Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ra đời từ năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển. Hiện nay phương
pháp HPLC ngày càng phát triển và hiện đại hoá cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích. Nó áp dụng rất nhiều trong các ngành kiểm nghiệm đặc biệt là ứng dụng cho ngành kiểm nghiệm thuốc, máy phân tích HPLC là công cụ đắc lực trong phân tích các thuốc đa thành phần cho phép định tính và định lượng. Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt.
1.4.1. Nguyên tắc của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp tách một hỗn hợp chất lỏng dựa trên sự phân bố chúng giữa hai pha, một pha đứng yên gọi là pha tĩnh, một pha di chuyển gọi là pha động. Do ái lực hấp thụ và giải hấp thụ khác nhau của các hợp phần có trong mẫu phân tích với pha tĩnh và pha động mà chúng di chuyển dọc theo pha tĩnh (cột sắc ký) tốc độ khác nhau nên lần lượt đi ra khỏi cột.
Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột:
+ Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc
ký và loại sắc ký.
- Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ pha thuận hoặc pha đảo.
- Nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion thì ta có sắc ký trao đổi ion. - Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc ký phân bố hay sắc ký chiết. - Nếu pha tĩnh là gel thì ta có sắc ký gel hay rây phân tử .
+ Để rửa rải chất phân tích ra khỏi cột, ta cần có một pha động. Nếu nạp mẫu phân tích gồm hỗn hợp chất phân tích A, B, C... vào cột phân tích, kết quả là các chất A, B, C... sẽ được tách ra khỏi nhau sau khi đi qua cột.
1.4.2. Sơ đồ máy HPLC
Hình 1.5. Sơ đồ hệ thống máy HPLC
Hệ thống máy HPLC có các bộ phận chính sau: 1. Bình chứa dung môi (pha động).
2. Bộ khử khí.
3. Bơm cao áp: đẩy pha động qua cột sắc kí.
4. Bộ tiêm mẫu: tiêm vào cột một thể tích mẫu nhất định. 5. Cột tách (pha tĩnh).
6. Detector.
7. Máy ghi tín hiệu hoặc máy vi tính. 8. Máy in.
1.4.3. Kết quả xác định một số chất theo phương pháp HPLC
Ở nước ta, phương pháp HPLC được ứng dụng nhiều trong phân tích các chế phẩm về dược cũng như hỗn hợp các chất vô cơ, hữu cơ. Các kết quả đều cho thấy phương pháp có độ tin cậy cao.
Phương pháp HPLC định lượng đồng thời paracetamol và axit mefenamic: có độ chính xác cao (sai số tương đối 0,51% – 1,42%), độ đúng tốt (tỷ lệ thu hồi 98,16% – 99,16%).
Định lượng đồng thời paracetamol và ibuprofen: phương pháp có độ lặp lại tốt (sai số tương đối 0,81% - 1,03%), độ đúng cao (tỷ lệ thu hồi 98,0% – 98,4%).
Định lượng đồng thời paracetamol và cafein: phương pháp có độ lặp lại tốt (sai số tương đối 0,54% – 1,07%), độ đúng cao (tỷ lệ thu hồi 98,9% – 99,5%) .
Chương 2
THỰC NGHIỆM
2.1. Nội dung nghiên cứu
Áp dụng phương pháp HPLC và phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử để xây dựng quy trình xác định đồng thời PRC, CFI và PNB trong thuốc thần kinh D3 trên thị trường.
2.1.1. Phương pháp HPLC
Lựa chọn các thông số của máy HPLC: - Thể tích bơm mẫu.
- Cột tách. - Nhiệt độ.
Khảo sát để lựa chọn các điều kiện sắc ký:
- Bước sóng thích hợp để phát hiện đồng thời 3 chất. - Pha động: thành phần, tỷ lệ pha động, tốc độ dòng... Đánh giá quy trình sắc ký đã xây dựng được:
- Khảo sát tính thích hợp của hệ thống.
- Khảo sát khoảng tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của các chất. - Khảo sát độ chính xác của phương pháp.
- Khảo sát độ đúng của phương pháp.
Xác định đồng thời PRC, CFI và PNB trong thuốc thần kinh D3 theo phương pháp HPLC.
2.1.2. Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử
- Khảo sát trên toàn phổ từ 200 nm đến 900 nm để xác định bước sóng hấp thụ quang cực đại phù hợp khi quét phổ các dung dịch PRC, CFI và PNB.
- Tiến hành khảo sát sơ bộ phổ hấp thụ phân tử của PRC, CFI và PNB trong các dung môi có pH = 1 đến 11 để tìm dung môi thích hợp cho phép đo quang.
