xác định đồng thời paracetamol, cafein và phenobarbital trong thuốc thần kinh d3 bằng phường pháp quang phổ hấp thụ phân tử (uv - vis) và phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (hplc)

Phương pháp Vierordt Để xác định nồng độ của các cấu tử trong hỗn hợp, lần đầu tiên Vierordt đã đo độ hấp thụ quang của dung dịch hỗn hợp ở các bước sóng khác nhau, sau đó thiết lập hệ

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

TRƯƠNG XUÂN HIẾU

XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI PARACETAMOL, CAFEIN VÀ PHENOBARBITAL TRONG THUỐC THẦN KINH D3 BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HẤP THỤ PHÂN TỬ (UV-Vis)

VÀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC).

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC VẬT CHẤT

THÁI NGUYÊN - NĂM 2014

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

TRƯƠNG XUÂN HIẾU

XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI PARACETAMOL, CAFEIN VÀ PHENOBARBITAL TRONG THUỐC THẦN KINH D3 BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HẤP THỤ PHÂN TỬ (UV-Vis)

VÀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới các thầy cô giáo, người đã đem lại cho tôi những kiến thức bổ trợ vô cùng có ích trong những năm học vừa qua

Xin gửi lời cám ơn chân thành tới Ban giám hiệu, phòng Đào tạo, Khoa Hoá học và các cán bộ phòng thí nghiệm Khoa Hoá học Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên, đã tạo điều kiện cho tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thiện luận văn

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè, đồng nghiệp những người đã luôn bên tôi, động viên và khuyến khích tôi trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu của mình

Tôi xin chân thành cảm ơn !

Thái Nguyên, tháng 8 năm 2014 Tác giả

Trương Xuân Hiếu

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan: đề tài "Xác định đồng thời paracetamol, cafein và

phenobarbital trong thuốc thần kinh D3 theo phương pháp quang phổ hấp thụ phân

tử (UV-Vis) và phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) " là do bản thân tôi

thực hiện Các số liệu, kết quả trong đề tài là trung thực Nếu sai sự thật tôi xin chịu trách nhiệm

Thái nguyên, tháng 08 năm 2014

Tác giả luận văn

Trương Xuân Hiếu

XÁC NHẬN CỦA KHOA HOÁ HỌC

TRƯỜNG ĐHSP- ĐHTN

XÁC NHẬN

CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

TS Mai Xuân Trường

MỤC LỤC

Lời cảm ơn i

Lời cam đoan ii

Mục lục iii

Danh mục các từ viết tắt iv

Danh mục các bảng v

Danh mục các hình vi

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 Tổng quan về paracetamol, cafein và phenobarbital 2

1.1.1 Paracetamol 2

1.1.2 Cafein 5

1.1.3 Phenobarbital 9

1.2 Các định luật cơ sở của sự hấp thụ ánh sáng 12

1.2.1 Định luật Bughe - Lămbe – Bia 12

1.2.2 Định luật cộng tính 13

1.2.3 Những nguyên nhân làm cho sự hấp thụ ánh sáng của dung dịch không tuân theo định luật Bughe – Lămbe – Bia 13

1.3 Một số phương pháp xác định đồng thời các cấu tử 15

1.3.1 Phương pháp Vierordt 15

1.3.2 Phương pháp phổ đạo hàm 16

1.3.3 Phương pháp mạng nơron nhân tạo 18

1.3.4 Phương pháp lọc Kalman 20

1.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC 20

1.4.1 Nguyên tắc của phương pháp HPLC 21

1.4.2 Sơ đồ máy HPLC 22

1.4.3 Kết quả xác định một số chất theo phương pháp HPLC 22

Chương 2: THỰC NGHIỆM 24

2.1 Nội dung nghiên cứu 24

2.1.1 Phương pháp HPLC 24

2.1.2 Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử 24

2.2 Phương pháp nghiên cứu 25

2.2.1 Phương pháp nghiên cứu lý thuyết 25

2.2.2 Phương pháp thực nghiệm 25

2.3 Đánh giá độ tin cậy của quy trình phân tích 26

2.3.1 Giới hạn phát hiện (LOD) 26

2.3.2 Giới hạn định lượng (LOQ) 26

2.3.3 Đánh giá độ tin cậy của phương pháp 26

2.3.4 Đánh giá kết quả phép phân tích theo thống kê 27

2.4 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 28

2.4.1 Thiết bị 28

2.4.2 Dụng cụ 28

2.4.3 Hóa chất 28

2.4.4 Chế phẩm thần kinh D3 29

2.5 Chuẩn bị các dung môi để hòa tan mẫu 29

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 31

3.1 Xác định đồng thời paracetamol, cafein và phenobarbital theo phương pháp HPLC 31

3.1.1 Xây dựng điều kiện để xác định đồng thời 3 chất paracetamol, cafein và phenobarbital 31

3.1.2 Đánh giá phương pháp định lượng 34

3.1.3 Khảo sát độ đúng của phép xác định PRC, CFI và PNB theo phương pháp thêm chuẩn 41

3.2 Xác định đồng thời paracetamol, cafein và phenobarbital theo phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử 43

3.2.2 Khảo sát sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của PRC, CFI và PNB vào pH443.2.3 Khảo sát sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của PRC, CFI và PNB theo thời gian 453.2.4 Khảo sát sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của PRC, CFI và PNB theo nhiệt độ 463.2.5 Khảo sát khoảng tuyến tính tuân theo định luật Bughe – Lambe – Bia của PRC, CFI và PNB Xác định chỉ số LOD và LOQ 483.2.6 Khảo sát và đánh giá độ tin cậy của phương pháp nghiên cứu trên các mẫu tự pha 543.2.7 Xác định hàm lượng PRC, CFI và PNB trong thuốc thần kinh D3 và đánh giá độ đúng của phép phân tích theo phương pháp thêm chuẩn 61

KẾT LUẬN 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO 69

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu

năng cao

High Performance Liquid

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Giá trị các đại lượng đặc trưng của PRC, CFI và PNB 36

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát thời gian lưu của PRC, CFI và PNB 36

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát diện tích pic của PRC, CFI và PNB 36

Bảng 3.4 Mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của PRC, CFI và PNB 37 Bảng 3.5 Kết quả khảo sát độ lặp lại 40

Bảng 3.6 Kết quả phân tích thuốc thần kinh D3 41

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát độ đúng 42

Bảng 3.8 Độ hấp thụ quang của PRC, CFI và PNB ở các giá trị pH 44

Bảng 3.9 Sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của PRC, CFI và PNB theo thời gian 45

Bảng 3.10 Sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của PRC, CFI và PNB theo nhiệt độ 47

Bảng 3.11 Độ hấp thụ quang của dung dịch PRC ở các giá trị nồng độ 48

Bảng 3.12 Kết quả xác định LOD và LOQ của PRC 50

Bảng 3.13 Sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của CFI theo nồng độ 51

