LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC: NGHIÊN CỨU, XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG AXIT URIC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) VÀ ỨNG DỤNG PTHỬ NGHIỆM TRONG PHÂN TÍCH

1I. Lý do chọn đề tàiAxit uric là một hợp chất dị vòng chứa cacbon, nitơ, oxi và hiđro có công thức phân tử là C5H4N4O3. Axit uric là sản phẩm cuối cùng của quá trình chuyển hóa purine nucleotit. Trong cơ thể người và động vật, axit uric được đào thải qua đường nước tiểu, n. Nhưng do quá trình cung cấp quá nhiều đạm làm tăng quá trình tổng hợp axit uric hoặc do chức năng suy thận giảm khiến quá trình đào thải axit uric không hoàn toàn làm tăng hàm lượng axit uric trong máu. Khi hàm lượng axit uric trong máu tăng dẫn đến một số bệnh của viêm khớp gọi là bệnh Gut (bệnh Gout). Các hạt lắng đọng xung quanh các khớp dẫn đến hậu quả sưng viêm và đau khớp, bên cạnh đó, một số lắng đọng tại thận là nguyên nhân gây bệnh sỏi thận.Nồng độ axit uric trong nước tiểu và trong huyết thanh quá cao sẽ được tìm thấy trong các bệnh nhân mắc một số bệnh như bệnh Gout, sỏi thận, tim mạch, tiểu đường loại 2. Nếu nồng độ axit uric trong huyết tương quá thấp gây nên bệnh đa xơ cứng ở ngoài. Do đó việc xác định hàm lượng của axit uric trong cơ thể người có nghĩa vô cùng quan trọng trong việc xác định bệnh cũng như dự đoán những bệnh này.Trong những năm gần đây đã có rất nhiều kĩ thuật hiện đại ứng dụng để xác định hàm lượng axit uric như phương pháp huỳnh quang, phương pháp quang phổ, phương pháp hấp thụ mol phân tử, phương pháp enzim,... Phương pháp sắc kíký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một trong các phương pháp được nhiều nhà khoa học sử dụng trong phân tích dược phẩm nói riêng và phân tích nói chung với các ưu điểm nổi bật của phương pháp là có độ nhạy cao, tương đối chọn lọc với chất ta cần xác định. Việc nghiên cứu, xây dựng quy trình phân tích hàm lượng axit uric và ứng dụng quy trình phân tích đó vào xác định hàm lượng axit uric trong thực tế không những có ý nghĩa sâu sắc về mặt lý thuyết mà còn có ý nghĩa sâu sắc về mặt thực tế. Chính vì những lý do trên tôi quyết định chọn đề tài: “Nghiên cứu, xây dựng quy trình phân tích hàm lượng axit uric bằng phương pháp sắc kíký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và ứng dụng phân tích”.2. Mục đích nghiên cứu Xây dựng quy trình phân tích axit uric bằng phương pháp sắc kíký lỏng hiệu năng cao. Áp dụng phương pháp để thử nghiệm xác định hàm lượng axit uric trong mẫu nước tiểu của một số đối tượng. Đánh giá hàm lượng axit uric có trong nước tiểu của các đối tượng khác nhau, thông qua tiêu chuẩn kiểm nghiệm của Bộ Y Tế Bộ Y Tế để xét xem mức độ nguy hiểm của bệnh Gout đối với từng người, từng lứa tuổi..

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI

ĐẶNG THANH HUYỀN

NGHIÊN CỨU, XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG AXIT URIC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) VÀ ỨNG DỤNG PTHỬ NGHIỆM

TRONG PHÂN TÍCH

HỌ VÀ TÊN

( Tác giả luận văn)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI

ĐẶNG THANH HUYỀN

NGHIÊN CỨU, XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG AXIT URIC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) VÀ ỨNG DỤNG PHÂN TÍCH

HỌ VÀ TÊN

( Tác giả luận văn)

Lêi c¶m ¬n

Luận văn Thạc sĩ khoa học Hóa học này được hoàn thành tại phòng thí nghiệm

Pp hân tích Hóa – Sinh thuộc bộ môn Hóa Phân tích, khoa Hóa học, trường Đại học Sư phạm Hà Nội với sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của cô giáo, TS Vũ Thị Hương cùng các thầy, các cô trong bộ môn Hóa Phân tích cũng như các thầy, các cô trong khoa Hóa học, sự giúp đỡ của các anh chị học viên K21 khoa Hóa học trường Đại học Sư phạm Hà Nội.

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc em xin chân thành cảm ơn cô giáo, TS Vũ Thị Hương, người đã giao đề tài, tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ em hoàn thành luận văn Thạc sĩ này.

Em cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến các thầy, các cô trong Bộ môn Hóa Phân tích, các thầy, các cô trong khoa Hóa học – Trường Đại học Sư phạm

Hà Nội, các anh chị cùng toàn thể các bạn học viên – khoa Hóa học đã giúp đỡ, đóng góp ý kiến, tạo điều kiện thuận lợi, nhiệt tình giúp đỡ và động viên em trong suốt thời gian học tập và làm việc tại phòng thí nghiệm.

Cuối cùng em xin được gửi tới gia đình, người thân và bạn bè lời cảm ơn chân thành nhất đã giúp đỡ em thu nhập thông tin, tư liệu và động viên, khích lệ tinh thần em trong suốt thời gian qua.

Hà Nội, tháng 10 năm 2013

Tác giả

Đặng Thanh Huyền

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài .1

2 Mục đích nghiên cứu .2

3 Nhiệm vụ nghiên cứu .2

4 Phương pháp nghiên cứu .2

5 Kết quả đạt được .3

Error! Hyperlink reference not valid.Xây dựng thành công điều kiện sắc ký để phân tích xác định quy trình phân tích axit uric và ứng dụng quy trình để xác định hàm lượng axit uric trong mẫu nước tiểu của người 3

6 Những điểm mới của đề tài .3

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 4

1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ AXIT URIC 4

1.1.1 Thông tin chung .4

1.1.2 Tính chất vật lý .4

1.1.3 Trạng thái tồn tại, quá trình tổng hợp và đào thải của axit uric .5

1.1.4 Cơ chế lắng đọng của axit uric và ảnh hưởng của nó đối với cơ thể 6

1.1.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của axit uric trong viêm khớp .8