- Khảo sát sự ổn định độ hấp thụ quang của PRC, CFI và PNB theo thời gian, nhiệt độ để lựa chọn khoảng thời gian và nhiệt độ thích hợp khi thực hiện các phép đo quang.
- Khảo sát khoảng tuyến tính của PRC, CFI và PNB từ đó xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ).
- Định lượng đồng thời PRC, CFI và PNB trong các mẫu tự pha để xác định các sai số khi tỷ lệ hàm lượng PRC, CFI và PNB khác nhau.
- Xây dựng quy trình phân tích mẫu thuốc thần kinh D3, từ đó đánh giá độ tin cậy của phương pháp thông qua việc tính toán độ đúng và độ lặp lại của phép đo.
- Định lượng đồng thời PRC, CFI và PNB trong mẫu thuốc thần kinh D3. Đánh giá độ tin cậy của phương pháp thông qua xác định độ thu hồi [5, 18, 19].
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp nghiên cứu lý thuyết
Nghiên cứu tài liệu trong và ngoài nước về xác định PRC, CFI và PNB trong hỗn hợp từ đó lựa chọn phương pháp xác định PRC, CFI và PNB phù hợp [1, 2, 17-19].
2.2.2. Phương pháp thực nghiệm
2.2.2.1. Phương pháp HPLC
Nghiên cứu các điều kiên tối ưu cho phương pháp HPLC để định lượng đồng thời PRC, CFI và PNB.
Xử lý thống kê các kết quả thu được.
2.2.2.2. Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử
Nghiên cứu các điều kiện tối ưu cho phép đo quang PRC, CFI và PNB. - Tiến hành xác định đồng thời 2 chất trong các mẫu giả tự pha.
- Tiến hành xác định đồng thời 3 chất trong các mẫu giả tự pha. - Tiến hành xác định đồng thời 3 chất trong mẫu thuốc thần kinh D3.
- Sử dụng chương trình lọc Kalman để xác định đồng thời các cấu tử trong hỗn hợp.
2.3. Đánh giá độ tin cậy của quy trình phân tích
2.3.1. Giới hạn phát hiện (LOD)
LOD được coi là nồng độ thấp nhất của chất nghiên cứu mà hệ thống phân tích cho tín hiệu phát hiện phân biệt với tín hiệu nền. Trong phân tích trắc quang LOD tính theo phương trình hồi quy có công thức như sau:
LOD = 3.SD
B (2.1) Trong đó:
SD: độ lệch chuẩn của tín hiệu y trên đường chuẩn.
B: độ dốc của đường chuẩn chính là độ nhạy của phương pháp trắc quang.
2.3.2. Giới hạn định lượng (LOQ)
LOQ được coi là nồng độ thấp nhất của chất nghiên cứu mà hệ thống phân tích định lượng được với tín hiệu phân tích khác, có ý nghĩa định lượng với tín hiệu nền và đạt độ tin cậy tối thiểu 95%, thông thường người ta sử dụng công thức:
LOQ =10.SD
B (2.2)
2.3.3. Đánh giá độ tin cậy của phương pháp
- Đánh giá độ đúng của phương pháp đối với các hỗn hợp PRC, CFI và PNB tự pha chế thông qua sai số tương đối RE. Sai số tương đối của các phép phân tích đối với mẫu chuẩn tự pha chế thông qua việc tính tỷ số giữa độ sai lệch của nồng độ tính toán được với nồng độ thực đã biết của mẫu theo công thức:
T in h t o a n 0
0
C - C
R E % = . 1 0 0 %
C (2.3) Trong đó: RE% là sai số tương đối của phép xác định nồng độ các cấu tử.
C0 (µg/mL) là nồng độ đã biết của dung dịch PRC, CFI và PNB trong hỗn hợp.
- Đánh giá độ đúng của phương pháp đối với các mẫu thuốc nghiên cứu thông qua độ thu hồi bằng phương pháp thêm chuẩn. Độ thu hồi (Rev) được tính theo công thức sau:
R e = C - T .100% a
a
C
v (2.4) Trong đó: CT: nồng độ (µg/mL) của dung dịch PRC, CFI hoặc PNB xác định được trong mẫu sau khi thêm chuẩn;
Ca: nồng độ (µg/mL) của dung dịch PRC, CFI hoặc PNB xác định được trong mẫu khi chưa thêm chuẩn.
a: nồng độ (µg/mL) của dung dịch chuẩn PRC, CFI hoặc PNB thêm vào mẫu (đã biết).
