4. Nội dung nghiên cứu
1.6.5 Phƣơng pháp sắc ký khí đầu dò bắt điện tử và sắc ký khí ghép khối phổ
phổ kết hợp với chiết pha rắn để xác định dƣ lƣợng thuốc trừ sâu trong nông sản [12]
Dƣ lƣợng các thuốc trừ sâu họ clo hữu cơ, lân hữu cơ và pyrethroid trong các loại nông sản gồm bột ngũ cốc, trái đào và rau diếp đƣợc xác định bằng phép
phân tích GC-ECD, GC-MS theo qui trình sau: mẫu đƣợc chiết với dung môi acetone:nƣớc (8:2) sau đó đƣợc lọc lấy dịch chiết. Dịch chiết đƣợc pha loãng theo tỉ lệ 5g mẫu/200ml nƣớc rồi cho qua cột GCB (400mg ENVI-Carb); rửa với ethyl acetate: methanol (8:2). Tiếp tục cho qua cột SAX/PSA (250mg + 250mg); rửa giải bằng ethyl acetate: methanol (8:2). Sau đó cho bay hơi dịch chiết còn 5ml và lấy dịch này tiêm vào máy sắc ký.
Giới hạn phát hiện LOD của phƣơng pháp từ 0.0005-0.004 mg/kg và giới hạn định lƣợng LOQ từ 0.005-0.01 mg/kg [12].
Chƣơng 2
KỸ THUẬT THỰC NGHIỆM 2.1. DỤNG CỤ, THIẾT BỊ, HÓA CHẤT
2.1.1. Thiết bị và dụng cụ
- Hệ thống sắc ký khí ghép khối phổ GCMS-QP2010plus của Shimadzu: Bộ tiêm mẫu tự động (Autosampler), cột sắc ký mao quản SBP 5-ms: 30m × 0,25mm x 0,25m, nguồn ion hóa EI.
- Bộ chiết pha rắn SPE
- Cân phân tích (model: CPA224S, hãng sản xuất Sartorius, chính xác đến 0,0001g).
- Máy bơm chân không, máy lắc,
- Các dụng cụ khác nhƣ các loại bình định mức, bucher, các loại pipet, micro pipet,...
2.1.2. Hoá chất
Các chất chuẩn thuốc trừ sâu họ cúc tổng hợp: tetramethrin,
phenothrin, permethrin, fenvalerate,
chất nội chuẩn trifluralin đƣợc cung cấp từ hãng Merck.
- Các dung môi acetone, n-hexan, etylacetate, methanol, dicloromethan, toluen thuộc loại sạch cho sắc ký (chromatography grade).
- Nƣớc cất hai lần.
2.1.3. Chuẩn bị dung dịch
Chuẩn gốc thuốc BVTV họ Cúc tổng hợp (Pesticide-Mix 118): 10 mg/L,
Lot Number: 31021CY, hạn dùng 21/10/2016. Chuẩn làm việc hỗn hợp Cúc tổng
hợp là 100, 250, 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750 µg/L và nội chuẩn trifluralin 100µg/L.
2.2. LẤY MẪU VÀ BẢO QUẢN MẪU
Sự hiện diện của dƣ lƣợng thuốc trừ sâu trong nƣớc sông và kênh rạch, do sự rửa trôi từ những vùng canh tác, là một tác nhân gây ô nhiễm môi trƣờng và ảnh hƣởng lên sức khỏe của cộng đồng, nhất là đối với dân cƣ sinh sống ở những lƣu vực sông gần vùng canh tác. Để khảo sát dƣ lƣợng các hợp chất thuốc trừ sâu, chúng tôi lấy mẫu nƣớc sông và mẫu trong ao tại khu vực khảo sát là xã Bình Thủy, Bình Mỹ, Bình Long, huyện Châu Phú, tỉnh An Giang.
