Khi tiến hành thực nghiệm trên thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) để xây dựng phương pháp định lượng axit uric tôi rút ra được một số kết luận sau:
1. Đã tìm được phương pháp xác định thích hợp axit uric bằng
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với điều kiện tối ưu:
- Pha tĩnh là cột ODS C18 (5àm, 4,6 x 150 cm).
- Thành phần pha động: 60% methanol – 30% nước cất – 10% acetronitril.
Dung dịch đệm photphat có pH = 8,0 (nồng độ đệm 0,01M).
- Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút.
- Thời gian chạy mẫu: 10 phút.
- Thể tớch mẫu phõn tớch tối thiểu cần bơm vào cột sắc ký: 10 àl.
- Bước sóng tối ưu để phát hiệniên ra axit uric chảy ra khỏi cột tách là 284 nm và ở nhiệt độ 400 C .
2. Đã xây dựng được phương trình đường chuẩn có dạng như sau:
Spic= (103324,26844±609,57518).Caxit uric + (87304,24897±13143,17752) với khoảng nồng độ axit uric tuyến tính từ 0,2 mg/l đến 50 mg/l, hệ số tương quan (R2 =0,9998) , hầu hết các giá trị đo được nằm trên đường hồi quy hoặc phân bố
đều cả hai phía của đường hồi quy. Giới hạn phát hiện axit uric bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao là: 0,797 mg/l và giới hạn định lượng là 2,657 mg/l.
3. Đã kiểm tra độ chính xác của đường chuẩn qua việc xác định axit uric ở hai mẫu có nồng độ 2,5 mg/l và 33 mg/l axit uric chuẩn. Kết quả cho thấy RSD (%) thấp dưới 2% chứng tỏ đường chuẩn có độ chính xác cao giữa các lần phân tích. Điều đó chứng tỏ quy trình sắc ký mà tôi nghiên cứu được có độ chính xác cao, có thể áp dụng vào phân tích xác định axit uric trong mẫu thực một cách chính xác.pic
4. Khi nghiên cứu tính thích hợp của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao, cho thấy độ lệch chuẩn (S) và độ lệch chuẩn tương đối RSD (,%) của thời gian lưu (giá trị để phân tích định tính), diện tích pícpic của axit uric (giá trị để phân tích định lượng) nhỏ hơn 2%.
5. Khi nghiên cứu xác định độ lặp lại của số đo diện tích pícpic (Spic) axit uric của cùng một nồng độ ở các nồng độ 0,2 mg/l; 33 mg/l; 44 mg/l. Các kết quả thu được cho thấy ở các giá trị nồng độ đã khảo sát cho độ lệch chuẩn tương đối RSD, (%) đối với diện tích pícpic của axit uric đều nhỏ hơn 2%, chứng tỏ phương pháp có độ lặp lại tốt giữa các lần xác định diện tích pícpic của axit uric.
6. Kết quả khảo sát độ đúng cho thấy khả năng phân tích định lượng axit uric trên thiết bị HPLC là phương pháp có độ đúng cao (hệ số thu hồi đạt gần 100%). Từ đó có thể ứng dụng vào phân tích định tính và định lượng axit uric trong nước tiểu.
picpic
7. Đã ứng dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) để định lượng axit uric có trong 28 mẫu nước tiểu nhằm phát hiện nguy cơ mắc bệnh Gout đối với từng người.
8. Các kết quả thu được đã mở ra khả năng có thể áp dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao trong các phòng kiểm nghiệm để phát hiện nguy cơ mắc bệnh Gout của người ở các cơ sở phân tích.
2.7.2.1. Xây dựng đường chuẩn theo phương pháp bình phương tối thiểu
Xây dựng đường chuẩn Spic = f(C) theo phương pháp hồi quy tuyến tính, từ đó chọn được khoảng nồng độ tối ưu mà tại đó diện tích pic phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ của mỗi chất.
Tìm đường chuẩn dạng: y=ax+b (2.2)
( )
∑ ∑
∑ ∑ ∑
−
= 2− 2
i i
i i i
i
x x
n
y x y
x
a n (2.3)
n x a
b= ∑yi − ∑ i (2.4)
Tính độ lệch chuẩn s:
Thay xi vào phương trình (2.2) vừa tìm, đượcyˆi tính theo lý thuyết Độ lệch chuẩn :
( )
2
1 ˆ
2
−
= ∑= − n
y s y
n
i i i (2.5)
( ∑ ) ∑( )
∑ − = −
= 2 2 2
2 2
x x
s x
x n s ns
i i i
a (2.6)
( ) ∑(∑ )
∑ ∑ ∑
= −
= − 2
2 2 2 2
2 2
x x n
x s x
x n
x s s
i i i
i i
b (2.7)
Trong đó
n X X
n
i
∑ i
= =1 (2.8) Độ lệch chuẩn tương đối: = ì100
X RSD S
Trong đó: Xi là kết quả của lần xác định thứ i n là số lần xác định
Đường chuẩn y=(a ± t.sa)x + (b ± t.sb) (2.9)
t là thừa số studen lý thuyết với độ tin cậy thống kê là 95%, hệ số tự do f=n-2
* Đánh giá tính có ý nghĩa của hệ số b
- Nếu t.sb> b thì b là giá trị không có nghĩa, chấp nhận b=0, tính lại phương trình đường chuẩn theo dạng y=ax
- Nếu t.s < b thì b có nghĩa, đúng là b ≠ 0.
** Đánh giá độ đúng của đường chuẩn:
Pha dung dịch cloram cú nồng độ àX coi như chưa biết, ghi đường cực phổ, thay giá trị Yj vào phương trình đường chuẩn được nồng độ Xj, lặp lại m lần, j = 1÷m
a b Xj Yj −
= (2.10) ( )
1
2
−
= ∑ − m
X
s Xj (2.11)
m
X = ∑Xj (2.12)
m
sX = s (2.13)
Giả thuyết thống kê H0: X ≠ àX do ngẫu nhiờn
Ha: X ≠ àX khụng do ngẫu nhiờn với độ tin cậy 95%
X X
s
t = X −à (2.14) So sánh t với tb (0,05; m-1)
- Nếu t > tb chấp nhận Ha, X ≠àX đường chuẩn vừa tỡm được khụng phự hợp với độ tin cậy 95%.
- Nếu t < tb chấp nhận H0, X ≠àX chỉ do ngẫu nhiờn, đường chuẩn vừa tỡm được là phù hợp.
2.7.2.2. Kiểm tra đường chuẩn Thực nghiệm:
- Pha mỗi chất hai dung dịch cú nồng độ xỏc định àX1 , àX2 từ cỏc dung dịch chuẩn ban đầu.
- Hỳt 10àl sau đú bơm vào sắc ký và chạy sắc ký với điều kiện sắc ký đú chọn ở trên. Mỗi chất làm lặp lại 7 lần (m=7) cho mỗi nồng độ.
- Sử dụng đường chuẩn tớnh X1 và X2, so sỏnh với hai giỏ trị đó pha àX1, àX2. - Tính giới hạn phát hiện của phương pháp, so sánh với thực nghiệm.