- Độ lặp lại của phương pháp được đánh giá thông qua độ lệch chuẩn (S) hoặc độ lệch chuẩn tương đối (RSD).
n n 2 2 i i i=1 i=1 -μ -C S = = k k C C (2.5) RSD = .100(%) C S (2.6) Trong đó: Ci là các giá trị nồng độ (µg/mL) của dung dịch PRC, CFI hoặc PNB tính được lần thứ i;
là giá trị nồng độ thực của mẫu;
C là giá trị nồng độ trung bình tính được sau n lần xác định; k là số bậc tự do.
2.3.4. Đánh giá kết quả phép phân tích theo thống kê
Khoảng tin cậy của phép xác định nồng độ được tính theo công thức: P,k
t .S
Với tP, k là hệ số phân bố chuẩn Student ứng với xác suất P và bậc tự do k được tra trong bảng (t0,95; 3 = 3,18; t0,95; 4 = 2,78; t0,95; 5 = 2,57 ); X là giá trị trung bình của tập số liệu các kết quả nghiên cứu; S là độ lệch chuẩn, được tính theo công thức (2.5); n là số phép đo.
2.4. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 2.4.1. Thiết bị 2.4.1. Thiết bị
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Hitachi L-2000 với detector UV-Vis L-2420 của Khoa Hóa học Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên.
- Máy quang phổ UV – 1700 Shimadzu của Khoa Hóa học Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên, có khả năng quét phổ trong khoảng bước sóng 190nm – 900 nm, có kết nối máy tính.
- Bộ cuvet thạch anh.
- Cân điện tử có độ chính xác 0,0001g. - Bếp cách thủy.
- Máy rung siêu âm. - Máy đo pH.
2.4.2. Dụng cụ
- Pipet các loại: 1 mL; 2 mL; 5 mL; 10 mL; 20 mL; 25 mL.
- Bình định mức dung dịch: 10 mL; 25 mL; 50 mL; 100 mL; 250 mL; 500 mL; 1000 mL.
- Cốc thủy tinh, phễu thủy tinh, ống nghiệm...
- Chương trình lọc Kalman tính toán đồng thời nồng độ các cấu tử [18]. - Một số dụng cụ khác.
2.4.3. Hóa chất
- HCl, H2SO4, HNO3, H3PO4,... dùng để pha chế các dung dịch đều thuộc loại tinh khiết của Merck.
- Chất chuẩn paracetamol, cafein và phenobarbital nguyên chất do viện kiểm nghiệm dược sản xuất.
- Thuốc viên thần kinh D3 sản xuất bởi công ty Dược phẩm Hà Tây Quang trung - Hà Đông - Hà Nội - Việt Nam. Số lô sản xuất: 561113 ; Ngày sản xuất: 29/11/2013; Hạn sử dụng: 29/11/2016.
2.4.4. Chế phẩm thần kinh D3
Thành Phần:
Mỗi viên nén chứa: Paracetamol : 200 mg
Cafein : 20mg Phenobarbital: 7,5 mg
2.5. Chuẩn bị các dung môi để hòa tan mẫu
Để hòa tan các mẫu nghiên cứu, chúng tôi đã sử dụng các dung môi sau: - Dung dịch đệm NaH2PO4 pH = 4.
- Dung dịch Metanol (gọi là dung dịch I). - Dung dịch pha mẫu (gọi là dung dịch II). - Dung dịch pha động.
- Dung dịch HCl 10-1M; 10-2M; 10-3M.
- Dung dịch H2SO4 5.10-2M; 5.10-3M; 5.10-4M. - Dung dịch HNO3 10-1M; 10-2M; 10-3M.
Dung dịch đệm được chuẩn bị bằng cách hòa tan 6,4g NaH2PO4 trong 1 lít nước cất 2 lần sau đó lắc siêu âm trong 10 phút. Độ pH của dung dịch được điều chỉnh bằng 4,0 với axit photphoric thu được hỗn hợp đệm pH = 4.
Dung dịch pha mẫu (dung dịch II) là hỗn hợp đệm NaH2PO4 pH = 4 và CH3OH với tỷ lệ 45:55
Lấy 41,8 mL dung dịch HCl 37% (d = 1,18) pha loãng bằng nước cất 2 lần thành 500 mL thu được dung dịch HCl 1M (pH = 0). Sau đó pha thành HCl 0,1M; 0,01M và 0,001M.
Lấy 5,5 mL dung dịch H2SO4 97% (d = 1,84) pha loãng bằng nước cất 2 lần thành 100 mL thu được dung dịch H2SO4 1M . Sau đó pha thành H2SO4
0,05M; H2SO4 0,005M và H2SO4 0,0005M.
Lấy 7 mL dung dịch HNO3 65% (d = 1,39) pha loãng bằng nước cất 2 lần thành 100 mL thu được dung dịch HNO3 1M (pH = 0). Sau đó pha thành HNO3
0,1M; 0,01M và 0,001M..