Bảng 3.14 Kết quả tính LOD và LOQ của CFI 52

Bảng 3.15 Sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của PNB theo nồng độ 53

Bảng 3.16 Kết quả tính LOD và LOQ của PNB 54

Bảng 3.17 Pha chế các dung dịch hỗn hợp PRC và CFI 54

Bảng 3.18 Kết quả tính nồng độ, sai số của PRC và CFI trong hỗn hợp 55

Bảng 3.19 Pha chế các dung dịch hỗn hợp PRC và PNB 56

Bảng 3.20 Kết quả tính nồng độ, sai số của PRC và PNB trong hỗn hợp 57

Bảng 3.21 Pha chế các dung dịch hỗn hợp CFI và PNB 58

Bảng 3.22 Kết quả tính nồng độ, sai số của CFI và PNB trong hỗn hợp 58

Bảng 3.23 Pha các dung dịch chuẩn PRC, CFI, PNB và hỗn hợp 59

Bảng 3.24 Kết quả tính nồng độ, sai số của PRC, CFI và PNB 60

Bảng 3.25 Kết quả tính nồng độ, sai số PRC, CFI và PNB trong mẫu thuốc thần kinh D3 62Bảng 3.26 Thành phần các dung dịch chuẩn PRC, CFI và PNB thêm vào dung

dịch mẫu thuốc thần kinh D3 Error! Bookmark not defined

Bảng 3.27 Kết quả xác định độ thu hồi của PRC, CFI và PNB trong mẫu thuốc thần kinh D3 64

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của paracetamol 2

Hình 1.2: Công thức cấu tạo của cafein 6

Hình 1.3: Công thức cấu tạo phenobarbital 9

Hình 1.4 Mô hình hoạt động của mạng nơron 19

Hình 1.5 Sơ đồ hệ thống máy HPLC 22

Hình 3.1 Phổ pic của PRC (500 µg/mL) 32

Hình 3.2 Phổ pic của CFI (20 µg/mL) 33

Hình 3.3 Phổ pic của PNB (7,5 µg/mL) 33

Hình 3.4 Phổ các pic của PRC (1), CFI (2) và PNB (3) 34

Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của PRC 38

Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của CFI 38

Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic PNB 39

Hình 3.8 Phổ hấp thụ của các dung dịch chuẩn PRC(1), CFI(2) và PNB(3) 46

Hình 3.9 Sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của PRC, CFI và PNB theo thời gian 46

Hình 3.10 Sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của PRC, CFI và PNB theo nhiệt độ 47

Hình 3.11 Phổ hấp thụ quang của PRC ở các nồng độ 0,2  40,0 g/mL 48

Hình 3.12 Đường hồi quy tuyến tính biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ quang A vào nồng độ của PRC 49

Hình 3.13 Phổ hấp thụ quang của CFI ở các nồng độ 0,2  40 g/mL 50

Hình 3.14 Đường hồi quy tuyến tính biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ quang A vào nồng độ CFI 51

Hình 3.15 Phổ hấp thụ quang của PNB ở các nồng độ 1,0  40,0 g/mL 52

Hình 3.16 Đường hồi quy tuyến tính biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ quang A vào nồng độ PNB 53

MỞ ĐẦU

Trong sự phát triển của khoa học công nghệ thì tính chính xác của một đối tượng nghiên cứu ngày càng thể hiện được tầm quan trọng, nhất là trong lĩnh vực dược học, một lĩnh vực có liên quan trực tiếp tới tính mạng con người Ngày nay công nghệ sản xuất dược phẩm ngày càng phát triển nhanh chóng, các nhà sản xuất dược phẩm đã và đang áp dụng những phương thức sản xuất

và chế biến tiên tiến, sản xuất ra ngày càng nhiều loại dược phẩm với nhiều tính năng vượt trội được tổng hợp, chiết xuất từ rất nhiều thành phần khác nhau Do đó việc đánh giá đúng chất lượng sản phẩm một cách nhanh chóng, chính xác, an toàn và hiệu quả thì công tác kiểm nghiệm để xác định các thành phần của thuốc bằng các phương pháp hiện đại có độ chính xác cao ngày càng được quan tâm Nhiều phương pháp có độ lặp và độ chính xác cao đã được ứng dụng như phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS), quang phổ hấp thụ phân tử (UV-Vis) Tuy nhiên các phương pháp mới chỉ định lượng một đến hai thành phần của thuốc Chính vì thế việc định lượng đồng thời các chất mà không phải tách riêng từng chất ra khỏi hỗn hợp là một phương pháp đang rất được quan tâm hiện nay

Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi chọn đề tài: "Định lượng đồng thời paracetamol, cafein, phenobarbital trong thuốc thần kinh D3 bằng phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử (UV-Vis) và phương pháp sắc

ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)”

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về paracetamol, cafein và phenobarbital

1.1.1 Paracetamol

1.1.1.1 Giới thiệu chung

Paracetamol hay acetaminophen (tên được chấp nhận tại Hoa Kỳ) là thuốc có tác dụng hạ sốt và giảm đau, tuy nhiên không như aspirin nó không

hoặc ít có tác dụng chống viêm So với các thuốc chống viêm không steroit

(nonsteroidal antiinflammatory drugs - NSAIDs), paracetamol có rất ít tác dụng phụ với liều điều trị nên được cung cấp không cần kê đơn ở hầu hết các nước

- Tên quốc tế: Paracetamol

- Tên khác: Acetaminophen

- Mã ATC (mã giải phẫu - điều trị - hóa học): NO2B EO1

- Biệt dược: Panadol, Pradon, Efferalgan, Pandol

- Công thức phân tử: C8H9O2N

- Khối lượng mol phân tử: 151,17g/mol

- Công thức cấu tạo:

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của paracetamol

- Tên IUPAC: N-(4-hydroxyphenyl) acetamit hoặc p-hydroxy acetanilit hoặc 4-hydroxy acetanilit

- Tên gọi paracetamol được lấy từ tên hóa học của hợp chất para- acetyl aminophenol [3,4]

1.1.1.2 Tính chất

Tính chất vật lý

- Paracetamol là chất bột kết tinh màu trắng, không mùi, vị đắng nhẹ

- Khối lượng riêng: 1,263 g/cm3

Nhóm - OH làm cho chế phẩm có tính axit và khi tác dụng với dung dịch muối sắt (III) cho màu tím

Đun nóng với dung dịch HCl thì bị thủy phân, thêm nước thì không có kết tủa vì p-aminophenol tạo thành tan trong axit Thêm thuốc thử kali dicromat thì có kết tủa màu tím khác với phenacetin là không chuyển sang đỏ

Quá trình xảy ra chủ yếu là:

K2Cr2O7

Đun nóng dung dịch trên với axit sunfuric có mùi axit axetic có thể dùng phản ứng này để định tính và định lượng PRC