Mỗi ao nuôi lấy 01 mẫu, các ao đƣợc chọn ngẫu nhiên theo hình chữ Z trong khu vực nuôi có nhiều ao. Trƣờng hợp ao lớn sẽ lấy 2 – 3 mẫu/ao.
Các mẫu có ký hiệu riêng, có tên chủ hộ, các thông tin lấy mẫu đầy đủ. Mẫu đƣợc lấy vào hai thời điểm là mùa khô và mùa mƣa. Mẫu sau khi lấy đƣợc bảo quản lạnh và trong tối đến khi phân tích.
Đợt 1: Mùa khô (ngày 20/04/ 2014)
STT Loại mẫu Kí hiệu mẫu
Số lƣợng
mẫu Địa điểm lấy mẫu Thời
gian
1 Nƣớc sông M01 1
Lƣu vực sông Hậu có dòng nƣớc chảy qua các khu vực lấy mẫu 7 giờ 30 phút 2 Nƣớc NTTS M11 1 Hộ ông Trần Văn Đúng, xã Bình Thủy, huyện Châu Phú, tỉnh An Giang
8 giờ
30 phút
3 Nƣớc
NTTS M21 1
Hộ ông Nguyễn Hoàng Phƣơng, xã Bình Long, huyện Châu Phú, tỉnh An Giang 9 giờ 30 phút 4 Nƣớc NTTS M31 1
Hộ ông Nguyễn Thế Phong, xã Bình Mỹ, huyện Châu Phú, tỉnh An Giang
10 giờ 30 phút
Đợt 2: Mùa mƣa (ngày 20/07/ 2014)
STT Loại mẫu Kí hiệu mẫu
Số lƣợng
mẫu Địa điểm lấy mẫu Thời
gian
1 Nƣớc sông M02 1
Lƣu vực sông Hậu có dòng nƣớc chảy qua các khu vực lấy mẫu 7 giờ 30 phút 2 Nƣớc NTTS M12 1 Hộ ông Trần Văn Đúng, xã Bình Thủy, huyện Châu Phú, tỉnh An Giang
8 giờ
30 phút
3 Nƣớc
NTTS M22 1
Hộ ông Nguyễn Hoàng Phƣơng, xã Bình Long,
9 giờ
huyện Châu Phú, tỉnh An Giang
4 Nƣớc
NTTS M32 1
Hộ ông Nguyễn Thế Phong, xã Bình Mỹ, huyện Châu Phú, tỉnh An Giang
10 giờ 30 phút
2.3. XÂY DỰNG QUY TRÌNH XỬ LÝ MẪU NƢỚC TÁCH CÁC HỢP CHẤT THUỐC TRỪ SÂU CHẤT THUỐC TRỪ SÂU
2.3.1. Khảo sát và tối ƣu hoá qui trình chiết pha rắn
Việc khảo sát và tối ƣu hoá qui trình chiết pha rắn (SPE) đƣợc tiến hành trên mẫu tự tạo.
Mẫu tự tạo đƣợc chuẩn bị bằng cách cho 0.1ml dung dịch hỗn hợp gồm 4 chuẩn thuốc trừ sâu gồm tetramethrin, permethrin, phenoethrin và fenvalerate nồng độ 1mg/l vào 2ml methanol và nƣớc để tạo thành 500ml mẫu. Mẫu đƣợc lọc bằng giấy lọc băng xanh để loại bụi đất có kích thƣớc lớn.
Các bƣớc tiến hành chiết SPE nhƣ sau: cột SPE nhồi vật liệu C18 đƣợc hoạt hoá lần lƣợt bằng 5ml hexan, 5ml methanol và 20ml nƣớc cất. Mẫu tự tạo đƣợc cho qua cột với tốc độ 10ml/phút. Dùng 5ml dung dịch methanol:nƣớc (1:1,v/v) để rửa cột nhằm loại bỏ các tạp chất nếu có. Thổi khô cột bằng khí nitơ trong 30 phút rồi rửa giải bằng dung môi thích hợp. Sau đó mẫu đƣợc thổi khô bằng khí nitơ và hoà tan lại trong dung dịch nội chuẩn 1.0mg/l và dung môi hexan rồi phân tích sắc ký bằng qui trình đã đƣợc tối ƣu để xác định hiệu suất thu hồi chất phân tích.
