1.3.1. Phương pháp Vierordt
Để xác định nồng độ của các cấu tử trong hỗn hợp, lần đầu tiên Vierordt đã đo độ hấp thụ quang của dung dịch hỗn hợp ở các bước sóng khác nhau, sau đó thiết lập hệ phương trình bậc nhất mà số phương trình bằng số ẩn số (số cấu tử trong hỗn hợp), giải hệ phương trình này sẽ tính được nồng độ của các cấu tử. Điều kiện để áp dụng phương pháp này là các cấu tử trong hỗn hợp phải tuân theo định luật Bughe - Lămbe - Bia và thỏa mãn tính cộng tính của độ hấp thụ quang.
Với hỗn hợp chứa n cấu tử ta cần phải lập hệ n phương trình n ẩn. Hệ phương trình này được thiết lập bằng cách đo độ hấp thụ quang của hỗn hợp ở n bước sóng khác nhau.
A(1) = 11C1b + 21C2b + . . . + i1Cib + . . . + n1Cnb A(2) = 12C1b + 22C2b + . . . + i2Cib + . . . + n2Cnb
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
A(n) = 1nC1b + 2nC2b + . . . + inCib + . . . + nnCnb (1.4) Trong đó : A(1), A(2),..., A(n): độ hấp thụ quang của hỗn hợp ở bước sóng 1, bước sóng 2, . . ., và bước sóng n.
in: hệ số hấp thụ mol phân tử của cấu tử i tại bước sóng n (được xác định bằng cách đo độ hấp thụ quang của dung dịch chỉ chứa cấu tử i ở bước sóng n ).
b: bề dày lớp dung dịch (cm).
Ci: nồng độ của cấu tử thứ i trong hỗn hợp (mol/lít). Với i, j = 1 n.
tuyến tính khá đơn giản. Tuy nhiên khi số cấu tử lớn thì việc giải hệ phương trình phức tạp hơn.
Phương pháp Vierordt chủ yếu được vận dụng để tìm cách giải hệ phương trình như: giải bằng đồ thị, giải bằng phép ma trận vuông, phương pháp khử Gauss, . . . để xác định nồng độ của mỗi cấu tử.
Một số tác giả sử dụng phương pháp Vierordt để xác định đồng thời paracetamol và clopheninamin maleat trong thuốc viên nén bằng cách đo độ hấp thụ quang ở các bước sóng 242 và 264 nm [2].
Phương pháp Vierordt đơn giản, dễ thực hiện nhưng chỉ áp dụng được khi số cấu tử trong dung dịch hỗn hợp ít, phổ hấp thụ quang phân tử xen phủ nhau không nhiều, tính chất cộng tính độ hấp thụ quang được thoả mãn nghiêm ngặt, thiết bị đo quang tốt thì phương pháp cho kết quả khá chính xác. Đối với hệ nhiều cấu tử, đặc biệt là khi phổ của các cấu tử xen phủ nhau nhiều, tính chất cộng tính độ hấp thụ quang không được thoả mãn nghiêm ngặt, thiết bị đo có độ chính xác không cao thì phương pháp không chính xác và có sai số lớn . Bởi vậy mặc dù phương pháp Vierordt tuy ra đời đã lâu, nhưng ứng dụng trong thực tế còn rất ít. Tuy nhiên đây là cơ sở lý thuyết cơ bản nhất, đặt nền móng cho các nhà khoa học sau này phát triển, cải tiến để xây dựng nên các phương pháp mới.