Chương 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Xác định đồng thời paracetamol, cafein và phenobarbital theo phương pháp HPLC pháp HPLC
3.1.1. Xây dựng điều kiện để xác định đồng thời paracetamol, cafein và phenobarbital
Qua việc nghiên cứu tính chất lý hóa của 3 chất PRC, CFI và PNB kết hợp với tài liệu tham khảo và điều kiện sẵn có của phòng thí nghiệm, chúng tôi lựa chọn kiểu sắc ký hấp phụ pha đảo (RP-HPLC), sử dụng cột silica C18, thể tích bơm mẫu là 20 µL, nhiệt độ 25oC.
3.1.1.1. Khảo sát lựa chọn pha động
Để chọn được pha động thích hợp, chúng tôi đã tiến hành khảo sát tỉ lệ thành phần pha động là hỗn hợp đệm NaH2PO4 (pH = 4): metanol ở các tỷ lệ về thể tích lần lượt là: 75:25 cho đến 25:75 với tốc độ dòng là 1 mL/phút. Các dung dịch được lọc qua màng lọc 0,45 µm sau đó rung siêu âm để khử bọt khí.
Sự thay đổi tỉ lệ thành phần pha động làm thay đổi đáng kể kết quả sắc ký. Tuy nhiên tỷ lệ hỗn hợp đệm NaH2PO4 (pH = 4): metanol 45:55 cho kết quả tốt nhất với thời gian lưu của PRC là 4,02 giây; CFI là 5,21 giây và PNB là 12,55 giây. Điều này phù hợp với dược điển [1]
Vì vậy, chúng tôi chọn pha động để xác định đồng thời 3 chất là hỗn hợp đệm NaH2PO4 (pH = 4): metanol với tỷ lệ thể tích là 45:55.
3.1.1.2. Lựa chọn bước sóng 3.1.1.3. Lựa chọn tốc độ dòng
Để lựa chọn được tốc độ dòng thích hợp, chúng tôi tiến hành sắc ký với các điều kiện ở trên nhưng với các tốc độ dòng là 1 mL/phút; 1,5 mL/phút và 2 mL/phút.
Với tốc độ dòng 1,5 mL/phút nhận thấy đỉnh của các pic bị tù và chân pic bị dãn.
Với tốc độ dòng 1 mL/phút nhận thấy kết quả tách tốt, các pic tách rời nhau và thời gian chạy sắc ký phù hợp.
Với tốc độ dòng 2 mL/phút nhận thấy các pic có đỉnh nhọn và chân pic hẹp.
Vì vậy, chúng tôi lựa chọn tốc dộ dòng là 1 mL/phút để tiến hành phân tích sắc ký.
Hình 3.2. Phổ pic của CFI (20 µg/mL)
Kết luận chung: Từ các kết quả trên, chúng tôi lựa chọn điều kiện tối ưu để xác định đồng thời PRC, CFI và PNB theo phương pháp HPLC là:
Pha động: hỗn hợp đệm NaH2PO4 (pH = 4) : metanol với tỷ lệ thể tích là 45:55 Detector UV-Vis: λ = 216 nm. Cột: sử dụng cột C18 (250mm x 4,6). Tốc độ dòng: 1 mL/phút. Thể tích bơm mẫu: 20 µL. Nhiệt độ phân tích: 25oC.
Với các điều kiện trên, chúng tôi đã tiến hành phân tích đồng thời PRC, CFI và PNB; kết quả sắc ký được thể hiện ở hình 3.4.
Hình 3.4. Phổ các pic của PRC (1), CFI (2) và PNB (3)
3.1.2. Đánh giá phương pháp định lượng
3.1.2.1. Chuẩn bị dung dịch hỗn hợp chuẩn 1
2
Dung dịch PRC 1: Cân chính xác 50 mg PRC cho vào bình định mức 50 mL và định mức bằng dung dịch II, sau đó đem rung siêu âm trong 10 phút. Thu được dung dịch PRC có nồng độ là 1000 µg/mL (gọi là dung dịch PRC 1). Pha loãng dung dịch PRC 1 bằng dung dịch II thu được các dung dịch PRC có nồng độ 800 µg/mL, 600 µg/mL, 400 µg/mL và 200 µg/mL.
Dung dịch CFI 1: Cân chính xác 50 mg CFI cho vào bình định mức 100 mL và định mức bằng dung dịch II, sau đó đem rung siêu âm trong 10 phút thu được dung dịch CFI có nồng độ 500 µg/mL (gọi là dung dịch CFI 1). Pha loãng dung dịch CFI 1 bằng dung dịch II thu được dung dịch CFI có nồng độ là 25