Nghiên cứu xác định nồng độ cồn trong máu bằng phương pháp sắc ký khí và so sánh với phương pháp phân tích sinh hóa

Vì các lý do trên, để có điều kiện nghiên cứu, khảo sát và so sánh các phương pháp định lượng nồng độ cồn trong máu và được sự đồng ý của giáo viên hướng dẫn, chúng tôi chọn đề tài “Nghi

TRƯƠNG MINH VŨ

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ CỒN TRONG MÁU BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ VÀ SO SÁNH VỚI PHƯƠNG PHÁP

PHÂN TÍCH SINH HÓA

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Nghệ An, 2014

TRƯƠNG MINH VŨ

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ CỒN TRONG MÁU BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ VÀ SO SÁNH VỚI PHƯƠNG PHÁP

PHÂN TÍCH SINH HÓA

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

PGS TS Trần Đình Thắng

Nghệ An, 2014

tích sinh hóa” Tôi đã nhận được sự giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi của

Ban lãnh đạo Cơ quan tôi đang công tác; Thầy cô là giảng viên của Khoa Hóa học trường Đại học Vinh, người đã trực tiếp giảng dạy và truyền đạt cho tôi nhiều kiến thức chuyên sâu về hóa học; Tôi xin bày tỏ lòng chân thành và cảm ơn về sự giúp đỡ đó

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Trần Đình Thắng,

giảng viên đã trực tiếp hướng dẫn và chỉ bảo cho tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp nơi tôi đang công tác

và gia đình đã động viên, khích lệ, tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện hoàn thành luận văn này

Danh mục các ký hiệu, chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục hình vẽ, đồ thị, phổ đồ, phiếu xét nghiệm

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1 Giới thiệu về cồn (ethanol) 3