1.3.2. Phương pháp phổ đạo hàm
Độ hấp thụ quang của các cấu tử là hàm của độ dài bước sóng của ánh sáng tới A = f(). Phổ đạo hàm của độ hấp thụ quang theo bước sóng được biểu diễn bằng phương trình toán học:
Đạo hàm bậc 1 của độ hấp thụ quang: 1 ,
λ dA
A = = f λ
dλ
Đạo hàm bậc 2 của độ hấp thụ quang:
2 2 ,, λ 2 d A A = = f λ dλ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Và đạo hàm bậc n của độ hấp thụ quang:
n n (n) λ n d A A = = f λ dλ (1.5)
Theo định luật Bughe - Lămbe - Bia thì: 0 λ
A = A = .C.b Với C và b là hằng số, không phụ thuộc vào bước sóng nên:
1 λ dA dε A = = C.b. dλ dλ 2 2 2 λ 2 2 d A d ε A = = C.b. dλ dλ . . . . . . . . . n n n λ n n d A d ε A = = C.b. dλ dλ (1.6)
Độ hấp thụ quang của dung dịch có tính cộng tính nên: n n n n
λ hon hop λ Cau tu 1 λ Cau tu 2 λ Cau tu n
A = A + A + ... +A (1.7)
Để tính đạo hàm tại bước sóng người ta chọn một cửa sổ n điểm số liệu từ phổ bậc 0 và một đa thức hồi quy được tính bằng phương pháp bình phương tối thiểu. Đa thức này có dạng:
A = a0 + a1.+ a2.2 + . . . + ak.k (1.8) Các hệ số a0, a1 . . . ak tại mỗi bước sóng tương ứng là các giá trị đạo hàm bậc 0, 1, 2 . . . k. Để có phổ đạo hàm đối với tập số liệu phổ bậc không, đầu tiên ta phải sử dụng phương pháp hồi quy bình phương tối thiểu để tìm được hàm hồi quy là đa thức bậc cao. Sau đó lấy đạo hàm của hàm này ta sẽ được các phổ đạo hàm.
Đối với phổ đạo hàm bậc 0, 1 . . . n ta thấy có những đặc điểm như sau: đỉnh của phổ đạo hàm bậc n là điểm uốn của phổ đạo hàm bậc (n - 1), còn tại đỉnh của phổ đạo hàm bậc (n-1) thì phổ đạo hàm bậc n có giá trị bằng 0. Số đỉnh của phổ đạo hàm bậc n nhiều hơn số đỉnh của phổ đạo hàm bậc (n - 1).
Như vậy, dùng phương pháp phổ đạo hàm ta có thể tách phổ gần trùng nhau thành những phổ mới và khi đó ta có thể chọn được những bước sóng mà tại đó chỉ có duy nhất 1 cấu tử hấp thụ quang còn các cấu tử khác không hấp
thụ, nhờ đó mà có thể xác định được từng chất trong hỗn hợp. Bằng toán học, người ta xây dựng được phần mềm khi đo phổ của dung dịch hỗn hợp có thể ghi ngay được phổ đạo hàm các bậc của phổ đó. Căn cứ vào các giá trị phổ đạo hàm ta lựa chọn được bước sóng xác định đối với từng cấu tử.
Ở nước ta, một số tác giả đã sử dụng phương pháp phổ đạo hàm xác định đồng thời các vitamin tan trong nước [13, 14, 19] cũng như xác định đồng thời các chế phẩm dược dụng khác.
Các kết quả thu được có sai số trong khoảng 1,7 5%.
Trên thế giới, phương pháp phổ đạo hàm được ứng dụng để phân tích các chế phẩm dược dụng cũng như hỗn hợp các chất vô cơ, hữu cơ. Hầu hết các kết quả đều cho thấy phương pháp có độ tin cậy cao. Tuy nhiên phương pháp phổ đạo hàm chỉ được áp dụng khi số cấu tử trong dung dịch ít và phổ hấp thụ quang phân tử của chúng không trùng nhau.
1.3.3. Phương pháp mạng nơron nhân tạo
Nguyên tắc: đặt các nơron sao cho chúng ở trong những lớp cách biệt, mỗi nơron trong một lớp được nối với tất cả các nơron khác ở lớp kế tiếp và xác định bằng những tín hiệu chỉ được truyền theo một hướng qua mạng. Đó chính là mô hình mạng nơron.
Quá trình vận hành mạng nơron: mỗi nơron nhận một tín hiệu từ nơron của lớp trước và mỗi tín hiệu này được nhân với hệ số riêng. Những tín hiệu vào có trọng số được gom lại và qua một hàm hạn chế dùng để căn chỉnh tín hiệu ra (kết quả) vào một khoảng giá trị xác định. Sau đó, tín hiệu ra của hàm hạn chế được truyền đến tất cả các nơron của lớp kế tiếp. Như thế, để sử dụng mạng giải bài toán, chúng ta sử dụng những giá trị tín hiệu vào cho các lớp đầu. Cho phép tín hiệu lan truyền qua mạng và đọc các giá trị kết quả sau lớp ra.
Phương pháp mạng nơron nhân tạo được ứng dụng để xác định đồng thời các cấu tử theo phương pháp trắc quang.