1.1.6 Các yếu tố ảnh hưởng tới việc phân tích và định lượng axit uric 10

1.2 TỔNG QUAN VỀ PH ƯƠ NG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 10

1.2.1 Khái niệm về sắc ký và sắc ký lỏng hiệu năng cao .101011

1.2.1.1 Khái niệm về sắc ký .10

1.2.1.2 Khái niệm về sắc ký lỏng hiệu năng cao .10

1.2.2 Nguyên tắc cấu tạo của máy HPLC .11

1.2.2.1 Hệ thống bơm .1211

1.2.2.2 Hệ bơm mẫu .12

1.2.2.3 Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao .12

1.2.2.4 Detector .13

1.2.2.5 Bộ phận ghi tín hiệu .14

1.2.3 Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký và các yếu tố ảnh hưởng15 1.2.3.1 Hệ số phân bố K (Partition coefficient) .15

1.2.3.2 Thời gian lưu tR (Retention time) .15

1.2.3.3 Hệ số dung lượng k’ .16

1.2.3.4 Hệ số chọn lọc α .16

1.2.3.5 Lý thuyết đĩa .17

1.2.4 Pha tĩnh trong HPLC .18

1.2.4.1 Phân loại pha tĩnh .18

1.2.4.2 Yêu cầu của pha tĩnh trong HPLC .19

1.2.5 Pha động trong HPLC .20

1.2.6 Chọn pH cho dung dịch đệm .21

1.2.7 Nguyên tắc lựa chọn pha tĩnh và pha động .21

1.2.8 Cách đánh giá pic .22

1.3 ỨNG DỤNG CỦA HPLC [8] 22

1.3.1 Định tính .22

1.3.2 Phân tích định lượng .23

1.3.3 Sắc ký điều chế .23

1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ TRONG PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG AXIT URIC [4,5] 24

1.4.1 Phương pháp quang phổ phân tử .24

1.4.1.1 Quang phổ hấp phụ UV-VIS .24

1.4.1.2 Quang phổ hồng ngoại .2625

1.4.2 Sơ lược về các phương pháp cực phổ và Von - Ampe .26

1.4.2.1 Nguyên tắc của phương pháp .26

1.4.2.2 Điện cực làm việc .27

1.4.2.3 Ưu điểm của điện cực giọt Hg .27

1.4.2.4 Điện cực so sánh .28

1.4.2.5 Sóng cực phổ khuếch tán .28

1.5 YÊU CẦU CỦA ĐỊNH LƯỢNG THUỐC TRONG KIỂM NGHIỆM DƯỢC PHẨM [1] 31

1.5.1 Tính đặc hiệu của phương pháp .31

1.5.2 Đường chuẩn và khoảng tuyến tính .32

1.5.3 Độ đúng .3332

1.5.4 Độ chính xác .33

1.5.5 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng .33

1.5.5.1 Giới hạn phát hiện ( LOD) .33

1.5.5.2 Giới hạn định lượng ( LOQ) .34

CHƯƠNG II: THỰC NGHIỆM 36

2.1 HÓA CHẤT, DỤNG CỤ 36

2.1.1 Hóa chất .36

2.1.2 Dụng cụ và thiết bị .36

2.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 36

2.3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37

2.3.1 Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký .38

2.3.1.1 Lựa chọn bước sóng hấp thụ cực đại .38

2.3.1.2 Khảo sát dung môi pha động 383840

2.3.1.3 Khảo sát tốc độ dòng 41

2.3.1.4 Khảo sát pH hệ đệm .39

2.3.1.5 Khảo sát pH hệ đệm 39

2.3.1.6 Khảo sát nồng độ dung dịch đệm .39

2.3.1.7 Khảo sát thời gian lưu .39

2.4 XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN 40

2.4.1 Chuẩn bị dung dịch mẫu chuẩn axit uric .40

2.4.2 Khảo sát tìm khoảng nồng độ axit uric tuyến tính với diện tích picc sắc ký 40

2.5 ĐÁNH GIÁ TÍNH THÍCH HỢP CỦA PHƯƠNG PHÁP VÀ KIỂM TRA ĐƯỜNG CHUẨN 41

2.5.1 Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký .41

2.5.2 Khảo sát độ lặp lại của phương pháp .41

2.5.3 Khảo sát độ đúng của phương pháp .41

2.5.4 Khảo sát độ tuyến tính của phương pháp .42

2.6 ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP HPLC VÀO ĐỊNH LƯỢNG AXIT URIC TRONG MẪU NƯỚC TIỂU 42

2.6.1 Xử lý nước tiểu .42

2.6.2 Phương pháp xử lý kết quả .43

2.6.2.1 Nguyên tắc xử lý kết quả .43

2.6.2.2 Cách xử lý .43

2.6.2.3 Kiểm tra đường chuẩn .45

CHƯƠNG III : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 46

3.1 Xây dựng điều kiện để định tính axit uric .46

3.1.1 Lựa chọn phương pháp sắc ký .46

3.1.1.1 Chọn bước sóng hấp thụ cực đại .46

3.1.1.2 Khảo sát thành phần pha động .47

3.1.1.3 Khảo sát tốc độ dòng .48

3.1.1.4 Khảo sát hệ đệm .49

3.1.1.5 Khảo sát pH hệ đệm .50

3.1.1.6 Khảo sát nồng độ dung dịch đệm .52

3.1.2 Đánh giá tính thích hợp của phương pháp và kiểm tra đường chuẩn định lượng 54

3.1.2.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn axit uric .54

3.1.2.2 Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký .54

3.1.2.3 Khảo sát độ lặp lại của phương pháp sắc ký .55

3.1.2.4 Khảo sát độ đúng của phương pháp .5655

3.1.2.5 Khảo sát độ tuyến tính của phương pháp .57

3.2 Ứng dụng phương pháp HPLC để xác định định tính và định lượng axit uric trong nước tiểu người nhằm phát hiện nguy cơ mắc bệnh Gout 61

Error! Hyperlink reference not valid.3.2.1.Nước tiểu 6161

3.2.1.Nước tiểu .616166

3.2.1.1 Kết quả phân tích hàm lượng axit uric trong nước tiểu ở lứa tuổi từ 18 - 30 tuổi .616166

3.2.1.2 Kết quả phân tích hàm lượng axit uric trong nước tiểu ở lứa tuổi từ 30 - 50 tuổi .69

3.2.1.2 Kết quả phân tích hàm lượng axit uric trong nước tiểu ở lứa tuổi ngoài 50 tuổi .72

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 6969

TÀI LIỆU THAM KHẢO 7171

PHỤ LỤC Error! Hyperlink reference not valid.PHỤ LỤC .100100

Von - AmpeĐẶNG THANH HUYỀN 1

NGHIÊN CỨU, XÂY DỰNG QUI TRÌNH PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG AXIT URIC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) VÀ ỨNG DỤNG PHÁT HIỆN NGUY CƠ MẮC BỆNH GOUT Ở NGƯỜI 1