1.1.1 Lịch sử phát hiện 3

1.1.2 Cấu tạo, tính chất vật lý và hóa học 4

1.1.2.1 Cấu tạo: 4

1.1.2.2 Tính chất vật lý: 4

1.1.2.3 Tính chất hóa học: 4

1.2 Giới thiệu về máu 6

1.2.1 Sơ lược về máu 6

1.2.2 Cơ chế chuyển hóa cồn trong máu 6

1.3 Một số phương pháp xác định hàm lượng ethanol trong máu 7

1.3.1 Phương pháp xét nghiệm sinh hóa: 7

1.3.1.1 Nguyên lý: 7

1.3.1.2 Thu mẫu: 7

1.3.1.3 Tiến hành xét nghiệm: 7

1.3.1.4 Xuất kết quả: 7

1.3.2 Phương pháp sắc ký khí 8

1.3.2.1 Hóa chất, thuốc thử và thiết bị: 8

1.3.2.2 Xử lý mẫu: 8

1.3.2.3 Tiến hành phân tích sắc ký khí: 8

1.3.3.2 Xử lý mẫu: 9

1.3.3.3 Tiến hành phân tích sắc ký khí: 10

1.3.3.4 Kết quả: 10

1.4 Giới thiệu về Sắc ký khí 11

1.4.1 Đại cương về sắc ký: 11

1.4.2 Các đại lượng cơ bản trong phương pháp sắc ký: 12

1.4.2.1 Hệ số phân bố: 12

1.4.2.2 Thời gian lưu (tR): 12

1.4.2.3 Hệ số dung lượng: 13

1.4.2.4 Số đĩa lý thuyết của cột: 14

1.4.2.5 Độ chọn lọc: 14

1.4.2.6 Độ phân giải: 15

1.4.3 Các bộ phận chính của máy sắc ký khí: 15

1.4.3.1 Khí mang: 16

1.4.3.2 Buồng tiêm: 16

1.4.3.3 Cột tách Sắc ký khí: 17

1.4.3.4 Pha tĩnh trong sắc ký khí: 19

1.4.3.5 Đầu dò (detector): 20

1.5 Phương pháp định tính và định lượng 21

1.5.1 Phương pháp định tính: 21

1.5.2 Phương pháp định lượng: 21

1.5.2.1 Phương pháp ngoại chuẩn: 21

1.5.2.2 Phương pháp nội chuẩn: 21

1.6.1.1 Khoảng tuyến tính và cách xác định: 22

1.6.1.2 Các phương pháp xây dựng đường chuẩn: 23

1.6.1.3 Các lưu ý: 25

1.6.2 Phương pháp một điểm chuẩn: 27

1.7 Phương pháp khảo sát giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 27

1.7.1 Giới hạn phát hiện (LOD) 27

1.7.1.1 Định nghĩa: 27

1.7.1.2 Cách xác định: 27

1.7.2 Giới hạn định lượng: 28

1.7.2.1 Định nghĩa: 28

1.7.2.2 Cách xác định: 29

1.8 Phương pháp khảo sát độ lập lại 29

1.9 Phương pháp khảo sát hiệu suất thu hồi 30

CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM 32

2.1 Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu 32

2.1.1 Dụng cụ: 32

2.1.2 Thiết bị: 32

2.2 Hóa chất 32

2.3 Các bước tiến hành nghiên cứu, khảo sát bằng máy sắc ký khí 33

2.3.1 Chuẩn bị hóa chất và mẫu máu: 33

2.3.1.1 Dung dịch natri tungstat: 120g/l: 33

2.3.1.2 Dung dịch axit sulfuric 5%: 33

2.3.1.3 Dung dịch propanol 0,25g/l: 33

2.3.2.1 Chuẩn bị mẫu thử: 34

2.3.2.2 Chuẩn bị mẫu thêm chuẩn: 34

2.3.2.3 Chuẩn bị mẫu chuẩn: 34

2.3.2.4 Chuẩn bị mẫu trắng: 35

2.3.3 Thiết bị, điều kiện phân tích và trình tự tiêm mẫu 35

2.3.3.1 Thiết bị phân tích: 35

2.3.3.2 Điều kiện phân tích: 35

2.3.3.3 Trình tự tiêm mẫu: 36

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37

3.1 Khảo sát các phương pháp xây dựng đường chuẩn 37

3.1.1 Xây dựng đường chuẩn với chuẩn tinh khiết (PP 1): 37

3.1.2 Xây dựng đường chuẩn trên nền mẫu trắng (PP 2): 38

3.1.3 Xây dựng đường chuẩn với chuẩn tinh khiết, không xử lý chuẩn mẫu (PP 3): 39

3.1.4 So sánh kết quả các phương pháp xây dựng đường chuẩn 40

3.2 Khảo sát phương pháp một điểm chuẩn 41

3.3 Khảo sát hiệu suất thu hồi 42

3.4 Khảo sát độ lặp lại 43

3.4.1 Độ lặp lại (độ ổn định) của thiết bị: 43

3.4.2 Độ lặp lại của phương pháp: 43

3.5 Khảo sát giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 44

3.5.1 Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD): 44

3.5.2 Tính giới hạn định lượng (LOQ): 46

nồng độ cồn trong máu theo thời gian bằng Phương pháp sắc ký khí 48

KẾT LUẬN 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 PHỤ LỤC 54-87

- C PP : Nồng độ theo phương pháp

- FID : Đầu dò ion hóa ngọn lửa

- GC : Sắc ký khí

- H : Hiệu suất thu hồi

- LOD : Giới hạn phát hiện

- LOQ : Giới hạn định lượng

- MS : Đầu dò khối phổ

- PP : Phương pháp

- RSD : Độ lệch chuẩn tương đối

- SD : Độ lệch chuẩn

- S/N : Tỷ lệ chiều cao tín hiệu chất phân tích chia cho nhiễu đường nền

- S c /S nc : Tỷ lệ diện tích chất chuẩn chia cho nội chuẩn

- S m /S nc : Tỷ lệ diện tích chất phân tích chia cho nội chuẩn

- ,  : Ký hiệu tăng hay giảm

DANH MỤC CÁC BẢNG

điểm chuẩn theo PP 1

- Bảng 3.2: Mối tương quan giữa nồng độ (C) và tỉ lệ diện tích (Sc/Snc) các điểm chuẩn theo PP 2

- Bảng 3.3: Mối tương quan giữa nồng độ (C) và tỉ lệ diện tích (Sc/Snc) các điểm chuẩn theo PP 3

- Bảng 3.4: Tỉ lệ diện tích peak và nồng độ của các mẫu M1 và M2 tính theo 3 phương pháp xây dựng đường chuẩn

