1.5.1. Tính đặc hiệu của phương pháp
Tính đặc hiệu của phương pháp là khả năng đánh giá chất cần phân tích khi
(c)
Α
E, V SCE
có mặt các chất khác có thể là tạp chất, hoặc các thành phần cản trở khác. Phương pháp phân tích có khả năng nhận diện chất cần phân tích và không bị nhầm lẫn bởi các chất khác.
Trong phân tích dịch sinh học, phương pháp phải chứng minh được chất phân tích là dược chất hay chất chuyển hóa có tác dụng. Phân tích mẫu không bị ảnh hưởng bởi chất nội sinh và chất chuyển hóa liên quan.
1.5.2. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính
Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa đáp ứng của phương pháp đo (diện tích hay chiều cao picpícpic trong sắc kíký hay điện di, mật độ quang trong quang phổ,…) với nồng độ của chất cần phân tích trong dịch sinh học. Mối quan hệ này phải được đánh giá bằng phương trình hồi quy, thu được bằng phương pháp phân tích hồi quy (phương pháp bình phương tối thiểu).
Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ từ thấp nhất đến cao nhất trong một đường chuẩn có đáp ứng tuyến tính. Trong khoảng này phép phân tích phải đáp ứng yêu cầu về độ chính xác và độ đúng theo quy định.
Đường chuẩn nên có ít nhất 5 nồng độ của chất chuẩn pha trong cùng một điều kiện. Khoảng tuyến tính phải bao gồm toàn bộ nồng độ của các mẫu cần phân tích. Không xác định nồng độ mẫu thử dựa trên điểm ngoại suy của khoảng tuyến tính. Nồng độ thấp nhất là giới hạn định lượng, thông thường phải bằng 1/20-1/10 giá trị Cmax. Trong khoảng nồng độ khảo sát, đường chuẩn phải tuyến tính và có hệ số tuyến tính r ≥ 0,99.
Đường chuẩn phải đáp ứng các điều kiện sau:
- Độ lệch so với các giá trị thực của các nồng độ phải ≤ 15%, trừ điểm gần với giới hạn định lượng (LOQ) được chấp nhận ≤ 20%.
- Có ít nhất 4/6 điểm đạt được tiêu chuẩn trên, bao gồm cả LOQ và nồng độ cao nhất.
1.5.3. Độ đúng
Giá trị đánh giá sự phù hợp của kết quả phân tích với giá trị thực của mẫu đã biết. Điều đó có thể được hiển thị bởi hệ số thu hồi, thường cho phép trong khoảng 85 - 115 %, nhưng có thể chấp nhận 80 - 120 % đối với điểm gần giới hạn định lượng.
Độ đúng cũng cần xác định ở ít nhất 2 khoảng nồng độ thấp nhất và cao nhất.
1.5.4. Độ chính xác
Đánh giá mức độ phân tán của các phép thử song song. Độ chính xác được xác định cùng lúc bằng cách sử dụng 3 nồng độ của mẫu cần kiểm tra, một nồng độ gần với giới hạn nhỏ nhất của đường chuẩn (LOQ), một nồng độ gần với giới hạn trên của đường chuẩn và một nồng độ ở gần giữa đường chuẩn. Mỗi nồng độ phải được xác định trên ít nhất 5 mẫu.
Độ chính xác có thể được biểu thị là độ lệch chuẩn tương đối giữa các mẫu (RSD%) trong ngày và giữa các ngày, được xác định dựa trên các mẫu đối chứng.
Cho phép RSD tới 15%, riêng điểm gần giới hạn định lượng cho phép ≤ 20%.
1.5.5. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 1.5.5.1. Giới hạn phát hiện ( LOD)
Theo IUPAC và ISO, LOD được xem là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích mà phương pháp phân tích có thể phát hiện được [4,10]. Như vậy, LOD phụ thuộc và thành phần nền của mẫu phân tích và do đó phải được đánh giá cho mỗi loại nền mẫu khác nhau khi sử dụng phương pháp phân tích và phải được công bố trong tài liệu về xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp.
Như vậy có thể có một số cách xác định LOD của phép phân tích như sau:
- Qui tắc 3σ
LOD được xem là nồng độ thấp nhất (xL) của chất phân tích mà hệ thống phân tích còn cho tín hiệu phân tích (yL) khác có nghĩa với tín hiệu của mẫu trắng hay tín hiệu nền. Cần chú ý mẫu trắng trong trường hợp này phải là mẫu có thành phần nền như mẫu thực nhưng không chứa chất phân tích.
Tức là : yLOD =yB+k S. ByLOD= yB +k.SB
Với yB là tín hiệu trung bình của mẫu trắng sau nb thí nghiệm (ít nhất 10 thí nghiệm độc lập). SB là độ lệch chuẩn khi đo lặp lại tín hiệu của mẫu trắng, k là đại lượng số học được chọn theo độ tin cậy mong muốn. Với độ tin cậy cần đạt là 99% thì k≈3
1 1 yB = nB nBj∑ yBj
= ; 2 1 ( )2
S B = nB 1∑i yBi − yB
−
Như vậy, nồng độ nhỏ nhất mà thiết bị phân tích có thể phát hiện được theo phương trình hồi qui dạng y = a+bx trong phương pháp đường chuẩn là:
3
yB SB a
xLOD b
+ −
= M
Mẫu trắng thường được tạo ra khi không có chất phân tích. Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp khi không có chất phân tích thì không thể đo được tín hiệu đo nên có thể thay mẫu trắng bằng mẫu thêm chuẩn bằng cách thêm một lượng biết trước chất phân tích ở nồng độ nhỏ nhất có thể ghi nhận được tín hiệu vào nền mẫu thực, sau đó đo tín hiệu phân tích và cũng tính độ lệch chuẩn tương tự như trên.
1.5.5.2. Giới hạn định lượng ( LOQ)
LOQ được xem là nồng độ thấp nhất (xQ) của chất phân tích mà hệ thống phân tích định lượng được với tín hiệu phân tích (yQ) khác có ý nghĩa định lượng với tín hiệu của mẫu trắng hay tín hiệu nền.
yQ = yB +K S. ByQ= yB + K. SB
(CT SO) tTrong đó:
SB: Độ lệch chuẩn mẫu trắng.
Có 3 cách xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng, nhưng người ta thường xác định theo đường chuẩn ví cách này đơn giản, dễ hiểu nhưng vẫn đạt độ chính xác cần thiết:
- Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng theo đường chuẩn
Khi không phân tích mẫu trắng thì xem Sb đúng bằng sai số của phương trình hồi quy (đường chuẩn) YL = K.Sb + Yb hay Yb=b.Xb + a → Xb=0 → Yb = a và Sb = Sy thay Sb = Sy vào phương trình trên được:
D K.Sy
= b
LO K.Sy
D=
LO b (CT SO) v VvVới K = 3 .(quy tắc 3σ ):
3.Sy
D=
LO b
D 3.Sy
= b
LO (đĐường chuẩn)
K.Sy
=