HÀ NỘI - 2013 1

ĐẶNG THANH HUYỀN .2

NGHIÊN CỨU, XÂY DỰNG QUI TRÌNH PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG AXIT URIC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) VÀ ỨNG DỤNG PHÁT HIỆN NGUY CƠ MẮC BỆNH GOUT Ở NGƯỜI 2

HÀ NỘI - 2013 2

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT 8

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ 9

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU .10

MỞ ĐẦU .12

1 Lý do chọn đề tài .12

2 Mục đích nghiên cứu 13

3 Nhiệm vụ nghiên cứu 13

4 Phương pháp nghiên cứu .13

5 Kết quả đạt được .14

6 Những điểm mới của đề tài 14

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 15

1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ AXIT URIC 15

1.1.1 Thông tin chung 15

1.1.2 Tính chất vật lý .15

1.1.3 Trạng thái tồn tại, quá trình tổng hợp và đào thải của axit uric 16

1.1.4 Cơ chế lắng đọng của axit uric và ảnh hưởng của nó đối với cơ thể

17

1.1.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của axit uric trong viêm khớp 18 1.1.6 Các yếu tố ảnh hưởng tới việc phân tích và định lượng axit uric 21

1.2 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG

CAO 21

1.2.1.1 Khái niệm về sắc ký .21

1.2.1.2 Khái niệm về sắc ký lỏng hiệu năng cao 21

1.2.2 Nguyên tắc cấu tạo của máy HPLC 22

1.2.2.1 Hệ thống bơm .23

1.2.2.2 Hệ bơm mẫu .23

1.2.2.3 Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao .23

1.2.2.4 Detector .24

1.2.2.5 Bộ phận ghi tín hiệu .25

1.2.3 Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký và các yếu tố ảnh hưởng .26

1.2.3.1 Hệ số phân bố K (Partition coefficient) 26

1.2.3.2 Thời gian lưu t R (Retention time) .26

1.2.3.3 Hệ số dung lượng k’ .27

1.2.3.4 Hệ số chọn lọc α 27

1.2.3.5 Lý thuyết đĩa .28

1.2.4 Pha tĩnh trong HPLC .29

1.2.4.1 Phân loại pha tĩnh 30

1.2.4.2 Yêu cầu của pha tĩnh trong HPLC .30

1.2.5 Pha động trong HPLC 32

1.2.6 Chọn pH cho dung dịch đệm .33

1.2.7 Nguyên tắc lựa chọn pha tĩnh và pha động 33

1.2.8 Cách đánh giá píc 34

1.3 ỨNG DỤNG CỦA HPLC [8] 34

1.3.1 Định tính 34

1.3.2 Phân tích định lượng 34

1.3.3 Sắc ký điều chế 35

1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ TRONG PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG AXIT URIC [4,5] .35

1.4.1 Phương pháp quang phổ phân tử 35

1.4.1.1 Quang phổ hấp phụ UV-VIS .35

1.4.1.2 Quang phổ hồng ngoại .37

1.4.2 Sơ lược về các phương pháp cực phổ và von ampe .38

1.4.2.1 Nguyên tắc của phương pháp .38

1.4.2.2 Điện cực làm việc .39

1.4.2.3 Ưu điểm của điện cực giọt Hg .39

1.4.2.4 Điện cực so sánh .40

1.4.2.5 Sóng cực phổ khuếch tán .40

1.5 YÊU CẦU CỦA ĐỊNH LƯỢNG THUỐC TRONG KIỂM NGHIỆM DƯỢC PHẨM [1] 43

1.5.1 Tính đặc hiệu của phương pháp 43

1.5.2 Đường chuẩn và khoảng tuyến tính 44

1.5.3 Độ đúng 45

1.5.4 Độ chính xác 45

1.5.5 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng .45

1.5.5.1 Giới hạn phát hiện ( LOD) 45

1.5.5.2 Giới hạn định lượng ( LOQ) .46

CHƯƠNG II: THỰC NGHIỆM .48

2.1 HÓA CHẤT, DỤNG CỤ .48

2.1.1 Hóa chất .48

2.1.2 Dụng cụ và thiết bị 48

2.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU .48

2.3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 49

2.3.1 Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký .50

2.3.1.1 Khảo sát dung môi pha động 50

2.3.1.2 Khảo sát tốc độ dòng .50

2.3.1.3 Lựa chọn bước sóng .51

2.3.1.4 Khảo sát thời gian lưu của chất 51

2.3.1.5 Khảo sát lựa chọn hệ đệm .51

2.3.1.6 Khảo sát pH hệ đệm .52

2.3.1.7 Khảo sát nồng độ dung dịch đệm .52

2.4 XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN 52

2.4.1 Chuẩn bị dung dịch mẫu chuẩn axit uric .52

2.4.2 Khảo sát tìm khoảng nồng độ axit uric tuyến tính với diện tích píc sắc ký 53

2.5 ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP VÀ KIỂM TRA ĐƯỜNG CHUẨN 53 2.5.1 Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký 53

2.5.2 Khảo sát độ lặp lại của phương pháp 53

2.5.3 Khảo sát độ đúng của phương pháp .54

2.5.4 Khảo sát độ tuyến tính của phương pháp .55

2.6 ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP HPLC VÀO ĐỊNH LƯỢNG AXIT URIC TRONG MẪU NƯỚC TIỂU 55

2.6.1 Xử lý nước tiểu 55

2.6.2 Phương pháp xử lý kết quả 55

2.6.2.1 Nguyên tắc xử lý kết quả .55

2.6.2.2 Cách xử lý .56

2.6.2.3 Kiểm tra đường chuẩn .58

CHƯƠNG III : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 59

3.1 Xây dựng điều kiện để định tính axit uric 59

3.1.1 Lựa chọn phương pháp sắc ký .59

3.1.1.1 Chọn bước sóng cực đại 59

3.1.1.2 Khảo sát thành phần pha động .60

3.1.1.3 Lựa chọn tốc độ dòng 62

3.1.1.4 Khảo sát hệ đệm .63

3.1.1.5 Khảo sát pH đệm 64

3.1.1.6 Khảo sát nồng độ đệm .66

3.1.2 Đánh giá phương pháp định lượng .68

3.1.2.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn axit uric .68

3.1.2.2 Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký .68

3.1.2.3 Khảo sát độ lặp lại của phương pháp sắc ký .69

3.1.2.4 Khảo sát độ đúng của phương pháp 70

3.1.2.5 Khảo sát độ tuyến tính của phương pháp 71

3.2 Ứng dụng phương pháp HPLC để xác định định tính và định lượng axit uric trong nước tiểu người nhằm phát hiện nguy cơ mắc bệnh Gout

76

3.2.1.Nước tiểu .76

3.2.1.1 Kết quả phân tích mẫu ở lứa tuổi từ 18 - 35 tuổi 76

3.2.1.2 Kết quả phân tích mẫu ở lứa tuổi từ 35-60 tuổi 78

3.2.1.3 Kết quả phân tích mẫu ở lứa tuổi ngoài 60 tuổi 80

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 84

TÀI LIỆU THAM KHẢO 86

PHỤ LỤC 89

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI

ĐẶNG THANH

HUYỀN -& -TÊN ĐỀ TÀI:

NGHIÊN CỨU, XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG AXIT URIC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍKÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) VÀ ỨNG DỤNG PHÁT HIỆN NGUY CƠ MẮC BỆNH

Người hướng dẫn khoa học: TS Vũ Thị Hương

Họ và tên học viên : Đặng Thanh Huyền Giáo viên hướng dẫn : TS Vũ Thị Hương

Hà Nội -– 2013

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÍKÝ HIỆU VIẾT TẮT 4

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ 5

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU 6

MỞ ĐẦU 7

3 Nhiệm vụ nghiên cứu 8

4 Phương pháp nghiên cứu 8

5 Kết quả đạt được 9

6 Những điểm mới của đề tài 9

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 11

1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ AXIT URIC 11

1.1.1 Thông tin chung 11

1.1.2 Tính chất vật lý 11

1.1.3 Trạng thái tồn tại, quá trình tổng hợp và đào thải của axit uric 12

1.1.4 Cơ chế lắng đọng của axit uric và ảnh hưởng của nó đối với cơ thể13 1.1.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của axit uric trong viêm khớp 14

1.1.6 Các yếu tố ảnh hưởng tới việc phân tích và định lượng axit uric 16

1.2 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 17

1.2.1 Khái niệm về sắc ký và sắc ký lỏng hiệu năng cao 17

1.2.2 Nguyên tắc cấu tạo của máy HPLC 18

1.2.3 Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký và các yếu tố ảnh hưởng 22

1.2.4 Pha tĩnh trong HPLC 26

1.2.5 Pha động trong HPLC 28

1.2.6 Chọn pH cho dung dịch đệm 29

1.2.7 Nguyên tắc lựa chọn pha tĩnh và pha động 29

1.2.8 Cách đánh giá picpíc 30

1.3 ỨNG DỤNG CỦA HPLC 30

1.3.1 Định tính 30

1.3.2 Phân tích định lượng 31

1.3.4 Sắc ký điều chế 31

1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP HÓA LÝ TRONG PHÂN TÍCH HÀM LƯỢNG AXIT URIC 32

1.4.1 Phương pháp quang phổ phân tử 32

1.4.2 Sơ lược về các phương pháp cực phổ và von ampe 34

1.5 YÊU CẦU CỦA ĐỊNH LƯỢNG THUỐC TRONG KIỂM NGHIỆM DƯỢC PHẨM 41

1.5.1 Tính đặc hiệu của phương pháp 41

1.5.2 Đường chuẩn và khoảng tuyến tính 41

1.5.3 Độ đúng 42

1.5.4 Độ chính xác 42

1.5.5.Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 42

CHƯƠNG II: THỰC NGHIỆM 45

2.1 HÓA CHẤT, DỤNG CỤ 45

2.1.1 Hóa chất 45

2.1.2 Dụng cụ và thiết bị 45

2.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 45

2.3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 46

2.3.1 Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký 47

2.4 XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN 49

2.4.1 Chuẩn bị dung dịch mẫu chuẩn axit uric 49

2.4.2 Khảo sát tìm khoảng nồng độ axit uric tuyến tính với diện tích picpíc sắc ký 49

2.5 ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP VÀ KIỂM TRA ĐƯỜNG CHUẨN 50 2.5.1 Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký 50

2.5.2 Khảo sát độ lặp lại của phương pháp 50

2.5.3 Khảo sát độ đúng của phương pháp 51

2.5.4 Khảo sát độ tuyến tính của phương pháp 51

2.6 ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP HPLC VÀO ĐỊNH LƯỢNG AXIT URIC TRONG MẪU NƯỚC TIỂU 52

2.6.1 Xử lý nước tiểu 52

2.6.2 Phương pháp đo mẫu 52

2.7 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ KẾT QUẢ 52

2.7.1 Nguyên tắc xử lý kết quả 52

2.7.2 Cách xử lý 53

CHƯƠNG III : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 56

3.1 Xây dựng điều kiện để định tính axit uric 56

3.1.1 Lựa chọn phương pháp sắc ký 56

3.1.1.1 Chọn bước sóng cực đại 56

3.1.2 Đánh giá phương pháp định lượng 65

3.2 Ứng dụng phương pháp HPLC để xác định định tính và định lượng axit uric trong nước tiểu người nhằm phát hiện nguy cơ mắc bệnh Gout 72

3.2.1.Nước tiểu 72

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 74

TÀI LIỆU THAM KHẢO 75

PHỤ LỤC 76

DANH MỤC CÁC KÍKÝ HIỆU VIẾT TẮT

KíKý hiệu viết

tắt

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Sơ đồ sinh tổng hợp axit uric trong cơ thể người

Hình 1.2 Sơ đồ hoạt động của thiết bị HPLC

Hình 1.3 Sắc ký đồ của hai chất và các thông số đặc trưng

Hình 1.4 Sơ đồ thiết bị phân tích von-ampeVon-Ampe

Hình 3.11.6.Sắc đồ quét phổ của axit uric

Hình 3.21.7

Sắc đồ của axit uric với thành phần pha động gồm 60% methanol –30% nước cất – 10% acetronitril, tốc độ dòng là 0,5 ml/phút trongdung dịch đệm photphat pH = 3,2

Hình 3.3 Sắc đồ của axit uric trong dung dịch đệm photphat có pH=8

Hình 3.4 Sắc đồ của axit uric trong dung dịch đệm photphat nồng độ

0,01MHình 3.5 Sự phụ thuộc Spícpic axit uric vào nồng độ axit uric

Hình 3.6 Biểu đồ kết quả phân tích nồng độ axit uric có trong nước tiểu

người ở độ tuổi từ 18 – 30 tuổi

Hình 3.7 Biểu đồ kết quả phân tích nồng độ axit uric có trong nước tiểu

người ở độ tuổi từ 30 – 50 tuổi

Hình 3.8 Biểu đồ kết quả phân tích nồng độ axit uric có trong nước tiểu

người ở độ tuổi ngoài 50 tuổi

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1 Các chỉ số axit với các cảnh báo về mức độ của bệnh Gout