- Bảng 3.7: Kết quả khảo sát độ lặp lại của thiết bị

- Bảng 3.8: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp

- Bảng 3.9: Xác định chiều cao của nhiễu đường nền (N) ở nồng độ

4mg/100ml

- Bảng 3.10: Xác định độ lặp lại của chiều cao mẫu chuẩn (S) ở nồng độ

4mg/100ml

- Bảng 3.11: Kết quả phương pháp GC và phương pháp xét nghiệm sinh hóa

- Bảng 3.12: Kết quả các phương pháp bảo quản mẫu ảnh hưởng đến nồng

độ

DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ, PHỔ ĐỒ, PHIẾU XÉT NGHIỆM

- Hình 1.2: Mô tả cách tính số đĩa lý thuyết

- Hình 1.3: Sơ đồ thiết bị sắc ký khí

- Hình 1.4: Mô tả khoảng tuyến tính và khoảng làm việc

- Hình 1.5: Mô tả cách xác định LOD bằng cách tính S/N

- Hình 1.6: Mô tả mối quan hệ giữa LOD, LOQ và khoảng tuyến tính

- Hình 3.1: Đường chuẩn theo PP 1

- Hình 3.2: Đường chuẩn theo PP 2

- Hình 3.3: Đường chuẩn theo PP 3

phương pháp bảo quản

- Phổ đồ 1-93: Các phổ đồ sắc ký khí ở phần phu lục

- Phiếu xét nghiệm 1-6: Các phiếu xét nghiệm sinh hóa ở hai bệnh viện

MỞ ĐẦU

Thời gian qua, tình hình tai nạn giao thông xảy ra nhiều và diễn biến rất phức tạp, làm chết và bị thương nhiều người, gây tổn thất kinh tế, tạo gánh nặng cho gia đình và xã hội, Tai nạn giao thông xảy ra do nhiều nguyên

nhân, trong đó “Người điều khiển phương tiện giao thông sau khi uống rượu,

bia không làm chủ được phương tiện” là nguyên nhân chính dẫn đến tai nạn

giao thông

Theo Ủy ban An toàn giao thông Quốc gia, năm 2013 cả nước đã xảy

ra 29.385 vụ tai nạn giao thông, làm chết 9.369 người, bị thương 29.500 người [9]

Theo Quyết định số: 933/QĐ-BYT ngày 23/3/2010 của Bộ Y tế ban

hành “Quy định về đo nồng độ cồn trong máu áp dựng trong các Bệnh viện

bằng máy xét nghiệm sinh hóa đối với người tham gia giao thông” [1]

Năm 2012, Chủ tịch Ủy ban An toàn giao thông Quốc gia đã chỉ đạo

Bộ Công an và Bộ Y tế xây dụng “Thông tư liên tịch quy định về xét nghiệm

nồng độ cồn trong máu của người điều khiển phương tiện giao thông cơ giới đường bộ”

Qua nghiên cứu một số tài liệu, tạp chí, quy trình về định lượng nồng

độ cồn trong máu bằng phương pháp sắc ký khí (GC) và sắc ký khí ghép khối

phổ (GC/MS) [2], [10], [11], [12], [13], [14], [15]

Vì các lý do trên, để có điều kiện nghiên cứu, khảo sát và so sánh các phương pháp định lượng nồng độ cồn trong máu và được sự đồng ý của giáo

viên hướng dẫn, chúng tôi chọn đề tài “Nghiên cứu xác định nồng độ cồn

trong máu bằng Phương pháp sắc ký khí và so sánh với Phương pháp phân tích sinh hóa” áp dụng cho mẫu máu thu trên người sống và đã chết

Trong quá trình thực hiện đề tài này, chúng tôi tập trung nghiên cứu và khảo sát một số nội dung sau:

- Nghiên cứu một số phương pháp định lượng nồng độ cồn trong máu

- Nghiên cứu, khảo sát phương pháp định lượng nồng độ cồn trong máu bằng sắc ký khí (GC-FID), cụ thể là:

+ Khảo sát một số phương pháp xây dựng đường chuẩn và so sánh với phương pháp một điểm chuẩn

