16% - 99,16%)[15]

Hình 1.1 Phòng máy HPLC Hitachi L-2000

Phương pháp định tính và định lượng đồng thời paracetamol và ibuprofen: phương pháp có độ lặp lại tốt (sai số tương đối 0,81% - 1,03%), độ đúng cao (tỷ lệ thu hồi 98,0% - 98,4%) Phương pháp định lượng đồng thời paracetamol và cafein: phương pháp có độ lặp lại tốt (sai số tương đối 0,54% - 1,07%), độ đúng cao (tỷ lệ thu hồi 98,9% - 99,5%) [15]

Phương pháp định lượng đồng thời paracetamol, phenylpropanolamin hidroclorit và clorphenylamin maleat: phương pháp có độ lặp lại cao (sai số tương đối của paracetamol là 0,47%; phenylpropanolamin hidroclorid là 0,67%

và clorphenylamin maleat là 1,19%), độ đúng cao (tỷ lệ thu hồi 99,61% - 100,65%) [15]

Chương 2 THỰC NGHIỆM 2.1 Nội dung nghiên cứu

Áp dụng phương pháp HPLC và phương pháp quang phổ hấp thụ phân

tử để xây dựng quy trình xác định đồng thời PRC và CFI trong thuốc PANADOL extra và HAPACOL extra trên thị trường

Khảo sát để lựa chọn các điều kiện sắc ký:

- Bước sóng thích hợp để phát hiện đồng thời 2 chất

- Pha động: thành phần, tỷ lệ pha động, tốc độ dòng

Đánh giá quy trình sắc ký đã xây dựng được:

- Khảo sát tính thích hợp của hệ thống

- Khảo sát khoảng tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của các chất

- Khảo sát độ chính xác của phương pháp

- Khảo sát độ đúng của phương pháp

Xác định đồng thời PRC và CFI trong thuốc PANADOL extra và

HAPACOL extra theo phương pháp HPLC

2.1.2 Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử

- Vì PRC và CFI là những chất không màu nên tiến hành kiểm tra trên toàn phổ từ 200 nm đến 300 nm để xác định bước sóng hấp thụ

PRC và CFI

- Tiến hành kiểm tra sơ bộ phổ hấp thụ phân tử của PRC và CFI

trong các dung môi có pH = 1 đến 3

đo quang

- Kiểm tra sự ổn định độ hấp thụ quang của PRC và CFI

- Khảo sát khoảng tuyến tính của PRC và CFI từ đó xác định giới hạn

phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

- Sử dụng chương trình lọc Kalman để xác định đồng thời PRC và CFI trong hỗn hợp

2.3 Đánh giá độ tin cậy của quy trình phân tích

2.3.1 Giới hạn phát hiện (LOD)

LOD được coi là nồng độ thấp nhất của chất nghiên cứu mà hệ thống phân tích cho tín hiệu phát hiện phân biệt với tín hiệu nền Trong phân tích trắc

LOD = 3.SD

B (2.1) Trong đó:

SD: độ lệch chuẩn của tín hiệu y trên đường chuẩn

B: độ dốc của đường chuẩn chính là độ nhạy của phương pháp trắc quang

2.3.2 Giới hạn định lượng (LOQ)

với tín hiệu nền và đạt độ tin cậy tối thiểu 95%, thông thường người ta sử dụng công thức:

CTinh toan (µg/mL) là nồng độ tính toán được

- Đánh giá

: