3.1 Xây dựng điều kiện để định tính axit uric .1 Lựa chọn phương pháp sắc ký
3.1.2. Đánh giá phương pháp định lượng 1. Chuẩn bị dung dịch chuẩn axit uric
Cân chính xác 5mg chất chuẩn axit uric, sau đó thêm đệm photphat (pH=8) vào bình định mức 100ml và lắc sau đó định mức đến vạch định mức thu được dung dịch axit uric chuẩn có nồng độ chính xác.
3.1.2.2. Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký
Để đánh giá một phép định lượng bằng HPLC mới xây dựng, trước hết ta phải tiến hành khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký.
Việc khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký được tiến hành qua việc tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn axit uric đã được chuẩn bị như 3.1.2.1. Ghi lại các giá trị về thời gian lưu (đại lượng có giá trị định tính axit uric), diện tích píc (đại lượng có giá trị định lượng axit uric), độ phân giải giữa hai píc. Kết luận về tính thích hợp của hệ thống sắc ký dựa trên các giá trị độ lệch chuẩn tương đối về tR,
Spíc, RS. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống HPLC được trình bày ở bảng
3.7.
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký đối với axit uric
STT tpíc (phút) Spíc(mAU)
1 3,936 5019757
2 3,938 4978767
3 3,941 4886695
4 3,935 4973555
5 3,941 5009479
6 3,933 4998732
Giá trị
trung bình 3,937 4977830
Độ lệch chuẩn tương đối
X 100 (%) S
RSD = ì 0,082 0,964
3.1.2.3. Khảo sát độ lặp lại của phương pháp sắc ký
Tiến hành phân tích ở 3 mức nồng độ (nhỏ, trung bình và lớn). Ở mỗi mức nồng độ tiến hành đo 3 lần, khảo sát độ lặp lại của diện tích píc. Đánh giá độ phân tán của số liệu dựa vào giá trị độ lệch chuẩn SD và độ lệch chuẩn tương đối RSD (%). Kết quả khảo sát độ lặp được thể hiện trong bảng 3.8.
Bảng 3.8. Kết quả kiểm tra độ lặp lại của phương pháp sắc ký
Mức độ nồng độ thực (mg/l)
Thấp: 0,2 Trung bình:
33 Cao: 44
Diện tích píc (Sp)
1 98930 3552880 4683461
2 98866 3561927 4689829
3 98879 3552614 4635967
4 98797 3542352 4694109
5 98901 3534618 4694966
Diện tích píc trung bình (Sp) 98874 3548878 4679666 Độ lệch chuẩn S 49,702 10561,561 24849,454 Độ lệch chuẩn tương đối
X 100 (%) S
RSD = ì 0,050 0,298 0,531
3.1.2.4. Khảo sát độ đúng của phương pháp
Độ đúng của một phương pháp phân tích là mức độ sát gần của các giá trị tìm thấy trong phân tích so với giá trị thực.
Độ đúng của phương pháp được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn
(thêm khoảng 20% mẫu thử). Thêm vào mẫu thử một lượng chất chuẩn sao cho tổng nồng độ của chúng vẫn nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát. Tiến hành sắc ký dung dịch chuẩn, dung dịch thử và dung dịch thêm chuẩn, dựa vào diện tích píc của các dung dịch này tính tỷ lệ thu hồi lượng chất chuẩn thêm vào.
Đem đo trên thiết bị sắc ký hiệu năng cao (HPLC) trong cùng điều kiện với dung dịch chuẩn, lặp lại thực nghiệm 5 lần. Mỗi lần bơm vào cột sắc ký chúng tôi đều dùng xilanh lấy chính xác 10 μl.
Dựa vào hàm lượng các chất đã biết trong mẫu thử, lượng các chất chuẩn thêm vào và căn cứ vào diện tích píc của dung dịch thử và dung dịch chuẩn sẽ tính được lượng các chất chuẩn tìm thấy so với lượng chuẩn thêm vào. Kết quả khảo sát độ đúng được trình bày ở bảng 3.9.
Bảng 3.9. Kết quả xác định độ đúng của axit uric trên thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Nồng độ chuẩn thêm vào nền
(mg/l)
Số mẫuNồng độ chuẩn tìm lại (mg/l)
Nồng độ tìm lại trung bình (đường chuẩn)
Độ lệch chuẩn tương đối
X 100 (%) S
RSD = ì
Hệ số thu hồi H (%)
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
( Phần này em khảo sát chưa ra kết quả nên em gửi Cô sau ạ)
3.1.2.5. Khảo sát độ tuyến tính của phương pháp a. Xây dựng đường chuẩn của axit uric
Cách tiến hành:
Chuẩn bị một dãy bình định mức dung tích V ml để pha được dung dịch có nồng độ tăng từ 2.10 -4 mg/l đến 0,05mg/l. Sau đó lần lượt bơm 10μl từng dung dịch mẫu axit uric chuẩn vào hệ thống đo của thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao,
đặt các điều kiện tối ưu cho máy chạy, ứng với thời gian lưu của axit uric thì máy tự động hiện trên màn hình diện tích píc (Spíc ), ghi kết qủa. Các kết qủa thu được thể hiện trong bảng 3.10.