+ Khảo sát giới hạn phát hiệnvà giới hạn định lượng

+ Khảo sát độ ổn định của thiết bị và độ lặp lại của phương pháp + Khảo sát hiệu suất thu hồi

- So sánh kết quả xác định nồng độ cồn trong máu bằng phương pháp sắc ký khí với phương pháp phân tích sinh hóa

- Khảo sát một số phương pháp bảo quản mẫu (không bảo quản, bảo

quản lạnh và bảo quản đông đá) và thời gian bảo quản mẫu ảnh hưởng đến

nồng độ cồn trong máu, từ đó rút ra phương pháp bảo quản mẫu hợp lý nhất

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về cồn (ethanol)

1.1.1 Lịch sử phát hiện

- Ethanol còn được gọi là rượu etylic, rượu ngũ cốc hay cồn, là một hợp chất hữu cơ, là một rượu thông thường có trong thành phần của các đồ uống chứa cồn, trong dân gian nó được gọi đơn giản là rượu

- Ethanol đã được con người sử dụng từ thời tiền sử như là thành phần không độc hại trong đồ uống có cồn Lượng cặn khô được tìm thấy trong các

đồ gốm cổ 9000 năm tuổi ở miền bắc Trung Quốc cho thấy đồ uống có cồn thậm chí đã được sử dụng từ thời kỳ đồ đá mới

- Ethanol tương đối tinh khiết lần đầu tiên được chiết tách thành công bởi các nhà giả kim thuật Ba Tư, những người đã phát triển nghệ thuật chưng cất dưới triều đại kha-lip Abbasid, đáng chú ý nhất trong số đó là Al-Razi Các bài viết của Jabir Ibn Hayyan (Geber) (721-815) đề cập đến hơi dễ cháy của rượu khi đun sôi Al-Kindi (801-873) mô tả cụ thể quá trình chưng cất rượu, hiệu suất sản phẩm chưng cất ethanol từ hỗn hợp ethanol-nước đạt 95,6% do ethanol tạo hỗn hợp đẳng khí với nước Ethanol tuyệt đối thu được lần đầu tiên vào năm 1796, do Johann Tobias Lowitz thực hiện bằng cách lọc ethanol đã chưng cất qua than củi

- Antoine Lavoisier đã mô tả ethanol như là một hợp chất của carbon, hydro và oxy Năm 1808 Nicolas-Théodore de Saussure đã xác định công thức hóa học của ethanol Đến năm 1858, Archibald Scott Couper đã công bố công thức cấu trúc của ethanol, đây là một trong những hợp chất hóa học đầu tiên có cấu trúc được xác định

- Đa số ethanol thực phẩm được chiết xuất từ trái cây và ngũ cốc, còn ethanol nhân tạo được tổng hợp bằng phương pháp hydrat hóa ethylene sử

dụng xúc tác axit, đây là một quy trình tương tự với phương pháp tổng hợp ethanol công nghiệp hiện nay

1.1.2 Cấu tạo, tính chất vật lý và hóa học

1.1.2.1 Cấu tạo:

Ethanol thường được viết tắt là EtOH, là một ancol mạch thẳng, công thức hóa học của nó là C2H6O hay C2H5OH hay CH3-CH2-OH Nhóm metyl (CH3-) liên kết với carbon ở nhóm metylen (-CH2-), nhóm này lại liên kết với oxy của nhóm hydroxyl (-OH), nó là đồng phân hoá học của dimetyl ete

1.1.2.2 Tính chất vật lý:

Ethanol là một chất lỏng, không màu, trong suốt, có mùi thơm dễ chịu

và đặc trưng, vị cay, nhẹ và dễ bay hơi hơn nước, tan vô hạn trong nước, tan trong ete và clorofom, hút ẩm, dễ cháy, khi cháy không có khói và ngọn lửa

có màu xanh da trời

Sở dĩ ethanol tan vô hạn trong nước và có nhiệt độ sôi cao hơn nhiều so với este hay aldehyde (2 chất có khối lượng phân tử gần nhau) là do sự tạo

thành liên kết hydro giữa các phân tử rượu với nhau và với nước

- Khối lượng phân tử: 46,06 g/mol

- Khối lượng riêng: d = 0,793 g/ml (ở 200C)