Thành phần dung môi đƣợc khảo sát bằng cách chọn các dung môi đơn khác nhau về độ phân cực, sau đó khảo sát các hệ dung môi hỗn hợp từ các dung môi đơn đƣợc chọn sao cho phép xử lý đạt độ thu hồi chất phân tích cao nhất.
Dựa trên độ phân cực và khả năng hoà tan của hỗn hợp các thuốc trừ sâu, các dung môi rửa giải đƣợc chọn để khảo sát gồm: aceton, etylacetate, hexan và dicloromethan. Trong các dung môi nêu trên: aceton, etylacetate là nhóm dung môi phân cực, dicloromethan là nhóm dung môi ít phân cực và hexan thuộc nhóm dung môi không phân cực. Lƣợng dung môi sử dụng để rửa giải là 5ml.
Sau khi chọn thành phần dung môi, tiến hành chọn lƣợng (thể tích) dung môi rửa giải để thu hồi chất phân tích tốt nhất.
Dung môi rửa tạp (làm sạch mẫu) sau khi chiết mẫu lên cột SPE dùng hệ metanol : nƣớc với các tỷ lệ khác nhau biến thiên từ 1:9 đến 7:3, chọn tỷ lệ cho hiệu suất thu hồi tốt nhất.
2.3.2. Khảo sát và tối ƣu hóa điều kiện phân tích mẫu trên thiết bị GC-MS
Đối với hệ thống máy sắc ký GCMS - QP2010 Plus khi vận hành cần chú ý đến một số thông số sau: nhiệt độ buồng tiêm, nhiệt độ đầu dò, áp suất,… Dựa vào khuyến cáo của nhà sản xuất và một số tài liệu tham khảo [19] các thông số kĩ thuật của GC-MS đƣợc cài đặt nhƣ sau cho toàn bộ các thí nghiệm:
2.3.2.1. Điều kiện sắc ký khí (GC)
Điều kiện buồng tiêm mẫu:
- Injection Temp (Nhiệt độ buồng tiêm) 250oC
- Injection mode (Chế độ tiêm mẫu) Splitless
- Column flow (Tốc độ dòng cột) 1,40 ml/phút
- Pressure (Áp suất đầu) 95,8 kPa
- Total flow (Tổng dòng khí) 60,4 ml/ phút
Điều kiện khối phổ (MS):
- Nguồn ion hóa điện tử (EI Source)
- Interface Temp (Nhiệt độ giao diện) 280oC
- Ion Source Temp (Nhiệt độ nguồn ion hóa) 200oC
2.3.2.2. Thông số cột tách:
- Hãng sản xuất: Supelco Lot: 28471-U
- Tên cột: SLB-5ms Nhiệt độ max: 340oC
- Thành phần chính cột: poly(5% diphenyl/95% dimethyl siloxane) - Độ dài x Đƣờng kính cột x Bề dày lớp film: 30m x 0.25mm x 0.25μm
2.3.3. Chƣơng trình nhiệt độ
Trong sắc ký khí, các chất cần phân tích trong mẫu đƣợc tách ra khỏi nhau chủ yếu dựa vào sự khác biệt giữa các chất về nhiệt độ sôi và ái lực đối với pha tĩnh. Chính vì vậy sự ảnh hƣởng của nhiệt độ và tính chất của pha tĩnh rất quan trọng đối với việc tách chất trong sắc ký khí. Theo chƣơng trình nhiệt độ đƣợc các nhà sản xuất nghiên cứu là:
Bảng 2.1: Chƣơng trình nhiệt độ cột Tốc độ
(0C/phút)
Nhiệt độ (0C) Thời gian (min)
- 80.0 1.00
7.0 250.0 0.00
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Khảo sát dung môi rửa giải
Ảnh hƣởng của bản chất dung môi đến hiệu suất thu hồi chất phân tích từ mẫu đƣợc thể hiện ở các số liệu trong các bảng 3.1; 3.2 và các hình 3.1; 3.2.