1.1.1.3 Dược lý cơ chế tác dụng

Paracetamol là chất chuyển hóa có hoạt tính của phenacetin, là thuốc giảm đau - hạ sốt hữu hiệu có thể thay thế aspirin; tuy vậy, khác với aspirin, paracetamol không có hiệu quả điều trị viêm Với liều ngang nhau tính theo gam, paracetamol có tác dụng giảm đau và hạ sốt tương tự như aspirin Paracetamol làm giảm thân nhiệt ở người bệnh sốt, nhưng hiếm khi làm giảm thân nhiệt ở người bình thường Thuốc tác động lên vùng dưới đồi gây hạ nhiệt, tỏa nhiệt tăng do giãn mạch và tăng lưu lượng máu ngoại biên

Paracetamol với liều điều trị, ít tác động đến hệ tim mạch và hô hấp, không làm thay đổi cân bằng axit - bazơ, không gây kích ứng, xước hoặc chảy máu dạ dày như khi dùng salixylat, vì paracetamol không tác dụng trên xyclooxygenat (C OX) toàn thân, chỉ tác động đến xyclooxygenat prostaglandin của hệ thần kinh trung ương Paracetamol không có tác dụng trên tiểu cầu hoặc thời gian chảy máu

Khi dùng quá liều paracetamol, một chất chuyển hóa là benzoquinonimin gây độc nặng cho gan Liều bình thường, paracetamol dung nạp tốt, không có nhiều tác dụng phụ như aspirin Tuy vậy, quá liều cấp tính (trên 10g) làm thương tổn gan gây chết người, những vụ ngộ độc và tự tử bằng paracetamol đã tăng lên một cách đáng lo ngại trong những năm gần đây

N-axetyl-Paracetamol hấp thu nhanh qua ống tiêu hóa, sinh khả dụng là 80-90%, hầu như không gắn vào protein huyết tương Chuyển hóa lớn ở gan và một phần nhỏ ở thận, cho các dẫn xuất glucuro thải trừ qua thận

Cũng như các thuốc chống viêm không chứa steroit khác, paracetamol

có tác dụng hạ sốt và giảm đau, tuy nhiên lại không có tác dụng chống viêm

và thải trừ axit uric, không kích ứng tiêu hóa, không ảnh hưởng đến tiểu cầu

và đông máu

Uống paracetamol liều cao dài ngày có thể làm tăng nhẹ tác dụng chống đông của coumarin và dẫn chất indandion

Cần phải chú ý đến khả năng gây hạ sốt nghiêm trọng ở người bệnh dùng đồng thời phenothiazin và liệu pháp hạ nhiệt

Ở liều thông thường, paracetamol không gây kích ứng niêm mạc dạ dày, không ảnh hưởng đông máu, không ảnh hưởng chức năng thận Tuy nhiên, một

số nghiên cứu cho biết dùng paracetamol liều cao (trên 2000 mg/ngày) có thể làm tăng nguy cơ biến chứng dạ dày

Đôi khi xảy ra ban da và những phản ứng dị ứng khác Thường là ban đỏ hoặc ban mề đay, nặng hơn có thể kèm theo sốt do thuốc và thương tổn niêm mạc Người bệnh mẫn cảm với salixylat hiếm khi mẫn cảm với paracetamol và những thuốc có liên quan

Ở một số ít trường hợp riêng lẻ, paracetamol đã gây giảm bạch cầu trung tính, giảm tiểu cầu và giảm toàn thể huyết cầu

1.1.1.4 Dạng thuốc

- Chế phẩm viên nén: Paracetamol, Panadol, Donodol…

- Chế phẩm viên đạn: Efferalgan, Panadol…

- Chế phẩm viên sủi: Efferalgan, Donodol, Panadol…

1.1.2.1 Giới thiệu chung

Cafein (CFI) là một hợp chất tự nhiên được tìm thấy trong lá, hạt và trái cây của trên 63 loại nông sản tự nhiên và là một phần của một số nhóm các hợp chất được biết đến như metylxathin Cafein là một chất gây nghiện chủ động và

thích thần kinh ôn hoà và được bài tiết ra ngoài trong vài giờ sau khi được hấp thụ vào cơ thể

- Tên quốc tế: Cafein

- Một số tên khác: Trimethylxanthine, Coffeine, Theine, Mateine, Guaranine, Methyltheobromine hay 1,3,7-trimethylxanthine

- Công thức phân tử: C8H10N4O2

- Khối lượng mol phân tử: 194,19 (g/mol)

- Công thức cấu tạo:

Hình 1.2: Công thức cấu tạo của cafein

- Tên IUPAC: 1,3,7-trimethylxanthine [1]

Cafein tan trong các dung dịch axit và trong các dung dịch đậm đặc của benzoat hay salixylat kiềm

Dung dịch cafein trong nước có phản ứng trung tính với giấy quỳ

Cafein rất giống 2 hợp chất sau:

- Theophylin: chất được sử dụng để điều trị bệnh suyễn

- Theobromin: thành phần chính của ca cao [ 2,22]

Với dung dịch iot chỉ kết tủa khi môi trường là axit

Cho kết tủa với dung dịch tanin nhưng kết tủa tan trong thuốc thử

Để định lượng cafein người ta sử dụng các phương pháp sau:

- Phương pháp chuẩn độ trong môi trường khan: hòa chế phẩm vào axit axetic khan và benzen Chuẩn độ bằng dung dịch axit pecloric 0,1N với chỉ thị tím tinh thể (đến màu vàng) hoặc xác định điểm kết thúc bằng đo thế

- Phương pháp chuẩn độ iot: trong môi trường axit sunfuric, cafein cho kết tủa peiodit [C8H10N2.HI.I4] với dung dịch iot (cho dư) Lọc bỏ kết tủa, định lượng iot dư bằng dung dịch natrithiosunfat chuẩn

- Phương pháp khối lượng: định lượng cafein trong dung dịch tiêm cafein (có natribenzoat) bằng cách kiềm hóa dung dịch, chiết bằng clorofom, bốc hơi dung môi rồi cân cặn

Công dụng:

Cafein có tác dụng kích thích hoạt động hệ thần kinh trung ương chọn lọc trên vỏ não, làm tăng khả năng nhận thức, tăng khả năng làm việc trí óc, làm giảm cảm giác mệt mỏi, buồn ngủ Thuốc có tác dụng kích thích, liều cao

làm tim đập nhanh, co bóp mạnh, tăng lưu lượng máu qua tim Thuốc có tác dụng lợi tiểu nhưng kém theophyllin và theobromin

Ảnh hưởng của cafein: cafein khi dùng với liều lượng nhiều sẽ gây ra các

ảnh hưởng như căng thẳng thần kinh, hưng phấn, tăng huyết áp, giãn nở phế quản, lợi tiểu (từ 300mg/ngày trở lên), kích thích nhu động ruột, mất ngủ