- Nhiệt độ sôi: ts = 78,390 C

- Nhiệt độ nóng chảy: tnc = - 114,150 C

1.1.2.3 Tính chất hóa học:

a)Ethanol có một số tính chất chungcủa một rượu đơn chức:

- Phản ứng thế với kim loại kiềm, kiềm thổ

2C2H5OH + 2Na  2C2H5ONa + H2

- Phản ứng este hóa, phản ứng giữa rượu và acid với môi trường là acid sulfuric đặc nóng tạo ra este

C2H5OH + CH3COOH  CH3COOC2H5 + H2O

- Phản ứng loại nước, tách nước trong một phân tử để tạo thành olefin, trong môi trường acid sulfuric đặc ở 1700 C

C2H5OH  C2H4 + H2O Hay tách nước giữa 2 phân tử rượu tạo thành ether

C2H5OH + C2H5OH  C2H5-O-C2H5 + H2O

- Phản ứng oxi hóa, trong đó rượu bị oxi hóa theo 3 mức: Oxi hóa không hoàn toàn thành aldehyde, acid hữu cơ và oxi hóa hoàn toàn thành CO2

và H2O

+ Mức 1, trong môi trường nhiệt độ cao:

CH3-CH2-OH + CuO  CH3-CHO + Cu + H2O + Mức 2, có xúc tác:

CH3-CH2-OH + O2 CH3-COOH + H2O + Mức 3, oxi hóa hoàn toàn:

C2H5OH + 3O2 2CO2 + 3 H2O

b) Ethanol có một số tính chất riêng:

- Phản ứng tạo ra butadien-1,3: Cho hơi rượu đi qua chất xúc tác hỗn hợp, ví dụ như: Cu + Al2O3 ở 380-400 độ C, lúc đó xảy ra phản ứng tách loại nước

2C2H5OH  CH2=CH-CH=CH2 + 2H2O + H2

- Phản ứng lên men giấm: Oxi hóa rượu etylic 10 độ bằng oxi không khí có mặt men giấm ở nhiệt độ khoảng 25 độ C

CH3-CH2-OH + O2 CH3-COOH + H2O

1.2 Giới thiệu về máu

1.2.1 Sơ lƣợc về máu [5]

* Máu chiếm khoảng 7 - 9% khối lượng cơ thể, một người trung bình

có 4 - 5 lít máu (khoảng 75 - 80ml/kg)

- Tỷ trọng toàn phần của máu là 1,050 - 1,060 g/ml

- Tỷ trọng trung bình của huyết tương là: 1,028 g/ml

* Máu có 2 thành phần chính là huyết cầu (chiếm khoảng 40%) và

huyết tương (chiếm khoảng 60%)

- Huyết cầu gồm: Hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu

+ Hồng cầu chiếm khoảng 96%, hồng cầu chứa hemoglobin và

có nhiệm vụ chính là vận chuyển và phân phối oxy

+ Bạch cầu chiếm khoảng 3%, bạch cầu là một phần quan trọng của hệ miễn dịch có nhiệm vụ tiêu diệt các tác nhân gây nhiễm trùng và phát động đáp ứng miễn dịch của cơ thể

+ Tiểu cầu chiếm khoảng 1%, tiểu cầu chịu trách nhiệm trong quá trình đông máu Tiểu cầu tham gia rất sớm vào việc hình thành các nút tiểu cầu, là bước khởi đầu của quá trình hình thành cục máu đông trong các chấn thương mạch máu nhỏ

- Huyết tương là dung dịch chứa đến 96% là nước, 4% là các protein

huyết tương và rất nhiều chất khác với lượng nhỏ: Các hormone; các protein

khác; các chất thải của cơ thể; các chất điện giải như: Natri, clo, canxi, kali, phosphate…

1.2.2 Cơ chế chuyển hóa cồn trong máu [7]

- Rượu sau khi đưa vào cơ thể sẽ được hấp thu chủ yếu ở tá tràng, ruột non và niêm mạc dạ dày Rượu được hấp thu sẽ theo đường tĩnh mạch đến gan Tại gan, trên 90% lượng rượu hấp thu sẽ được chuyển hóa Phần còn lại

sẽ được thải ra ngoài qua phổi và thận

- Các giai đoạn chuyển hóa của rượu: Ở gan rượu được chuyển hóa thành acetaldehyde, sau đó acetaldehyde sẽ được oxy hóa thành acetate (các giai đoạn chuyển hóa được thực hiện bởi các men)