Bảng 3.1: Hiệu suất thu hồi khi rửa giải bằng aceton, etylacetate, hexan và dicloromethan
Tên chất
Hiệu suất thu hồi (%)
aceton etylacetate hexan dicloromethan
tetramethrin 63.99 82.03 57.79 43.12
permethrin 51.47 65.42 50.03 51.55
phenothrin 53.21 63.97 48.20 35.56
fenvalerate 81.22 83.67 33.98 30.51
Hình 3.1: Đồ thị biểu diễn hiệu suất thu hồi rửa giải bằng aceton, etylacetate, hexan và dicloromethan.
Kết quả thu đƣợc cho thấy khi chỉ sử dụng một loại dung môi làm dung môi rửa giải thì hiệu suất rửa giải các chất không đồng đều. Khi sử dụng dung môi acetone hay etylacetate để rửa giải thì hiệu suất thu hồi của các pyrethroid cao. Ngƣợc lại khi sử dụng dung môi hexan hay dicloromethan để rửa giải thì hiệu suất thu hồi của các pyrethroid thấp. Từ đó, ta tiến hành khảo sát kết hợp hai loại dung môi thuộc các nhóm dung môi có độ phân cực khác nhau (tỉ lệ 1:1, v/v) trong cùng một dung môi rửa giải.
Bảng 3.2: Hiệu suất thu hồi khi kết hợp 2 dung môi khác nhau để rửa giải.
Tên chất
Hiệu suất thu hồi (%) aceton: hexan etylacetate: hexan aceton: dicloromethan etylacetate: dicloromethan tetramethrin 58.15 65.89 39.70 55.42 permethrin 58.57 69.23 70.16 56.12 phenothrin 60.37 67.34 44.47 59.68 fenvalerate 84.62 87.41 71.03 79.20
Hình 3.2: Đồ thị hiệu suất thu hồi khi kết hợp 2 dung môi rửa giải khác nhau. Kết luận: khi dùng hỗn hợp dung môi etylacetate:hexan để rửa giải, hiệu suất thu hồi của các chất cao và đồng đều nhất nên chọn hỗn hợp dung môi etylacetate: hexan làm dung môi rửa giải.
3.2. Khảo sát tỉ lệ etylacetate: hexan trong hỗn hợp dung môi rửa giải
Hỗn hợp dung môi etylacetate:hexan (1:1, v/v) dùng làm dung môi rửa giải cho hiệu suất các chất đƣợc rửa giải ra khỏi cột cao và đồng đều. Tuy nhiên hiệu suất này vẫn chƣa đƣợc cao nhƣ mong muốn đối với một qui trình phân tích. Một vấn đề đƣợc đặt ra là tỉ lệ thể tích giữa 2 dung môi etylacetate và hexan đã sử dụng chƣa phải là thích hợp nhất. Trên cơ sở này việc khảo sát tỉ lệ thể tích etylacetate: hexan đƣợc thực hiện nhằm tìm ra tỉ lệ tối ƣu giúp nâng cao hiệu suất thu hồi của các chất. Thể tích dung môi rửa giải 5ml.