Bảng 1.2 Độ nhạy của các loại detector

Bảng 1.3 Vài ví dụ về pha tĩnh trong HPLC

Bảng 2.1 Hàm lượng phần trăm thành phần các chất có trong nước tiểu

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của thành phần pha động tới chiều cao và diện tích

pícpic của axit uricBảng 3.2 Ảnh hưởng của tốc độ dòng tới chiều cao và diện tích pícpic của

axit uricBảng 3.3 Ảnh hưởng của dung dịch đệm đến thời gian lưu, diện tích

pícpic của axit uricBảng 3.4 Ảnh hưởng của pH của dung dịch đệm photphat đến diện tích

pícpic của axit uricBảng 3.5 Ảnh hưởng của pH của dung dịch đệm photphat quanh giá trị

pH=8 đến diện tích pícpic của axit uricBảng 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch đệm photphat đến diện tích

pícpic của axit uricBảng 3.7 Ảnh hưởng của thời gian lưu đến nồng độ và diện tích pic của

axit uricBảng 3.8 Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký đối với axit

uricBảng 3.9 Kết quả kiểm tra độ lặp lại của phương pháp sắc ký

Bảng 3.10 Kết quả xác định độ đúng của axit uric trên thiết bị

sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)Bảng 3.11 Sự phụ thuộc diện tích pícpic của axit uric vào nồng độ

Bảng 3.12 Bảng đánh giá độ chính xác của đường chuẩn

Bảng 3.13 Kết quả phân tích hàm lượng axit uric trong nước tiểu ở lứa tuổi

từ 18 - 30 tuổi

Bảng 3.14 Kết quả phân tích hàm lượng axit uric trong nước tiểu ở lứa tuổi

từ 30 – 50 tuổiBảng 3.15 Kết quả phân tích hàm lượng axit uric trong nước tiểu ở lứa tuổi

ngoài 50 tuổi

MỞ ĐẦU

Axit uric là một hợp chất dị vòng chứa cacbon, nitơ, oxi và hiđro có công thứcphân tử là C5H4N4O3 Axit uric là sản phẩm cuối cùng của quá trình chuyển hóapurine nucleotit Trong cơ thể người và động vật, axit uric được đào thải qua

trình tổng hợp axit uric hoặc do chức năng suy thận giảm khiến quá trình đào thảiaxit uric không hoàn toàn làm tăng hàm lượng axit uric trong máu Khi hàmlượng axit uric trong máu tăng dẫn đến một số bệnh của viêm khớp gọi là bệnhGut (bệnh Gout) Các hạt lắng đọng xung quanh các khớp dẫn đến hậu quả sưngviêm và đau khớp, bên cạnh đó, một số lắng đọng tại thận là nguyên nhân gâybệnh sỏi thận

Nồng độ axit uric trong nước tiểu và trong huyết thanh quá cao sẽ được tìm thấytrong các bệnh nhân mắc một số bệnh như bệnh Gout, sỏi thận, tim mạch, tiểuđường loại 2 Nếu nồng độ axit uric trong huyết tương quá thấp gây nên bệnh đa

xơ cứng ở ngoài Do đó việc xác định hàm lượng của axit uric trong cơ thể người

có nghĩa vô cùng quan trọng trong việc xác định bệnh cũng như dự đoán nhữngbệnh này

Trong những năm gần đây đã có rất nhiều kĩ thuật hiện đại ứng dụng để xác địnhhàm lượng axit uric như phương pháp huỳnh quang, phương pháp quang phổ,

lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một trong các phương pháp được nhiều nhà khoahọc sử dụng trong phân tích dược phẩm nói riêng và phân tích nói chung với các

ưu điểm nổi bật của phương pháp là có độ nhạy cao, tương đối chọn lọc với chất

ta cần xác định Việc nghiên cứu, xây dựng quy trình phân tích hàm lượng axituric và ứng dụng quy trình phân tích đó vào xác định hàm lượng axit uric trongthực tế không những có ý nghĩa sâu sắc về mặt lý thuyết mà còn có ý nghĩa sâu

sắc về mặt thực tế Chính vì những lý do trên tôi quyết định chọn đề tài: “Nghiên

2 Mục đích nghiên cứu

- - Xây dựng quy trình phân tích axit uric bằng phương pháp sắc kíký

lỏng hiệu năng cao

trong mẫu nước tiểu của một số đối tượng

khác nhau, thông qua tiêu chuẩn kiểm nghiệm của Bộ Y Tế Bộ Y Tế để xétxem mức độ nguy hiểm của bệnh Gout đối với từng người, từng lứa tuổi

3 Nhiệm vụ nghiên cứu

uric bằng phương pháp vừa xây dựng

nước tiểu của các đối tượng khác nhau, thông qua tiêu chuẩn kiểm nghiệm

của Bộ Y Tế để xét xem mức độ nguy hiểm của bệnh Gout đối với từngngười, từng lứa tuổi

4 Phương pháp nghiên cứu

- - Áp dụng phương pháp thực nghiệm vào nghiên cứu gồm hai nội dung lànghiên cứu cơ bản và ứng dụng lấy mẫu thật để phân tích đánh giá.

- - Xây dựng chương trình sắc ký định tính và định lượng axit uric, đểxây dựng chương trình sắc ký thích hợp Các điều kiện sau được tiến hànhkhảo sát:

+ Kiểu sắc ký áp dụng

Cột tách sử dụng

+ Bước sóng thích hợp phát hiện axit uric

+ Các điều kiện về pha động (thành phần, tỷ lệ, tốc độ dòng) để thuđược tín hiệu tốt nhất.cho kết quả tách tốt nhất

được tiến hành:

+ Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký

+ Khảo sát độ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích picpícpic thuđược

+ Khảo sát độ chính xác của phương pháp

+ Khảo sát độ đúng của phương pháp

Thông qua việc xử lý thống kê các kết quả thực nghiệm để đánh giá

chương trình sắc ký đã xây dựng (Đánh giá cái gì???)