- Acetaldehyde là một chất độc, năng lực chuyển hóa thành acetate chỉ

có giới hạn, nên ở những người lạm dụng rượu thì lượng acetaldehyde được sản sinh với một mức quá lớn sẽ không được chuyển hóa hết và gắn vào màng

tế bào gây tổn thương tế bào gan thông qua các cơ chế gây độc, viêm và miễn dịch, hậu quả là quá trình tạo xơ

Mặt dù ethanol không phải là một chất độc có độc tính cao, nhưng khi nồng độ cồn trong máu vượt quá 0,5% (tương đương 500mg/100ml máu) thì nguy cơ dẫn đến tử vong rất cao

1.3 Một số phương pháp xác định hàm lượng ethanol trong máu 1.3.1 Phương pháp xét nghiệm sinh hóa [1]

1.3.1.1 Nguyên lý:

Cơ chế phân tích của máy xét nghiệm sinh hóa là phương pháp đo quang (so màu)

1.3.1.2.Thu mẫu:

- Thu khoảng 3ml máu ở tĩnh mạch

- Cho vào ống nghiệm có nắp đậy kín

1.3.1.3 Tiến hành xét nghiệm:

- Ly tâm mẫu máu chứa trong ống nghiệm có nắp đậy kín với tốc độ

1000 vòng/phút

- Lấy dịch chiết trong (huyết tương) ở lớp trên

- Tiến hành phân tích dịch chiết và dãy chất chuẩn trên máy xét nghiệm sinh hóa

- Máy sẽ tự động tính toán kết quả

1.3.1.4.Xuất kết quả:

- Đơn vị: …….mg/l hoặc …… mmol/l

- Lọc syringe (loại dùng cho sắc ký)

- Thiết bị: Sắc ký khí, đầu dò ion hóa ngọn lửa (GC - FID)

1.3.2.2 Xử lý mẫu:

- Bước 1: Lấy 2 ống nghiệm (ký hiệu mẫu chuẩn và mẫu thử), cho vào mỗi ống 0,5ml dung dịch nội chuẩn isobutanol

- Bước 2: Hút 0,5ml chuẩn ethanol cho vào ống nghiệm ký hiệu mẫu

chuẩn, lắc đều, ta được mẫu chuẩn

- Bước 3: Hút 0,5ml mẫu máu cho vào ống nghiệm ký hiệu mẫu thử,

lắc đều, lọc qua syringe, ta được mẫu thử

+ X: là nồng độ ethanol trong mẫu máu (mẫu thử)

+ Cs: là nồng độ nội chuẩn isobutanol (50mg/100ml)

+ hx; Rx: là chiều cao của peak ethanol trong mẫu máu và mẫu chuẩn

+ hs; Rs: là chiều cao của peak isobutanol trong mẫu máu và mẫu chuẩn

1.3.3 Phương pháp sắc ký khí với hệ thống Headspace [2], [10], [13], [14], [15]

1.3.3.1 Hóa chất, thuốc thử và thiết bị:

- Chuẩn ethanol các hàm lượng: 0,02%; 0,05%; 0,1%; 0,2%; 0,3%; 0,4%

- Nội chuẩn 3 - butanol hàm lượng: 0,05%

- Dung dịch NaCl bão hòa

- Máy sắc ký khí

- Hệ thống Headspace

1.3.3.2 Xử lý mẫu:

*Chuẩn bị mẫu chuẩn:

- Lấy 6 lọ thủy tinh dung tích 20ml, cho vào mỗi lọ 200µl dung dịch chuẩn ethanol với các nồng độ nêu trên

- Thêm vào mỗi lọ 200µl nước muối NaCl bảo hòa và 100µl nội chuẩn

3 - butanol

*Chuẩn bị mẫu thử:

- Lấy lọ thủy tinh dung tích 20ml, cho vào 200µl máu

- Thêm 200µl nước muối NaCl bão hòa và 100µl nội chuẩn 3-butanol

* Các lọ thủy tinh trên được đậy nắp kín, chuyển vào khây tự động của máy Headspace