Tổ chức y tế thế giới (WHO) không xếp cafein vào nhóm các chất gây nghiện Đến nay vẫn không có dấu hiệu gì rõ ràng chứng minh cafein nguy hại đến sức khỏe, ngay cả những trường hợp sử dụng thường xuyên cafein trong thời gian dài Tuy nhiên việc dùng cafein nhiều có thể dẫn tới sự phụ thuộc về tâm lý, trong trường hợp này mùi vị cà phê, khẩu vị người uống và truyền thống cũng đóng một vai trò quan trọng

Sự phụ thuộc vào cafein có thể dẫn tới các biểu hiện như nhức đầu căng thẳng, run rẩy, hồi hộp, thiếu tập trung, cáu giận, cơ thể cần khoảng 3 ngày để loại bỏ cafein, sau thời gian này những tác dụng phụ sẽ hoàn toàn mất đi Nếu dùng cafein với liều lượng cao có thể làm tăng nhịp tim và lợi tiểu Tuy vậy nếu uống những loại đồ uống chậm giải phóng cafein như guarana hay chè đen thì có thể hạn chế được các ảnh hưởng tiêu cực của cafein cũng như tận dụng được các tác dụng của nó

1.1.2.4 Dược lý cơ chế tác động

Cafein gây ra sự hưng phấn và kéo dài thời gian tỉnh táo bằng cách ngăn cản hoạt động bình thường của adenosine và photphodiesterat

Adenosine được tạo ra trong quá trình hoạt động của cơ thể Khi nồng độ

đủ cao, nó sẽ gắn với receptor (thụ thể) làm cho hệ thần kinh phát ra tín hiệu nghỉ ngơi dẫn đến sự mệt mỏi và buồn ngủ do có cấu trúc phân tử gần giống nhau, cafein cạnh tranh với adenosine trong việc liên kết với receptor đặc hiệu, điều này làm hệ thần kinh sẽ chỉ đạo cho cơ thể tiếp tục làm việc thay vì phát ra tín hiệu nghỉ ngơi

Cafein cũng ngăn chặn photphodiesterat không cho tổng hợp chất truyền tin thứ cấp

1.1.3.1 Giới thiệu chung

Phenobarbital (PNB) có tác dụng ức chế thần kinh trung ương, an thần (ở liều thấp), thuốc làm giảm lo lắng, bồn chồn

Tên khoa học: 5 - ethyl-5-phenyl-lH,3H,5H- pyrimidin- 2,4,6- trion Tên khác: Phenobarbitone, Phenemalum

Tên tiếng anh: Phenobarbital

Công thức cấu tạo:

Hình 1.3: Công thức cấu tạo Phenobarbital

Nhiệt độ nóng chảy: 176°c

1.1.3.3 Dược lý và cơ chế tác dụng

Trên thần kinh trung ương, Phenobarbital có tác dụng ức chế thần kinh trung ương An thần (ở liều thấp): thuốc làm giảm lo lắng, bồn chồn, tạo cảm giác thoải mái, dễ chịu, dễ đi vào giấc ngủ

Chỉ định: Các trạng thái thần kinh bị lo âu, căng thẳng (ở liều thấp) Phenobarbital là thuốc chống co giật thuộc nhóm các barbiturat Phenobarbital và các barbiturat khác có tác dụng tăng cường hoặc bắt chước tác dụng ức chế synap của gama aminobutyric (GABA) ở não; điều này cho thấy chúng có những điểm tương đồng với các benzodiazepin Tuy nhiên, các barbiturat khác với các benzodiazepin ở tính chọn lọc kém hơn; với các barbiturat, ngoài tác dụng ức chế chọn lọc lên synap, chỉ cần tăng liều nhẹ cũng gây ức chế không chọn lọc Phenobarbital và các barbiturat khác làm giảm sử dụng oxygen ở não trong lúc gây mê, có lẽ chủ yếu thông qua việc ức chế hoạt động của neuron Các tác dụng này là cơ sở của việc sử dụng các barbiturat để

đề phòng nhồi máu não khi não bị thiếu máu cục bộ và khi tổn thương sọ não

Các barbiturat ức chế có hồi phục hoạt động của tất cả các mô Tuy vậy, với cùng một nồng độ trong huyết tương hay với các liều tương đương, không phải tất cả các mô đều bị ảnh hưởng như nhau Hệ thần kinh trung ương nhạy cảm với các barbiturat hơn rất nhiều; liều thuốc gây ngủ và an thần chỉ có tác dụng không đáng kể lên cơ xương, cơ tim và cơ trơn Phenobarbital ức chế hệ thần kinh trung ương ở mọi mức độ, từ an thần đến gây mê Thuốc chỉ ức chế

tạm thời các đáp ứng đơn synap ở hệ thần kinh trung ương, nhưng sự hồi phục của synap bị chậm lại và có sự giảm trở kháng sau synap ở một số synap, các đáp ứng đa synap bị ảnh hưởng nhiều hơn; điều này giải thích vì sao tác dụng chống co giật và tác dụng ức chế của thuốc lại kéo dài

Phenobarbital chủ yếu được dùng để chống co giật, tuy vậy thuốc vẫn còn phần nào được dùng để điều trị hội chứng cai rượu Tác dụng chống co giật của thuốc tương đối không chọn lọc; thuốc hạn chế cơn động kinh lan tỏa và làm tăng ngưỡng động kinh Thuốc chủ yếu được chỉ định trong cơn động kinh toàn bộ (cơn lớn), và động kinh cục bộ (cục bộ vận động hoặc cảm giác)

Phenobarbital làm giảm nồng độ bilirubin huyết thanh ở trẻ sơ sinh, ở người bệnh tăng bilirubin huyết không liên hợp, không tan huyết bẩm sinh và ở người bệnh ứ mật trong gan, có thể do cảm ứng glucuronyl transferase, một enzym liên hợp bilirubin

Thuốc uống được hấp thu chậm ở ống tiêu hóa (80%), thuốc gắn vào protein huyết tương (ở trẻ nhỏ 60%, ở người lớn 50%) và được phân bố khắp các mô, nhất là ở não, do thuốc dễ tan trong mỡ Thể tích phân bố là 0,5 - 1 lít/kg Nồng độ đỉnh trong huyết tương đạt sau khi uống 8 - 12 giờ ở người lớn, sau 4 giờ ở trẻ em và nồng độ đỉnh trong não đạt sau 10 - 15 giờ Nửa đời của thuốc trong huyết tương dài (2 - 6 ngày) và thay đổi theo tuổi: Trẻ em từ 1 đến

10 tuổi đào thải phenobarbital nhanh hơn nhiều so với người lớn (40 - 50 giờ ở trẻ em; 84 - 160 giờ ở người lớn) còn ở người bệnh bị suy gan hoặc suy thận thì dài hơn rất nhiều Phải sau 15 - 21 ngày mới đạt trạng thái cân bằng động của thuốc Thuốc đặt hậu môn hầu như được hấp thu hoàn toàn ở ruột già