Tên chất
Hiệu suất thu hồi (%) etylacetate: hexan (9:1) etylacetat: hexan (75:25) etylacetate: hexan (1:1) etylacetate: hexan (25:75) tetramethrin 82.03 90.64 65.88 73.79 permethrin 65.42 74.13 69.22 53.22 phenothrin 63.97 76.77 67.34 54.01 fenvalerate 93.67 97.45 87.41 77.67
Trên cơ sở kết quả thí nghiệm, chúng tôi chọn sử dụng tỉ lệ về thể tích etylacetate:hexan trong hỗn hợp dung môi rửa giải là 75:25 (v/v).
Hình 3.3: Đồ thị biểu diễn hiệu suất thu hồi khi thay đổi tỉ lệ dung môi rửa giải etylacetate:hexan (v/v)
3.3. Khảo sát thể tích dung môi sử dụng để rửa giải
Thể tích dung môi sử dụng trong quá trình rửa giải cũng là một trong những yếu tố ảnh hƣởng lên hiệu suất thu hồi. Nếu lƣợng dung môi sử dụng
không phù hợp sẽ không thể rửa giải hết các chất ra khỏi cột, hiệu suất thu hồi không cao.
Với dung dịch hỗn hợp etylacetate:hexan (75:25, v/v), thực hiện thí nghiệm với các thể tích dung dịch lần lƣợt là 3ml, 5ml, 10ml, 15ml để theo dõi sự biến đổi hiệu suất thu hồi tƣơng ứng với từng thể tích rửa giải.
Bảng 3.4: Hiệu suất thu hồi khi thay đổi thể tích dung môi rửa giải.
Tên chất
Hiệu suất thu hồi (%)
15ml 10ml 5ml 3ml
tetramethrin 90.99 90.76 65.88 60.41
permethrin 91.03 92.90 69.22 66.11
phenothrin 96.07 95.97 67.34 63.67
fenvalerate 107.23 99.14 87.41 85.20
Hình 3.4: Đồ thị biểu diễn hiệu suất thu hồi khi thay đổi thể tích dung môi rửa giải.
Kết quả khảo sát ở bảng 3.4 và hình 3.4 đã cho thấy hiệu suất thu hồi tƣơng ứng với lƣợng dung môi rửa giải 10ml và 15ml là cao nhất. Ngoài ra hiệu suất thu hồi ở 2 trƣờng hợp này không có sự khác biệt đáng kể. Vì vậy thể tích dung môi rửa giải cho quá trình chiết SPE đƣợc chọn là 10ml.
3.4. Khảo sát sự ảnh hƣởng của dung môi rửa tạp
Trong qui trình chiết SPE khi tải mẫu lên cột dƣới tác dụng của áp suất thấp tạo bởi bơm chân không phần lớn tạp chất đã đƣợc loại ra khỏi cột. Tuy nhiên vẫn có thể còn một phần tạp chất bị giữ lại trên cột cùng với chất phân tích. Việc sử dụng dung môi rửa tạp sẽ loại bỏ phần tạp chất này ra khỏi cột giúp tránh sự gây nhiễu của các mũi tạp chất lên kết quả phân tích. Thực tế chọn dung môi rửa tạp phù hợp tránh tình trạng một phần chất phân tích bị rửa giải trong quá trình rửa tạp.
Đề tài sử dụng hỗn hợp dung môi methanol:nƣớc làm dung môi rửa tạp khi xử lý mẫu trên cột C18 [19]. Tỉ lệ methanol:nƣớc (v/v) cũng đƣợc quan tâm khảo sát và tối ƣu, kết quả đƣợc mô tả ở bảng 2.5 và hình 2.5. Tỉ lệ thể tích dung môi rửa tạp là 1:9; 3:7; 5:5 và 7:3 (v/v). Dung môi rửa giải là 10ml hỗn hợp etylacetate:hexan (75:25, v/v).
Bảng 3.5: Ảnh hƣởng của dung môi rửa tạp methanol:nƣớc đến hiệu suất thu hồi.