- Detector FID, nhiệt độ: 2700C

- Chương trình nhiệt độ: Bắt đầu 1200C giữ 1 phút, tăng nhiệt

- So sánh thời gian lưu peak của mẫu với chất chuẩn

- Lập đường chuẩn và tính hàm lượng ethanol trong máu dựa vào đường chuẩn

1.3.3.4 Kết quả:

Hàm lượng ethanol trong máu được tính bằng phần trăm (%)

1.4 Giới thiệu về sắc ký khí [3], [4]

1.4.1 Đại cương về sắc ký:

* Sắc ký là một trong những phương pháp phân tích được ứng dụng rộng rãi nhất hiện nay, vì nó là phương pháp có độ nhạy cao và khả năng định lượng tốt, phù hợp để xác định nhiều đối tượng khác nhau như các chất khó hoặc dễ bay hơi, chất phân cực hoặc kém phân cực, Phương pháp này do nhà bác học Nga M.X.Txvet phát minh ra vào năm 1930

* Nguyên tắc cơ bản của sắc ký: Dựa vào sự khác biệt về ái lực của các

cấu tử trong hỗn hợp chất cần phân tích với pha động và pha tĩnh Pha động

có thể là chất lỏng hoặc khí, có tác dụng lôi kéo các chất cần tách di chuyển trong cột sắc ký có chứa pha tĩnh Pha tĩnh là chất lỏng nhớt được phủ trên bề mặt bên trong của cột mao quản hoặc là những hạt chất rắn nhỏ được nhồi vào cột có tác dụng giữ chất ở lại Để tách được các chất từ một hỗn hợp cần có sự tác động của cả pha tĩnh và pha động Sự tác động này là khác nhau đối với từng cấu tử Vì vậy khi cho hỗn hợp chất cần phân tích đi qua bề mặt pha tĩnh thì các cấu tử sẽ bị tách khỏi nhau, từ đó có thể định tính cũng như định lượng chúng

Nói cách khác, sắc ký là một phương pháp phân tích có nguyên lý dựa trên hai quá trình hấp thụ (hấp phụ) và giải hấp liên tục giữa pha tĩnh và pha động

* Phân loại: Tùy theo bản chất của pha động mà chúng ta chia thành

hai loại sắc ký:

- Sắc ký lỏng: Có pha động là chất lỏng, pha động có thể là một loại dung môi hay hỗn hợp nhiều loại dung môi Các phương pháp sắc ký lỏng thông dụng gồm: Sắc ký hấp phụ, sắc ký phân bố và sắc ký ion

- Sắc ký khí: Có pha động là khí trơ, không có lực tương tác hóa học hay vật lý với chất cần phân tích Trong phương pháp sắc ký khí, dựa vào đầu

dò (detector) có thể phân loại thành các kỹ thuật sau:

+ Sắc ký khí đầu dò dẫn nhiệt (GC-TCD)

+ Sắc ký khí đầu dò ion hoá ngọn lửa (GC-FID)

+ Sắc ký khí đầu dò bắt điện tử (GC- ECD)

+ Sắc ký khí đầu dò quang hoá ngọn lửa (GC- FPD)

+ Sắc ký khí đầu dò ion hoá phát xạ (GC- TID hoặc GC- NPD) + Sắc ký khí ghép khối phổ (GC- MS)

1.4.2 Các đại lượng cơ bản trong phương pháp sắc ký:

1.4.2.1 Hệ số phân bố:

- Cân bằng của cấu tử trong hệ sắc ký được mô tả bằng phương trình sau:

Xpha động  Xpha tĩnh

- Hằng số cân bằng cho cân bằng này được gọi là tỉ lệ phân bố hay hệ

số phân bố (partition coefficient), được tính như sau:

K = C S / C M

Với CS: nồng độ cấu tử trong pha tĩnh; CM: nồng độ cấu tử trong pha động

Hệ số k phụ thuộc vào bản chất pha tĩnh, pha động và chất phân tích

Các chất tan trong hỗn hợp mẫu phân tích khi được nạp vào cột sắc ký thì chúng sẽ bị lưu giữ trên pha tĩnh trong một thời gian nhất định gọi là thời gian lưu Thời gian lưu này được tính từ lúc nạp mẫu vào cột tách sắc ký cho đến lúc chất tan được rửa giải hoàn toàn ra khỏi cột, tại thời điểm đó chất phân tích có nồng độ cực đại