Nếu tiêm tĩnh mạch, tác dụng của thuốc xuất hiện trong vòng 5 phút

và đạt mức tối đa trong vòng 30 phút Tiêm bắp thịt, tác dụng xuất hiện chậm hơn một chút Dùng theo đường tiêm, phenobarbital có tác dụng kéo dài từ 4 đến 6 giờ

Phenobarbital được hydroxyl hóa và liên hợp hóa ở gan Thuốc đào thải chủ yếu theo nước tiểu dưới dạng các chất chuyển hóa không có hoạt tính (70%) và dạng thuốc nguyên vẹn (30%); một phần nhỏ vào mật và đào thải theo phân Phenobarbital là chất cảm ứng xytochrom P450 mạnh nên có ảnh hưởng đến chuyển hóa của các thuốc được chuyển hóa ở gan thông qua xytochrom P450 [20]

1.1.3.4 Dạng thuốc

- Chế phẩm viên nén: thần kinh D3, hỗn hợp thần kinh HT3…

- Chế phẩm gói bột: Gardenal, Luminal

- Chế phẩm dạng bột tiêm: Phenobarbital

- Chế phẩm dạng dung dịch uống

- Các chế phẩm kết hợp với các thuốc khác

1.2 Các định luật cơ sở của sự hấp thụ ánh sáng

1.2.1 Định luật Bughe - Lămbe – Bia

Khi chiếu một chùm tia sáng có năng lượng nhất định vào một dung dịch chứa cấu tử hấp thụ ánh sáng thì cấu tử đó sẽ hấp thụ chọn lọc một số tia sáng

Độ hấp thụ quang của cấu tử tỷ lệ thuận với nồng độ của chất trong dung dịch

và bề dày lớp dung dịch mà ánh sáng truyền qua

Phương trình toán học biểu diễn định luật Bughe - Lămbe - Bia

C: nồng độ của cấu tử trong dung dịch (mol/lít)

Định luật Bughe – Lămbe – Bia là sự tổ hợp của hai định luật thứ nhất và thứ hai của sự hấp thụ ánh sáng

1.2.2 Định luật cộng tính

Định luật cộng tính là một sự bổ sung quan trọng cho các định luật hấp thụ ánh sáng vừa xét Định luật cộng tính là cơ sở định lượng cho việc xác định nồng độ của hệ trắc quang nhiều cấu tử

Bản chất của định luật cộng tính là sự độc lập của đại lượng độ hấp thụ quang của một chất riêng biệt khi có mặt của các chất khác có sự hấp thụ ánh sáng riêng

Biểu diễn tính cộng tính về độ hấp thụ quang của dung dịch hỗn hợp chứa n cấu tử tại bước sóng  bằng phương trình toán học:

1.2.3 Những nguyên nhân làm cho sự hấp thụ ánh sáng của dung dịch không tuân theo định luật Bughe – Lămbe – Bia

Xuất phát từ biểu thức của định luật Bughe – Lămbe – Bia A= f(, b, C) nghĩa là độ hấp thụ quang A là hàm số của ba biến:  (bước sóng của chùm sáng chiếu qua dung dịch), b (bề dày lớp dung dịch) và C (nồng độ chất: mol/lít) Do đó

mọi sự sai lệch của các tham số này đều có thể đưa đến làm sai lệch quy luật hấp thụ quang, gây sai số cho phép đo độ hấp thụ quang của chất, bao gồm:

- Chùm sáng chiếu qua dung dịch không hoàn toàn đơn sắc

- Các điều kiện đo quang như: bề dày cuvet, độ trong suốt của bề mặt cuvet không thật đồng nhất, bề mặt cuvet gây các hiện tượng quang học phụ như tán xạ, hấp thụ

- Sự có mặt của các chất điện giải lạ trong dung dịch màu làm biến dạng các phần tử hoặc các ion phức màu làm ảnh hưởng đến sự hấp thụ ánh sáng của các tiểu phân hấp thụ ánh sáng

- Hiệu ứng solvat hóa: sự solvat hóa (hay hydrat hóa) làm giảm nồng độ các phần tử dung môi tự do, do đó làm thay đổi nồng độ của dung dịch màu và làm ảnh hưởng đến sự hấp thụ ánh sáng của dung dịch màu

- Hiệu ứng liên hợp: trong một số trường hợp có sự tương tác của chính các tiểu phân hấp thụ ánh sáng để tạo ra các tiểu phân polime làm thay đổi nồng độ hợp chất màu

- Ảnh hưởng pH của dung dịch: sự thay đổi nồng độ của ion H+ (tức thay đổi pH) của dung dịch sẽ ảnh hưởng đến sự tuân theo định luật Bughe – Lămbe – Bia theo các trường hợp sau:

+ Thuốc thử có đặc tính axit: sự thay đổi nồng độ ion H+ làm chuyển dịch cân bằng tạo thành chất màu

+ Thay đổi pH kéo theo sự thay đổi thành phần hợp chất màu

+ Khi tăng pH phức màu có thể bị phân hủy do sự tạo thành phức hydroxo + Dưới ảnh hưởng của ion H+ trạng thái tồn tại và màu của dung dịch cũng thay đổi

- Ảnh hưởng của sự pha loãng dung dịch phức màu: khi pha loãng các dung dịch phức màu sẽ gây ra sự lệch khỏi định luật Bughe – Lămbe – Bia

- Nhiệt độ môi trường và dung dịch đo phổ trong cuvet là không hằng định suốt trong thời gian đo Vì trong một mức độ nhất định độ hấp thụ quang

A phụ thuộc vào nhiệt độ

1.3 Một số phương pháp xác định đồng thời các cấu tử

1.3.1 Phương pháp Vierordt

Để xác định nồng độ của các cấu tử trong hỗn hợp, lần đầu tiên Vierordt đã

đo độ hấp thụ quang của dung dịch hỗn hợp ở các bước sóng khác nhau, sau đó thiết lập hệ phương trình bậc nhất mà số phương trình bằng số ẩn số (số cấu tử trong hỗn hợp), giải hệ phương trình này sẽ tính được nồng độ của các cấu tử Điều kiện

để áp dụng phương pháp này là các cấu tử trong hỗn hợp phải tuân theo định luật Bughe - Lămbe - Bia và thỏa mãn tính cộng tính của độ hấp thụ quang

Với hỗn hợp chứa n cấu tử ta cần phải lập hệ n phương trình n ẩn Hệ phương trình này được thiết lập bằng cách đo độ hấp thụ quang của hỗn hợp ở

in: hệ số hấp thụ mol phân tử của cấu tử i tại bước sóng n (được xác định bằng cách đo độ hấp thụ quang của dung dịch chỉ chứa cấu tử i ở bước sóng n )

b: bề dày lớp dung dịch (cm)