+ Ứng dụng quy trìnhchương trình sắc ký đã xây dựng để

y dựng, định tính và định lượng bằng phương pháp đường chuẩnxử lý cácmẫu thật (Ứng dụng để làm gì)

5 Kết quả đạt được

Đã tìm được phương pháp thích hợp để phân tích axit uric với cácđiều kiện tối ưu, từ đó ứng dụng để xác định hàm lượng axit uric trong mẫunước tiểu

Xây dựng thành công điều kiện sắc ký để phân tích xác định quy trình phân tích axit uric và ứng dụng quy trình để xác định hàm lượng axit uric trong mẫu nước tiểu của người (Phần này sẽ viết lại sau khi kết thúc các thí nghiệm)

6 Những điểm mới của đề tài

- Đã ứng dụng phương pháp HPLC là một trong những phương pháphiện đại nhất hiện nay trong phân tích và kiểm nghiệm để nghiên cứu xây dựng

quyi trình phân tích hàm lượng axit uric

- Xây dựng được quy trìnhphương pháp định lượng ổn định, chính xác

sắc ký lỏng hiệu năng cao

không rõ ràng)

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ AXIT URIC

1.1.1 Thông tin chung

1a Công thức phân tử: C5H4N3O3

2b Công thức cấu tạo:

3c Tên khoa học: 7,9 – - dihidro–purine 2,6,8 trione hay 2,6,8 –trioxypurine [2] [3]

4d Khối lượng phân tửLPT: 168,1103 g/mol

1.1.2 Tính chất vật lý

- Là tinh thể màu trắng, nhiệt độ nóng chảy là 300C

- Độ tan trong nước là 60 mg/l (ở 200 C C), độ tan trong etanol rất thấp

và được coi là không đáng kể

- Giới hạn hoà tan của muối uraturate khoảng 6,8 mg/dl ở nhiệt độ

370 CC Ở nồng độ cao hơn các tinh thể uraturatee sẽ bị kết tủa Tuy nhiên,trong một số trường hợp các tinh thể uraturate có trong huyết thanh không bịkết tủa [20]

- Trong nước tiểu, axit uric hòa tan dễ dàng hơn trong nước, pH củanước tiểu ảnh hưởng lớn đến sự hòa tan axit uric, bình thường lượng axit uric

thải qua nước tiểu là trên 800 mg/ngày Do vậy, pH càng kiềm càng thuận lợicho việc thải axit uric và ngược lại nước tiểu càng có môi trường axit thì khókhăn cho việc đào thải axit uric [20].

- pH = 5,0: Axit uric bão hòa với nồng độ từ 390-900 μmol/L.mol/L

- pH= 7,0: Axit uric bão hòa với nồng độ từ 9480-12000 μmol/L.mol/L

1.1.3 Trạng thái tồn tại, quá trình tổng hợp và đào thải của axit uric

- Axit uric là một hợp chất khác vòng của cacbon, nito, oxi, và hydrovới công thức C5H4N4O3 Là một axit yếu nên thường bị ion hóa thành muối

uraturatee hòa tan trong huyết tương Đại đa số tồn tại dưới dạng monosodium uraturatee [20] Axit uric kết tủa trong môi trường pH axit

- Axit uric là một chất có nguồn gốc từ quá trình dị hóa các bazơ purin(ademin và guanidin) của các axit nucleic

- Các nguồn gốc chính tạo axit uric trong cơ thể bao gồm:

a Các thức ăn chứa purin (100 – 200 mg/ngày)

b Từ nguồn axit uric nội sinh do quá trình thoái biến các axit nucleic của cơthể (600 mg/ngày)

7

Ribose-5p + ATP PRPP + Glutamin

5

7

4 1

3

Hình 1.1 Sơ đồ sinh tổng hợp axit uric trong cơ thể người

1: Amidophoribosyl ferase

2: Hypoxanthine- Guanine phospho ribosyl Transferase

3: Phosphoribosyl-Pyrophosphat Synthetase- (PRPP Synthetase)

- Axit uric được tạo thành trong cơ thể do quá trình thoái giáng cácnhân purin, sau đó chúng được hòa tan trong máu và đưa đến thận và thải rangoài qua nước tiểu Axit uric tăng có thể do quá trình tăng cung cấp, tăng tạohoặc giảm thải trừ axit uric qua thận hoặc cả hai quá trình này

- Các con đường thải trừ chính của axit uric trong cơ thể gồm:

a Qua nước tiểu (400 – 1000 mg/ngày): Ở thận, axit uric được lọc quacầu thận, 95% lượng lọc được tái hấp thu ở các ống lượn gần, rồi được bàixuất tích cực ở các ống lượn xa

b Qua đường tiêu hóa (100 – 200 mg/ngày): Mặc dù đây là con đườngthải trừ chủ yếu, tuy vậy có thể thấy axit uric trong mật, dịch vị và các dịchtiết của ruột [21] [1].

1.1.4 Cơ chế lắng đọng của axit uric và ảnh hưởng của nó đối với cơ thể

Phần lớn axit uric trong máu ở dạng tự do, chỉ khoảng < 4% gắn vớiprotein huyết thanh Nồng độ axit uric máu trung bình ở :

Nam: 5,1 ± 1,0 mg/dl (420 μmol/L.mol/lít)

Nữ: 4,0 ± 1mg/dl (360 μmol/L.mol/lít)

Bình thường quá trình tổng hợp và bài tiết axit uric ở trạng thái cân bằng.Tổng lượng axit uric trong cơ thể có khoảng 1200 mg (ở nam) và 600 mg (ởnữ) Khoảng 2/3 tổng lượng axit uric được tổng hợp mới và cũng với sốlượng tương tự đào thải chủ yếu qua thận Khi nồng độ axit uric máu vượtqua giới hạn trên được coi là có tăng axit uric hay chính là có sự lắng đọng axituric [201,21]

Cơ chế lắng đọng axit uric trong cơ thể chủ yếu là do tăng axit uric máukéo dài, cơ thể có hàng loạt phản ứng thích nghi nhằm giảm axit uric trong máubằng cách: tăng bài tiết qua thận,; lắng đọng muối uraturate trong các tổ chức nhưmàng hoạt dịch, da, kẽ thận, gân, tTừ đó dẫn đến sự biến đổi về hình thái họccủa các tổ chức này Tăng axit uric trong dịch khớp dẫn đến kết tủa thành các tinhthể hình kim gây tổn thương sụn, màng hoạt dịch và bao khớp Qua chỗ sụn bịtổn thương các tinh thể xâm nhập xuống tận lớp xương dưới sụn, hình thành cáchạt tophi, gây phá huỷ xương dưới dạng ổ khuyết xương hình cầu Viêm mànghoạt dịch, tăng sinh màng hoạt dịch, thâm nhiễm các tế bào lympho là tổn thươngthứ phát Sự lắng đọng các tinh thể ở tổ chức tạo thành các hạt tophi kíkích thước

to nhỏ khác nhau, lắng đọng ở kẽ thận dẫn đến tổn thương thận như sỏi thận,viêm thận kẽ, xơ hóa cầu thận Tổn thương lan rộng dẫn đến suy thận, tăng huyết