Tên chất Hiệu suất thu hồi (%)
Tỉ lệ: 1:9 Tỉ lệ: 3:7 Tỉ lệ: 5:5 Tỉ lệ: 7:3
tetramethrin 91.98 91.08 90.76 60.38
permethrin 94.06 93.98 92.90 62.36
phenothrin 97.94 96.83 95.97 63.56
Hình 3.5: Đồ thị biểu diễn hiệu suất thu hồi khi thay đổi tỉ lệ methanol:nƣớc. Hỗn hợp methanol:nƣớc tỉ lệ 3:7 (v/v) đƣợc chọn làm dung môi rửa tạp vì với tỉ lệ này kết quả loại đƣợc tạp chất tốt, đƣờng nền mẫu sạch và ảnh hƣởng không đáng kể đến hiệu suất thu hồi của chất phân tích. Hỗn hợp methanol:nƣớc tỉ lệ 5:5 và 7:3 làm giảm hiệu suất thu hồi của chất phân tích còn hỗn hợp tỉ lệ 1:9 thì chƣa loại sạch tạp chất làm nhiễu đƣờng nền mẫu gây ảnh hƣởng đến kết quả phép đo.
3.5. Khảo sát ảnh hƣởng của tốc độ tải mẫu lên cột
Do thể tích mẫu lớn nên cần nhiều thời gian để tải mẫu lên cột. Vì thế chúng tôi tăng tốc độ tải mẫu qua cột lên 15ml/phút. Tuy nhiên khi tăng tốc độ tải mẫu thì thấy hiệu suất thu hồi của các chất lại giảm, nguyên nhân có thể do tốc độ tải mẫu nhanh nên pha tĩnh không tƣơng tác đƣợc hết với các chất phân tích trong mẫu. Do đó tốc độ tải mẫu qua cột vẫn giữ ở mức 10ml/phút.
Bảng 3.6: Ảnh hƣởng tốc độ tải mẫu đến hiệu suất thu hồi
Tên chất
Hiệu suất thu hồi (%)
10ml/phút 15ml/phút
tetramethrin 91.08 74.76
permethrin 93.98 72.90
phenothrin 96.83 81.97
fenvalerate 99.89 82.94
3.6. XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI CÁC THUỐC TRỪ SÂU BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ GHÉP KHỐI PHỔ TRỪ SÂU BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ GHÉP KHỐI PHỔ
3.6.1. Định danh các chất trên sắc ký đồ
Chuẩn bị các dung dịch chuẩn chứa lần lƣợt các thuốc trừ sâu tetramethrin, permethrin, phenothrin, fenvalerate ở nồng độ 10mg/L đƣợc tiêm vào máy sắc ký. Kết quả khảo sát trong bảng 3.7
Bảng 3.7: Thời gian lƣu các chất chuẩn
Thứ tự
pic Hợp chất
Ion định lƣợng (m/z)
Thời gian lƣu
(phút) Ion so sánh 18 tetramethrin 1 164 28.075 123.00 - 81.00 19 tetramethrin 2 164 28.267 123.00 - 81.00 22 Permethrin 1 183 30.422 165.00 – 163.00 23 Permethrin 2 183 30.6 165.00 – 163.00 20 Phenothrin 1 123 28.758 183.00 – 81.00 21 Phenothrin 2 123 28.9 183.00 – 81.00 29 Fenvalerate 1 125 32.925 225.00 – 167.00 30 Fenvalerate 2 125 33.267 225.00 – 167.00
Hình 3.7: Sắc đồ xác định thời gian lƣu các chất cần phân tích
Hình 3.9: Sắc đồ xác định ion định lƣợng và ion so sánh của permethrin
Hình 3.10: Sắc đồ xác định ion định lƣợng và ion so sánh của phenothrin
Hình 3.11: Sắc đồ xác định ion định lƣợng và ion so sánh của phenothrin
3.6.2. Khảo sát độ lặp lại của phép đo
Độ lặp lại đƣợc dùng để đánh giá định lƣợng độ phân tán của các kết quả