Ci: nồng độ của cấu tử thứ i trong hỗn hợp (mol/lít) Với i, j = 1 n

Giải hệ n phương trình với n ẩn số là C1, C2 Cn sẽ tìm được nồng độ

tuyến tính khá đơn giản Tuy nhiên khi số cấu tử lớn thì việc giải hệ phương trình phức tạp hơn

Phương pháp Vierordt chủ yếu được vận dụng để tìm cách giải hệ phương trình như: giải bằng đồ thị, giải bằng phép ma trận vuông, phương pháp khử Gauss, để xác định nồng độ của mỗi cấu tử

Một số tác giả sử dụng phương pháp Vierordt để xác định đồng thời paracetamol và clopheninamin maleat trong thuốc viên nén bằng cách đo độ hấp thụ quang ở các bước sóng 242 và 264 nm [2]

Phương pháp Vierordt đơn giản, dễ thực hiện nhưng chỉ áp dụng được khi số cấu tử trong dung dịch hỗn hợp ít, phổ hấp thụ quang phân tử xen phủ nhau không nhiều, tính chất cộng tính độ hấp thụ quang được thoả mãn nghiêm ngặt, thiết bị đo quang tốt thì phương pháp cho kết quả khá chính xác Đối với hệ nhiều cấu tử, đặc biệt là khi phổ của các cấu tử xen phủ nhau nhiều, tính chất cộng tính độ hấp thụ quang không được thoả mãn nghiêm ngặt, thiết bị đo có độ chính xác không cao thì phương pháp không chính xác

và có sai số lớn Bởi vậy mặc dù phương pháp Vierordt tuy ra đời đã lâu, nhưng ứng dụng trong thực tế còn rất ít Tuy nhiên đây là cơ sở lý thuyết cơ bản nhất, đặt nền móng cho các nhà khoa học sau này phát triển, cải tiến để xây dựng nên các phương pháp mới

1.3.2 Phương pháp phổ đạo hàm

Độ hấp thụ quang của các cấu tử là hàm của độ dài bước sóng của ánh sáng tới A = f() Phổ đạo hàm của độ hấp thụ quang theo bước sóng  được biểu diễn bằng phương trình toán học:

Đạo hàm bậc 1 của độ hấp thụ quang:   1 , 

λ

dA

dλĐạo hàm bậc 2 của độ hấp thụ quang:     

Theo định luật Bughe - Lămbe - Bia thì:    0

λ

A = A = .C.b Với C và b là hằng số, không phụ thuộc vào bước sóng  nên:

A = a0 + a1.+ a2.2 + + ak.k (1.8) Các hệ số a0, a1 ak tại mỗi bước sóng tương ứng là các giá trị đạo hàm bậc 0, 1, 2 k Để có phổ đạo hàm đối với tập số liệu phổ bậc không, đầu tiên

ta phải sử dụng phương pháp hồi quy bình phương tối thiểu để tìm được hàm hồi quy là đa thức bậc cao Sau đó lấy đạo hàm của hàm này ta sẽ được các phổ đạo hàm

Đối với phổ đạo hàm bậc 0, 1 n ta thấy có những đặc điểm như sau: đỉnh của phổ đạo hàm bậc n là điểm uốn của phổ đạo hàm bậc (n - 1), còn tại đỉnh của phổ đạo hàm bậc (n-1) thì phổ đạo hàm bậc n có giá trị bằng 0 Số đỉnh của phổ đạo hàm bậc n nhiều hơn số đỉnh của phổ đạo hàm bậc (n - 1)

Như vậy, dùng phương pháp phổ đạo hàm ta có thể tách phổ gần trùng nhau thành những phổ mới và khi đó ta có thể chọn được những bước sóng mà

thụ, nhờ đó mà có thể xác định được từng chất trong hỗn hợp Bằng toán học, người ta xây dựng được phần mềm khi đo phổ của dung dịch hỗn hợp có thể ghi ngay được phổ đạo hàm các bậc của phổ đó Căn cứ vào các giá trị phổ đạo hàm ta lựa chọn được bước sóng xác định đối với từng cấu tử

Ở nước ta, một số tác giả đã sử dụng phương pháp phổ đạo hàm xác định đồng thời các vitamin tan trong nước [13, 14, 19] cũng như xác định đồng thời các chế phẩm dược dụng khác

Các kết quả thu được có sai số trong khoảng 1,7  5%

Trên thế giới, phương pháp phổ đạo hàm được ứng dụng để phân tích các chế phẩm dược dụng cũng như hỗn hợp các chất vô cơ, hữu cơ Hầu hết các kết quả đều cho thấy phương pháp có độ tin cậy cao Tuy nhiên phương pháp phổ đạo hàm chỉ được áp dụng khi số cấu tử trong dung dịch ít và phổ hấp thụ quang phân tử của chúng không trùng nhau

1.3.3 Phương pháp mạng nơron nhân tạo

Nguyên tắc: đặt các nơron sao cho chúng ở trong những lớp cách biệt, mỗi nơron trong một lớp được nối với tất cả các nơron khác ở lớp kế tiếp và xác định bằng những tín hiệu chỉ được truyền theo một hướng qua mạng Đó chính là mô hình mạng nơron

Quá trình vận hành mạng nơron: mỗi nơron nhận một tín hiệu từ nơron của lớp trước và mỗi tín hiệu này được nhân với hệ số riêng Những tín hiệu vào

có trọng số được gom lại và qua một hàm hạn chế dùng để căn chỉnh tín hiệu ra (kết quả) vào một khoảng giá trị xác định Sau đó, tín hiệu ra của hàm hạn chế được truyền đến tất cả các nơron của lớp kế tiếp Như thế, để sử dụng mạng giải bài toán, chúng ta sử dụng những giá trị tín hiệu vào cho các lớp đầu Cho phép tín hiệu lan truyền qua mạng và đọc các giá trị kết quả sau lớp ra

Phương pháp mạng nơron nhân tạo được ứng dụng để xác định đồng thời các cấu tử theo phương pháp trắc quang

Mô hình hoạt động của mạng nơron được thể hiện ở hình 1.3

lớp ẩn

Tín hiệu vào Tín hiệu ra

Hình 1.4 Mô hình hoạt động của mạng nơron

Độ chính xác của tín hiệu ra phụ thuộc vào trọng số của các nơron, nên cần phải hiệu chỉnh các trọng số để giải với từng bài toán cụ thể Để hiệu chỉnh được trọng số cần các thông tin lan truyền ngược Quá trình lan truyền ngược được thực hiện với một số bước lặp Lúc đầu, các kết quả thu được sẽ

là hỗn loạn Kết quả này được so sánh với kết quả đã biết và tín hiệu sai số bình phương trung bình sẽ được tính Sau đó, giá trị sai số sẽ được lan truyền trở lại mạng và những thay đổi nhỏ được thực hiện đối với các trọng số trong mỗi lớp Sự thay đổi trọng số được tính toán sao cho giảm tín hiệu sai số đối với truờng hợp đang xét Toàn bộ quá trình được lặp lại đối với mỗi bài toán và sau đó lại quay trở về bài toán đầu tiên và cứ thế tiếp tục Vòng lặp được lặp lại cho đến khi sai số toàn cục rơi vào vùng xác định bởi một ngưỡng hội tụ nào đó Tất nhiên, không bao giờ các kết quả thu được có độ chính xác tuyệt đối