Mô hình hoạt động của mạng nơron được thể hiện ở hình 1.3.
lớp ẩn
input output
Tín hiệu vào Tín hiệu ra
Hình 1.4. Mô hình hoạt động của mạng nơron
Độ chính xác của tín hiệu ra phụ thuộc vào trọng số của các nơron, nên cần phải hiệu chỉnh các trọng số để giải với từng bài toán cụ thể. Để hiệu chỉnh được trọng số cần các thông tin lan truyền ngược. Quá trình lan truyền ngược được thực hiện với một số bước lặp. Lúc đầu, các kết quả thu được sẽ là hỗn loạn. Kết quả này được so sánh với kết quả đã biết và tín hiệu sai số bình phương trung bình sẽ được tính. Sau đó, giá trị sai số sẽ được lan truyền trở lại mạng và những thay đổi nhỏ được thực hiện đối với các trọng số trong mỗi lớp. Sự thay đổi trọng số được tính toán sao cho giảm tín hiệu sai số đối với truờng hợp đang xét. Toàn bộ quá trình được lặp lại đối với mỗi bài toán và sau đó lại quay trở về bài toán đầu tiên và cứ thế tiếp tục. Vòng lặp được lặp lại cho đến khi sai số toàn cục rơi vào vùng xác định bởi một ngưỡng hội tụ nào đó. Tất nhiên, không bao giờ các kết quả thu được có độ chính xác tuyệt đối.
Hạn chế của phương pháp mạng nơron là việc thực hiện các thí nghiệm phức tạp, khó áp dụng vào thực tế. Để xây dựng được chương trình theo phương pháp mạng nơron có kết quả cao là rất khó và đòi hỏi người lập trình phải có kiến thức tốt về tin học [17].
1.3.4. Phương pháp lọc Kalman
Thuật toán lọc Kalman đầu tiên được nghiên cứu trong vật lý vô tuyến nhằm loại bỏ các tín hiệu "nhiễu" và sau đó được ứng dụng vào hoá học trắc quang. Thuật toán lọc Kalman hoạt động trên cơ sở các file dữ liệu phổ ghi được của từng cấu tử riêng rẽ và của hỗn hợp các cấu tử, xác định sự đóng góp về phổ của từng cấu tử trong hỗn hợp tại các bước sóng. Khi chương trình chạy, những kết quả tính toán liên tiếp sẽ càng tiến gần đến giá trị thực. Trong thực tế, người ta sử dụng phương pháp bình phương tối thiểu để giảm sai số giữa phổ của hỗn hợp với phổ nhân tạo được dự đoán bởi phương pháp lọc Kalman. Kết quả tính toán là lý tưởng khi phổ của hỗn hợp trừ đi phổ nhân tạo được tính bởi lọc Kalman sẽ tạo ra một đường thẳng có độ lệch không đáng kể. Độ đúng của phép xác định phụ thuộc vào độ nhiễu của nền, vào việc tách các đỉnh phổ hấp thụ của các cấu tử và sự tương tác giữa các cấu tử. Hỗn hợp có càng ít cấu tử, các đỉnh hấp thụ càng cách xa nhau thì sai số của phép tính toán sẽ càng nhỏ.
Việc tính toán sẽ được thực hiện trên toàn bộ khoảng bước sóng được chọn. Nếu kết thúc quá trình tính toán, độ lệch chuẩn tương đối của giá trị nồng độ các cấu tử trong hỗn hợp vẫn lớn hơn giá trị sai số cho phép thì nồng độ của cấu tử đó sẽ phải xác định lại. Khi đó, cần phải tăng giá trị sai số mặc định hoặc giảm số giá trị nồng độ mặc định để tính giá trị nồng độ trung bình.
Một số tác giả đã sử dụng thuật toán lọc Kalman để xác định các cấu tử trong hỗn hợp bằng phương pháp trắc quang. Kết quả cho thấy sai số của phép xác định với hỗn hợp 2 cấu tử nhỏ hơn 1%, với hỗn hợp 3 cấu tử có sai số nhỏ hơn 2% [10, 18, 19].
1.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ra đời từ năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển. Hiện nay phương
pháp HPLC ngày càng phát triển và hiện đại hoá cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích. Nó áp dụng rất nhiều trong các ngành kiểm nghiệm đặc biệt là ứng dụng cho ngành kiểm nghiệm thuốc, máy phân tích HPLC là công cụ đắc lực trong phân tích các thuốc đa thành phần cho phép định tính và định lượng. Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt.