áp Từ đó có thể thấy, sự lắng đọng axit uric là yếu tố tiên lượng quan trọng [20]

Có tình trạng gây nên một quay vòng tế bào (turnover) nhanh hoặc gây chậm trễbài tiết axit uric của thận có thể gây tăng nồng độ axit uric huyết thanh Lượngaxit uric trong nước tiểu tăng quá mức có thể gây kết tủa và hình thành sỏi

uraturate trong hệ tiết niệu Các nguyên nhân gây tích tụ axit uric trong cơ thểthường gặp nhất là cơ địa di truyền với khuynh hướng gây tăng sản xuất quá mứcaxit uric và suy giảm chức năng thận gây giảm khả năng bài tiết axit uric Mặtkhác, khi nồng độ axit uric trong cơ thể quá thấp gây nên bệnh đa xơ cứng ởngười

1.1.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của axit uric trong viêm khớp

- Axit uric tăng cao: Nguyên nhân chính gây bệnh Gout

Khả năng hòa tan của axit uric là đóng vai trò quan trọng là nguyênnhân gây bệnh Gout Độ tan trong nước của các muối được hình thành từ axituric với kim loại kiềm và kiềm thổ là khá thấp Tất cả các muối này thể hiệntính tan tốt trong nước nóng hơn là nước lạnh, do đó cho phép kết tinh lại dễdàng Khả năng hòa tan thấp này là một nguyên nhân gây nên bệnh Gout Nóthể hiện ở việc tăng quá mức nồng độ axit trong huyết thanh có thể gây tìnhtrạng lắng đọng chất này tại các khớp và mô mềm gây bệnh Gout (một tìnhtrạng đáp ứng viêm đối với sự lắng đọng của các tinh thể uraturate)

Có thể nói, chỉ số axit uric là chỉ số quyết định trong việc chẩn đoánmột bệnh nhân có bị bệnh Gout hay không và mức độ nguy hiểm của bệnhđang ở giai đoạn nào Axit uric là sản phẩm chuyển hóa của chất đạm có nhânpurin Chất đạm có nhân purin được tìm thấy nhiều trong một số loại thựcphẩm và đồ uống như phủ tạng động vật, cá biển, đậu Hà Lan, bia, rượu,…

Như đã phân tích ở trên, axit uric được thận đào thải qua đường nướctiểu nhưng do chúng ta ăn các đồ ăn nhiều đạm, uống nhiều bia rượu khiếntăng tổng hợp axit uric hoặc do chức năng của thận suy giảm khiến giảm đàothải axit uric làm cho lượng axit uric trong máu tăng cao Ban đầu, nồng độaxit uric trong máu tăng cao tuy nhiên chưa xuất hiện các triệu chứng, chưaxuất hiện các cơn Gout cấp, giai đoạn này thường gọi là “tăng axit uric máu”,chưa phải Gout Tuy nhiên, khi lượng axit uric trong máu tăng cao kéo dài sẽlắng đọng tinh thể uraturate ở các khớp gây ra các đợt viêm khớp cấp hay còngọi là cơn Gout cấp, khi đó tăng axit uric máu đã tiến triển thành bệnh Gout[20]

Chỉ số axit uric phải là một con số chính xác không phải là một kết quảđịnh tính như cao, bình thường, hay thấp Bởi vì mỗi mức chỉ số axit uric mô tảtình trạng bệnh của bệnh nhân Gout đang ở mức độ nguy hiểm nào Tuy nhiên,mỗi cơ sở khám chữa bệnh đều dùng những loại máy của riêng mình và cho kếtquả ở những đơn vị đo lường khác nhau khiến cho các bệnh nhân khó hiểu trongquá trình theo dõi tiến triển của bệnh Bệnh nhân có thể dựa vào chỉ số axit uricđược chỉ ra ở bảng 1.1 dưới đây để xác định mức độ diễn biến của bệnh Gout

Bảng 1.1 Các chỉ số axit với các cảnh báo về mức độ của bệnh Gout

<60 <350

Tốt: Ở mức độ này sẽ không cho hình thành các tinh thể

uraturate và giải phóng các tinh thể uraturate lắng đọng ởkhớp

60-70 350-400Cảnh báo: Xuất hiện một vài biểu hiện như tê, ngứa và đỏ da,

hoặc các triệu chứng thông thường của bệnh Gout.gút

>70 >400

các tinh thể uraturate lắng đọng không được giải phóng tạonên các cục tophy (tophi) Tình trạng ngày càng xấu

Bảng 1.1: Các chỉ số axit với các cảnh báo về mức độ của bệnh Gout

Từ đó có thể thấy, chỉ số axit uric nên được duy trì ở mức dưới 60 mg/dl đểtránh những diễn biến theo chiều hướng xấu của bệnh Gout bằng cách trong quátrình điều trị, ngoài dùng thuốc theo chỉ định, bệnh nhân Gout cần chú ý cả việc

ăn kiêng và tăng cường chức năng của thận để duy trì lượng axit uric trongngưỡng cho phép

1.1.6 Các yếu tố ảnh hưởng tới việc phân tích và định lượng axit uric

- Các thuốc có thể làm tăng nồng độ axit uric máu là:

Adrenalin, acetaminophon, ampicpicllin, axit ascorbic, thuốc chặn bêtagiao cảm, caffein, các hóa chất điều trị ung thư, ciclosporin, diltiazem, thuốc lợitiểu, nhóm THIAZID, G-CSF, isoniazid, levodoba, lisinoprin, methyldopa,niacin, thuốc kháng viêm không phải Steroid, phenothiazin, risampin

- Các thuốc có thể làm giảm nồng độ axit uric máu là:

Acetazolamid, allopurinol, corticosteroid, analapril, estrogen, lithium,mannitol, probenecid, salicylat,…

Vì vậy mà khi nghiên cứu cũng như theo dõi nồng độ axit uric trong cơ thểngười cần chú ý tới những ảnh hưởng trên [211]

1.2 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

1.2.1.1 Khái niệm về sắc ký

Sắc ký là môt nhóm các phương pháp hóa lý dùng để tách các thànhphần của một hỗn hợp Sự tách sắc ký được dựa trên sự phân chia khác nhauvào hai pha luôn tiếp xúc và không hòa lẫn vào nhau: một pha tĩnh và mộtpha động