Bảng 3.10. Sự phụ thuộc diện tích píc của axit uric vào nồng độ
STT Chất chuẩn Caxit uric(mg/l) Spíc
1 C1 0,2 98868
2 C2 0,4 93568
3 C3 2 326321
4 C4 5 586937
5 C5 10 1152718
6 C6 25 2675070
7 C7 50 5245475
píc= (103324,26844±609,57518).Caxit uric +(87304,24897±13143,17752) ( 3.1) Hệ số tương quan R=0,99979
Sau khi thu được số liệu trong bảng 3.10 tôi thể hiện sự phụ thuộc nồng độ của axit uric vào diện tích píc tương ứng của chúng trên phần mềm Origin 8.0. Từ đó tôi thu được phương trình đường chuẩn của axit uric với độ tin cậy cao như hình 3.5.
0 10 20 30 40 50 0
1000000 2000000 3000000 4000000 5000000 6000000
B
B
B
Linear Fit of B
Equation y = a + b*x Adj. R-Square 0,99979
Value Standard Error
B Intercept 87304,24897 13143,17752
B Slope 103324,26844 609,57518
Hình 3.5. Sự phụ thuộc Spíc axit uric vào nồng độ axit uric Sp = (b ± Sb.t∝,k ) .Caxit uric + (a ± Sa.t∝,k )
Xử lý thống kê theo phần mềm Origin 8.0 được phương trình đường chuẩn:
Spíc= (103324,26844±609,57518).Caxit uric +(87304,24897±13143,17752)
Từ phương trình đường chuẩn này nếu đo được diện tích píc rất dễ ràng tính được nồng độ axit uric tương ứng với diện tích píc sắc ký:
( )
57518 , 609 26844
, 103324
17752 , 13143 24897
, 87304
±
±
= pic −
axituric
C S (mg/l)
Nhận xét:
Các kết quả trên cho thấy: với khoảng nồng độ của axit uric biến thiên trong khoảng 0,2 mg/l đến 50 mg/l có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích píc tương ứng, thể hiện qua đường thẳng hồi qui và hệ số tương quan R
= 0,99979. Với hệ số tương quan đều rất gần 1, hầu hết các giá trị đo được nằm trên đường hồi qui hoặc phân bố đều cả hai phía của đường hồi qui. Trên cơ sở
đó, tôi lựa chọn nồng độ để định lượng axit uric và nước tiểu nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát.
Mặt khác tôi xử lý thống kê phương trình đường chuẩn bằng phưong pháp hồi quy tuyến tính đã được lập trình theo ngôn ngữ Pascal (xem phụ lục 1) các kết quả thu được tương tự như ứng dụng phần mềm Origin 8.0, nhưng có thêm:
SSp = 13143,17752; Sa =609,57518; Sb =27459,54705
- Tính giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng theo đường chuẩn:
- Giới hạn phát hiện: 0,381
26844 ,
103324
17752 , 13143 .
3
3 = =
= b
LOD SY (mg/l)
Trong đó Sy= SSp, b là hệ số của phương trình đường chuẩn.
- Giới hạn định lượng: LOQ=10bSY =10103324.13143,26844,17752 =1,272 (mg/l) b. Kiểm tra đường chuẩn của axit uric
Để kiểm tra độ chính xác của đường chuẩn xây dựng được, tôi pha dung dịch chuẩn axit uric ở hai nồng độ 2,5 mg/l và 33 mg/l. Dùng xilanh lấy 10μl từng dung dịch mẫu axit uric chuẩn trên bơm vào thiết bị HPLC cho máy chạy đúng thời gian lưu sẽ xuất hiện píc sắc ký, ghi kết quả diện tích píc. Đo lặp lại 7 lần. Thay diện tích píc vào phương trình đường chuẩn từ đó xác định được nồng độ Cx. So sánh Cx đã tìm được theo đường chuẩn với giá trị thực đã pha với độ thống kê cho trước để kiểm tra độ chính xác của đường chuẩn thu được. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.11.
Bảng 3.11. Bảng đánh giá độ chính xác của đường chuẩn
Số lần đo
Nồng độ axit uric thực 33 (mg/l)
Nồng độ axit uric thực 2,5 (mg/l)
Nồng độ axit uric xác định theo
đường chuẩn (mg/l)
Nồng độ axit uric xác định theo đường
chuẩn (mg/l)
1 2 3 4 5 6 7
32,733 2,510
33,217 2,598
33,304 2,469
32,985 2,519
33,126 2,498
32,613 2,523
33,561 2,479
Giá trị trung bình 33,077 2,513
Độ lệch chuẩn (S) 0,329 0,042
Sai số là tương đối (q%) Sự sai số giữa lí thuyết
và thực nghiệm Độ lệch chuẩn tương đối
X 100 (%) S
RSD = ì 0,995% 1,671%
Độ chính xác của đường chuẩn được đánh giá qua giá trị độ lệch chuẩn S và độ lệch chuẩn tương đối RSD (%). Kết quả thu được cho thấy RSD (%) thấp dưới 2% (0,995% và 1,671% < 2 %) chứng tỏ đường chuẩn có độ chính xác cao giữa các lần phân tích. Phân tích xác định hàm lượng axit uric trong 2 mẫu tự tạo theo phương pháp đường chuẩn, cho kết quả về sai số tương đối giữa lí thuyết và thực nghiệm nhỏ hơn 2 % nằm trong khoảng cho phép của phân tích định
lượng. Vậy sự sai số giữa lí thuyết và thực nghiệm chỉ là ngẫu nhiên , có thể áp dụng đường chuẩn này vào phân tích xác định nước tiểu người nhằm phát hiện nguy cơ mắc bệnh Gout.
3.2. Ứng dụng phương pháp HPLC để xác định định tính và định lượng axit