Hạn chế của phương pháp mạng nơron là việc thực hiện các thí nghiệm phức tạp, khó áp dụng vào thực tế Để xây dựng được chương trình theo phương pháp mạng nơron có kết quả cao là rất khó và đòi hỏi người lập trình phải có kiến thức tốt về tin học [17]

1.3.4 Phương pháp lọc Kalman

Thuật toán lọc Kalman đầu tiên được nghiên cứu trong vật lý vô tuyến nhằm loại bỏ các tín hiệu "nhiễu" và sau đó được ứng dụng vào hoá học trắc quang Thuật toán lọc Kalman hoạt động trên cơ sở các file dữ liệu phổ ghi được của từng cấu tử riêng rẽ và của hỗn hợp các cấu tử, xác định sự đóng góp về phổ của từng cấu tử trong hỗn hợp tại các bước sóng Khi chương trình chạy, những kết quả tính toán liên tiếp sẽ càng tiến gần đến giá trị thực Trong thực tế, người ta

sử dụng phương pháp bình phương tối thiểu để giảm sai số giữa phổ của hỗn hợp với phổ nhân tạo được dự đoán bởi phương pháp lọc Kalman Kết quả tính toán là

lý tưởng khi phổ của hỗn hợp trừ đi phổ nhân tạo được tính bởi lọc Kalman sẽ tạo

ra một đường thẳng có độ lệch không đáng kể Độ đúng của phép xác định phụ thuộc vào độ nhiễu của nền, vào việc tách các đỉnh phổ hấp thụ của các cấu tử và

sự tương tác giữa các cấu tử Hỗn hợp có càng ít cấu tử, các đỉnh hấp thụ càng cách xa nhau thì sai số của phép tính toán sẽ càng nhỏ

Việc tính toán sẽ được thực hiện trên toàn bộ khoảng bước sóng được chọn Nếu kết thúc quá trình tính toán, độ lệch chuẩn tương đối của giá trị nồng

độ các cấu tử trong hỗn hợp vẫn lớn hơn giá trị sai số cho phép thì nồng độ của cấu tử đó sẽ phải xác định lại Khi đó, cần phải tăng giá trị sai số mặc định hoặc giảm số giá trị nồng độ mặc định để tính giá trị nồng độ trung bình

Một số tác giả đã sử dụng thuật toán lọc Kalman để xác định các cấu tử trong hỗn hợp bằng phương pháp trắc quang Kết quả cho thấy sai số của phép xác định với hỗn hợp 2 cấu tử nhỏ hơn 1%, với hỗn hợp 3 cấu tử có sai số nhỏ hơn 2% [10, 18, 19]

1.4 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ra đời từ năm 1967-1968 trên cơ

sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển Hiện nay phương

pháp HPLC ngày càng phát triển và hiện đại hoá cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích Nó áp dụng rất nhiều trong các ngành kiểm nghiệm đặc biệt là ứng dụng cho ngành kiểm nghiệm thuốc, máy phân tích HPLC là công cụ đắc lực trong phân tích các thuốc đa thành phần cho phép định tính và định lượng Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt

1.4.1 Nguyên tắc của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp tách một hỗn hợp chất lỏng dựa trên sự phân bố chúng giữa hai pha, một pha đứng yên gọi là pha tĩnh, một pha di chuyển gọi là pha động Do ái lực hấp thụ và giải hấp thụ khác nhau của các hợp phần có trong mẫu phân tích với pha tĩnh và pha động mà chúng di chuyển dọc theo pha tĩnh (cột sắc ký) tốc độ khác nhau nên lần lượt đi ra khỏi cột

Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột:

+ Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc

ký và loại sắc ký

- Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ pha thuận hoặc pha đảo

- Nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion thì ta có sắc ký trao đổi ion

- Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc ký phân bố hay sắc ký chiết

- Nếu pha tĩnh là gel thì ta có sắc ký gel hay rây phân tử

+ Để rửa rải chất phân tích ra khỏi cột, ta cần có một pha động Nếu nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp chất phân tích A, B, C vào cột phân tích, kết quả

là các chất A, B, C sẽ được tách ra khỏi nhau sau khi đi qua cột

3 Bơm cao áp: đẩy pha động qua cột sắc kí

4 Bộ tiêm mẫu: tiêm vào cột một thể tích mẫu nhất định

5 Cột tách (pha tĩnh)

6 Detector

7 Máy ghi tín hiệu hoặc máy vi tính

8 Máy in

1.4.3 Kết quả xác định một số chất theo phương pháp HPLC

Ở nước ta, phương pháp HPLC được ứng dụng nhiều trong phân tích các chế phẩm về dược cũng như hỗn hợp các chất vô cơ, hữu cơ Các kết quả đều

cho thấy phương pháp có độ tin cậy cao

Phương pháp HPLC định lượng đồng thời paracetamol và axit mefenamic: có độ chính xác cao (sai số tương đối 0,51% – 1,42%), độ đúng tốt (tỷ lệ thu hồi 98,16% – 99,16%)

Định lượng đồng thời paracetamol và ibuprofen: phương pháp có độ lặp lại tốt (sai số tương đối 0,81% - 1,03%), độ đúng cao (tỷ lệ thu hồi 98,0% – 98,4%)

Định lượng đồng thời paracetamol và cafein: phương pháp có độ lặp lại tốt (sai số tương đối 0,54% – 1,07%), độ đúng cao (tỷ lệ thu hồi 98,9% – 99,5%)

Chương 2 THỰC NGHIỆM

2.1 Nội dung nghiên cứu

Áp dụng phương pháp HPLC và phương pháp quang phổ hấp thụ phân

tử để xây dựng quy trình xác định đồng thời PRC, CFI và PNB trong thuốc thần kinh D3 trên thị trường

Khảo sát để lựa chọn các điều kiện sắc ký:

- Bước sóng thích hợp để phát hiện đồng thời 3 chất

- Pha động: thành phần, tỷ lệ pha động, tốc độ dòng

Đánh giá quy trình sắc ký đã xây dựng được:

- Khảo sát tính thích hợp của hệ thống

- Khảo sát khoảng tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của các chất

- Khảo sát độ chính xác của phương pháp

- Khảo sát độ đúng của phương pháp

Xác định đồng thời PRC, CFI và PNB trong thuốc thần kinh D3 theo phương pháp HPLC