1.2.1.2 Khái niệm về sắc ký lỏng hiệu năng cao

HPLC (High performance liquid chromatoghraphy) là một phương pháphóa lý dựa vào ái lực khác nhau của các chất khác nhau giữa hai pha luôn tiếp xúc

và không đồng tan với nhau Pha động là chất lỏng chảy qua cột với một tốc độnhất định dưới áp suất cao, còn pha tĩnh là chất rắn dưới dạng hạt mịn hoặc chấtlỏng được bao trên một chất mang rắn, hoặc một chất mang rắn đã được liên kếthóa học với các nhóm hữu cơ Pha động cùng với mẫu thử được bơm qua cộtdưới áp suất cao, các chất phân tích sẽ di chuyển theo pha động qua cột với tốc độkhác nhau tùy theo ái lực của chúng với hai pha và dẫn đến sự tách các chất Cácchất sau khi ra khỏi cột được nhận biết bởi bộ phận phát hiện là detector Quátrình sắc ký dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay rây phân tử là tùythuộc loại pha tĩnh sử dụng

1.2.2 Nguyên tắc cấu tạo của máy HPLC

Do bản chất hóa học của chất phân tích khác nhau nên có nhiều kỹ thuật đểtách định lượng bằng sắc ký lỏng Tuy vậy, nguyên tắc cấu tạo của một máy sắc

ký lỏng đều giống nhau, có cùng một số bộ phận kết nối với nhau, được thể hiện

ở hình 1.2:

Hình 1 2.2: Sơ đồ hoạt động của thiết bị HPLC

Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao gồm các bộ phận sau: Bình chứa pha động,bơm đẩy pha động qua hệ thống sắc ký ở áp suất cao, hệ bơm mẫu để đưa mẫu vàopha động, cột sắc ký, detector, máy tính hay máy phân tích hoặc máy ghi

1.2.2.1 Hệ thống bơm

Hệ thống bơm của HPLC là “bơm cao áp” có nhiệm vụ bơm pha động qua

cột tách với tốc độ xác định phục vụ quá trình rửa giải các chất ra khỏi cột sắc ký,

nó phải có độ ổn định và lặp lại cao của tốc độ bơm Có bơm 1 kênh, có bơm 2kênh song song hoặc 2 kênh nối tiếp và làm việc trong vùng có áp suất từ 0 - 400bar, nhưng bơm 2 kênh cho độ ổn định hơn

Hệ bơm hiện đại này được điều khiển bằng máy tính có thể lập trương trình

để thay đổi tỷ lệ của thành phần pha động theo yêu cầu (sắc ký gradient)

Bơm HPLC cần phải đáp ứng một số yêu cầu sau:

- Tạo được áp suất cao 3000 -6000 psi (250 -500 atm)

- Không bị ăn mòn với các thành phần pha động

- Có tốc độ bơm không đổi

1.2.2.2 Hệ bơm mẫu

Để đưa mẫu vào cột có thể bơm mẫu bằng tay hay bơm mẫu bằng hệ bơmmẫu tự động Thể tích bơm được xác định nhờ vòng chứa mẫu (bơm tay) haytrong hệ bơm mẫu tự động Sai số bơm mẫu dùng van khoảng 0,5%

1.2.2.3 Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao

Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao thường được chế tạo bằng thép không gỉ,thủy tinh hoặc chất dẻo có chiều dài 10 -30 cm, đường kíkính trong 4 ÷ 10 mm.Thường có cột nhồi và cột bảo vệ

Cột nhồi thường có hạt cỡ 5 ÷ 10 µm Gần đây có loại cột nhỏ với đường

kíkính trong 1 ÷ 2 mm, dài 3 ÷ 7,5 cm Cột có thể được làm nóng để đạt hiệu quảphân tách tốt hơn, nhưng hiếm khi tiến hành ở nhiệt độ trên 600C vì nhiệt độ cóthể làm suy giảm hiệu lực cột hoặc làm pha động bay hơi

Chất nhồi cột thường là Silicagel có bao một lớp mỏng chất hữu cơ (hoặcliên kết hóa học với một chất hữu cơ) Bên cạnh Silicagel người ta còn dùngnhững hạt khác: nhôm oxit, polyme xốp, chất trao đổi ion

Cột bảo vệ được đặt trước cột sắc ký để loại các chất có mặt trong pha động

và trong mẫu phân tích làm giảm tuổi thọ của cột

- Khoảng hoạt động tuyến tính rộng

- Ít thay đổi theo nhiệt độ và tốc độ dòng

Các loại detector được dùng phổ biến là:

- Sự hấp thụ quang phân tử vùng UV-VIS

Detector tử ngoại (UV) dùng đèn thủy ngân cho các vạch 254 nm và

280 nm (chủ yếu 254 nm) Loại này được sử dụng chủ yếu trong quá trìnhtiến hành do các hợp chất hữu cơ độc hại chứa vòng thơm thường hấp thụ ởbước sóng 275 nm

Các loại detector được dùng phổ biến là:

- Sự hấp thụ quang phân tử vùng UV-VIS

Detector tử ngoại (UV) dùng đèn thuỷ ngân cho các vạch 254 nm và 280 nm (chủyếu là 254 nm) Loại này được sử dụng chủ yếu trong quá trình tiến hành do cáchợp chất hữu cơ độc hại chứa vòng thơm thường hấp thụ ở bước sóng 275 nm

Detector khả kiến (đèn Deuterium) và khả kiến (đèn Vonfram) có thể làm việc ở

bước sóng tuỳ ý chọn theo tính chất hấp thụ ánh sáng của chất muốn phát hiện.Loại này hiện nay được dùng nhiều nhất

- Sự hấp thụ hay phát xạ của nguyên tử

- Tính chất phát huỳnh quang của nguyên tử hay phân tử

- Detector đo chỉ số khúc xạ (RI) là detector vạn năng nhưng kém nhạy

- Bộ dẫn nhiệt của các chất

- Sự biến thiên dòng điện giữa 2 điện cực

- Độ dẫn điện của chất

- Sự biến thiên chiết suất của dung dịch mẫu

Nhưng dù loại nào nó cũng phải đạt được những yêu cầu nhất định và cứứng với mỗi loại tính chất đó thì ta có một loại detector Ví dụ như: detector phổ

hấp thụ phân tử UV-VIS (190-1000 nm), detector huỳnh quang, detector đo độ

dẫn điện của dung dịch Độ nhạy của các loại detertor được ghi trong bảng 1.2

Bảng 1.2 Độ nhạy của các loại detertor