1.4.1. Nguyên tắc của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp tách một hỗn hợp chất lỏng dựa trên sự phân bố chúng giữa hai pha, một pha đứng yên gọi là pha tĩnh, một pha di chuyển gọi là pha động. Do ái lực hấp thụ và giải hấp thụ khác nhau của các hợp phần có trong mẫu phân tích với pha tĩnh và pha động mà chúng di chuyển dọc theo pha tĩnh (cột sắc ký) tốc độ khác nhau nên lần lượt đi ra khỏi cột.
Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột:
+ Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc
ký và loại sắc ký.
- Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ pha thuận hoặc pha đảo.
- Nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion thì ta có sắc ký trao đổi ion. - Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc ký phân bố hay sắc ký chiết. - Nếu pha tĩnh là gel thì ta có sắc ký gel hay rây phân tử .
+ Để rửa rải chất phân tích ra khỏi cột, ta cần có một pha động. Nếu nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp chất phân tích A, B, C... vào cột phân tích, kết quả là các chất A, B, C... sẽ được tách ra khỏi nhau sau khi đi qua cột.
1.4.2. Sơ đồ máy HPLC
Hình 1.5. Sơ đồ hệ thống máy HPLC
Hệ thống máy HPLC có các bộ phận chính sau: 1. Bình chứa dung môi (pha động).
2. Bộ khử khí.
3. Bơm cao áp: đẩy pha động qua cột sắc kí.
4. Bộ tiêm mẫu: tiêm vào cột một thể tích mẫu nhất định. 5. Cột tách (pha tĩnh).
6. Detector.
7. Máy ghi tín hiệu hoặc máy vi tính. 8. Máy in.
1.4.3. Kết quả xác định một số chất theo phương pháp HPLC
Ở nước ta, phương pháp HPLC được ứng dụng nhiều trong phân tích các chế phẩm về dược cũng như hỗn hợp các chất vô cơ, hữu cơ. Các kết quả đều cho thấy phương pháp có độ tin cậy cao.
Phương pháp HPLC định lượng đồng thời paracetamol và axit mefenamic: có độ chính xác cao (sai số tương đối 0,51% – 1,42%), độ đúng tốt (tỷ lệ thu hồi 98,16% – 99,16%).
Định lượng đồng thời paracetamol và ibuprofen: phương pháp có độ lặp lại tốt (sai số tương đối 0,81% - 1,03%), độ đúng cao (tỷ lệ thu hồi 98,0% – 98,4%).
Định lượng đồng thời paracetamol và cafein: phương pháp có độ lặp lại tốt (sai số tương đối 0,54% – 1,07%), độ đúng cao (tỷ lệ thu hồi 98,9% – 99,5%) .
Chương 2
THỰC NGHIỆM
2.1. Nội dung nghiên cứu
Áp dụng phương pháp HPLC và phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử để xây dựng quy trình xác định đồng thời PRC, CFI và PNB trong thuốc thần kinh D3 trên thị trường.
2.1.1. Phương pháp HPLC
Lựa chọn các thông số của máy HPLC: - Thể tích bơm mẫu.
- Cột tách. - Nhiệt độ.
Khảo sát để lựa chọn các điều kiện sắc ký:
- Bước sóng thích hợp để phát hiện đồng thời 3 chất. - Pha động: thành phần, tỷ lệ pha động, tốc độ dòng... Đánh giá quy trình sắc ký đã xây dựng được:
- Khảo sát tính thích hợp của hệ thống.
- Khảo sát khoảng tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của các chất. - Khảo sát độ chính xác của phương pháp.
- Khảo sát độ đúng của phương pháp.
Xác định đồng thời PRC, CFI và PNB trong thuốc thần kinh D3 theo phương pháp HPLC.
2.1.2. Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử
- Khảo sát trên toàn phổ từ 200 nm đến 900 nm để xác định bước sóng hấp thụ quang cực đại phù hợp khi quét phổ các dung dịch PRC, CFI và PNB.
- Tiến hành khảo sát sơ bộ phổ hấp thụ phân tử của PRC, CFI và PNB trong các dung môi có pH = 1 đến 11 để tìm dung môi thích hợp cho phép đo quang.
- Khảo sát sự ổn định độ hấp thụ quang của PRC, CFI và PNB theo thời gian, nhiệt độ để lựa chọn khoảng thời gian và nhiệt độ thích hợp khi thực hiện