2.1.2 Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử

- Khảo sát trên toàn phổ từ 200 nm đến 900 nm để xác định bước sóng hấp thụ quang cực đại phù hợp khi quét phổ các dung dịch PRC, CFI và PNB

- Tiến hành khảo sát sơ bộ phổ hấp thụ phân tử của PRC, CFI và PNB trong các dung môi có pH = 1 đến 11 để tìm dung môi thích hợp cho phép đo quang

- Khảo sát sự ổn định độ hấp thụ quang của PRC, CFI và PNB theo thời gian, nhiệt độ để lựa chọn khoảng thời gian và nhiệt độ thích hợp khi thực hiện các phép đo quang

- Khảo sát khoảng tuyến tính của PRC, CFI và PNB từ đó xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

- Định lượng đồng thời PRC, CFI và PNB trong các mẫu tự pha để xác định các sai số khi tỷ lệ hàm lượng PRC, CFI và PNB khác nhau

- Xây dựng quy trình phân tích mẫu thuốc thần kinh D3, từ đó đánh giá độ tin cậy của phương pháp thông qua việc tính toán độ đúng và độ lặp lại của phép

đo

- Định lượng đồng thời PRC, CFI và PNB trong mẫu thuốc thần kinh D3 Đánh giá độ tin cậy của phương pháp thông qua xác định độ thu hồi [5, 18, 19]

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp nghiên cứu lý thuyết

Nghiên cứu tài liệu trong và ngoài nước về xác định PRC, CFI và PNB trong hỗn hợp từ đó lựa chọn phương pháp xác định PRC, CFI và PNB phù hợp [1, 2, 17-19]

2.2.2 Phương pháp thực nghiệm

2.2.2.1 Phương pháp HPLC

Nghiên cứu các điều kiên tối ưu cho phương pháp HPLC để định lượng đồng thời PRC, CFI và PNB

Xử lý thống kê các kết quả thu được

2.2.2.2 Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử

Nghiên cứu các điều kiện tối ưu cho phép đo quang PRC, CFI và PNB

- Tiến hành xác định đồng thời 2 chất trong các mẫu giả tự pha

- Tiến hành xác định đồng thời 3 chất trong các mẫu giả tự pha

- Tiến hành xác định đồng thời 3 chất trong mẫu thuốc thần kinh D3

- Sử dụng chương trình lọc Kalman để xác định đồng thời các cấu tử trong hỗn hợp

2.3 Đánh giá độ tin cậy của quy trình phân tích

2.3.1 Giới hạn phát hiện (LOD)

LOD được coi là nồng độ thấp nhất của chất nghiên cứu mà hệ thống phân tích cho tín hiệu phát hiện phân biệt với tín hiệu nền Trong phân tích trắc quang LOD tính theo phương trình hồi quy có công thức như sau:

LOD = 3.SD

B (2.1) Trong đó:

SD: độ lệch chuẩn của tín hiệu y trên đường chuẩn

B: độ dốc của đường chuẩn chính là độ nhạy của phương pháp trắc quang

2.3.2 Giới hạn định lượng (LOQ)

LOQ được coi là nồng độ thấp nhất của chất nghiên cứu mà hệ thống phân tích định lượng được với tín hiệu phân tích khác, có ý nghĩa định lượng với tín hiệu nền và đạt độ tin cậy tối thiểu  95%, thông thường người ta sử dụng công thức:

LOQ =10.SD

B (2.2) 2.3.3 Đánh giá độ tin cậy của phương pháp

- Đánh giá độ đúng của phương pháp đối với các hỗn hợp PRC, CFI và

PNB tự pha chế thông qua sai số tương đối RE Sai số tương đối của các phép phân tích đối với mẫu chuẩn tự pha chế thông qua việc tính tỷ số giữa độ sai lệch của nồng độ tính toán được với nồng độ thực đã biết của mẫu theo công thức:

C0 (µg/mL) là nồng độ đã biết của dung dịch PRC, CFI và PNB trong hỗn hợp

- Đánh giá độ đúng của phương pháp đối với các mẫu thuốc nghiên cứu thông qua độ thu hồi bằng phương pháp thêm chuẩn Độ thu hồi (Rev) được tính theo công thức sau:

Ca: nồng độ (µg/mL) của dung dịch PRC, CFI hoặc PNB xác định được trong mẫu khi chưa thêm chuẩn

a: nồng độ (µg/mL) của dung dịch chuẩn PRC, CFI hoặc PNB thêm vào mẫu (đã biết)

- Độ lặp lại của phương pháp được đánh giá thông qua độ lệch chuẩn (S) hoặc độ lệch chuẩn tương đối (RSD)

 là giá trị nồng độ thực của mẫu;

C là giá trị nồng độ trung bình tính được sau n lần xác định;

k là số bậc tự do

2.3.4 Đánh giá kết quả phép phân tích theo thống kê

Khoảng tin cậy của phép xác định nồng độ được tính theo công thức:

P,k

X ± ε = X ±

Với tP, k là hệ số phân bố chuẩn Student ứng với xác suất P và bậc tự do k được tra trong bảng (t0,95; 3 = 3,18; t0,95; 4 = 2,78; t0,95; 5 = 2,57 ); X là giá trị trung bình của tập số liệu các kết quả nghiên cứu; S là độ lệch chuẩn, được tính theo công thức (2.5); n là số phép đo

- Cốc thủy tinh, phễu thủy tinh, ống nghiệm

- Chương trình lọc Kalman tính toán đồng thời nồng độ các cấu tử [18]

- Thuốc viên thần kinh D3 sản xuất bởi công ty Dược phẩm Hà Tây

Quang trung - Hà Đông - Hà Nội - Việt Nam Số lô sản xuất: 561113 ; Ngày

2.5 Chuẩn bị các dung môi để hòa tan mẫu

Để hòa tan các mẫu nghiên cứu, chúng tôi đã sử dụng các dung môi sau:

- Dung dịch đệm NaH2PO4 pH = 4

- Dung dịch Metanol (gọi là dung dịch I)

- Dung dịch pha mẫu (gọi là dung dịch II)

- Dung dịch pha động

- Dung dịch HCl 10-1M; 10-2M; 10-3M

- Dung dịch H2SO4 5.10-2M; 5.10-3M; 5.10-4M

- Dung dịch HNO3 10-1M; 10-2M; 10-3M

Dung dịch đệm được chuẩn bị bằng cách hòa tan 6,4g NaH2PO4 trong 1

lít nước cất 2 lần sau đó lắc siêu âm trong 10 phút Độ pH của dung dịch được

điều chỉnh bằng 4,0 với axit photphoric thu được hỗn hợp đệm pH = 4

Dung dịch pha mẫu (dung dịch II) là hỗn hợp đệm NaH2PO4 pH = 4

và CH3OH với tỷ lệ 45:55