Với tR: thời gian lưu của cấu tử chất phân tích (min); t0: thời gian để cho chất hoàn toàn không có ái lực với pha tĩnh đi qua cột hay là thời gian từ khi pha động đi vào cột đến khi ra khỏi cột và còn gọi là thời gian chết (min);

tR’: thời gian lưu hiệu chỉnh (min)

K’ = tR - t0

t0 Nếu K’ ~0tR~ t0: Chất ra sớm nhất, cột không có khả năng giữ chất lại Suy ra:

+ K’ càng nhỏ thì mũi các chất ra nhanh và khả năng tách kém

+ K’ càng lớn (tR càng lớn) chất ở trong cột càng lâu, thời gian phân tích càng dài thì mũi sắc ký có khả năng bị tù

+ Khoảng K’ lý tưởng là từ 2-5, nhưng khi phân tích một hỗn hợp phức tạp thì K’ có thể chấp nhận 1-20

1.4.2.4 Số đĩa lý thuyết của cột:

Số đĩa lý thuyết (N) của cột đặc trưng cho khả năng tách mũi sắc ký của các cấu tử trên cột

Với Wb: bề rộng đáy của mũi sắc ký; W1/2: bề rộng đáy của mũi sắc ký

ở phân nữa chiều cao

Hình 1.2: Mô tả cách tính số đĩa lý thuyết

Số đĩa lý thuyết càng lớn và bề rộng Wb càng nhỏ thì mũi sắc ký càng nhọn

Khi chiều cao của cột không đổi, số đĩa lý thuyết tăng thì hiệu năng tách của cột càng cao

1.4.2.6 Độ phân giải:

Độ phân giải (RS) được dùng để đánh giá khả năng tách hai mũi sắc ký gầnnhau

Với: tR1 và tR2: thời gian lưu của cấu tử thứ nhất và thứ hai;

W1 và W2: bề rộng đáy của mũi sắc ký thứ nhất và thứ hai;

α: độ chọn lọc của cột sắc ký cho hai cấu tử 1 và 2

Trường hợp RS = 1 thì hai mũi có độ lớn tương tự nhau sẽ được phân tách khỏi nhau khoảng 95%

Nếu RS = 1,5 thì sự phân giải được coi là hoàn toàn (99,7%)

1.4.3 Các bộ phận chính của máy sắc ký khí:

Hình 1.3: Sơ đồ thiết bị sắc ký khí

1.4.3.1 Khí mang:

Pha động trong sắc ký khí hay còn gọi là khí mang giữ vai trò vận chuyển chất phân tích dọc theo cột sắc ký và tiếp nhận các phân tử chất phân tích đã bị giữ lại trước đó giải hấp đi tới để tiếp tục tương tác với các phần khác của bề mặt pha tĩnh

Điều kiện để một khí được sử dụng làm khí mang:

* Tiêm chia dòng: Mẫu được tiêm vào buồng tiêm, tại đây toàn bộ mẫu

được hoá hơi, đồng thời cuối buồng tiêm van xả được mở ra phần lớn hơi sẽ theo van ra ngoài, chỉ một phần nhỏ được giữ lại đưa vào cột

- Tỉ lệ Vra/Vcột gọi là tỉ lệ chia dòng, tỉ lệ này thường từ 20:1 - 100:1

- Các thông số để đánh giá phương pháp tiêm chia dòng là: Nhiệt độ buồng tiêm, tỉ số chia dòng, áp suất khí mang, …

- Phương pháp tiêm chia dòng cho mũi sắc ký nhọn, phù hợp về mặt định tính Về mặt định lượng thì không tốt bởi vì tỉ lệ chia dòng sẽ thay đổi tuỳ thuộc điều kiện tiêm và nhất là đối với các hỗn hợp mẫu chứa các chất có

khả năng bay hơi khác nhau

- Phương pháp tiêm chia dòng phù hợp cho phân tích mẫu có hàm lượng lớn, nhưng không phù hợp cho phân tích lượng vết do lượng mẫu vào cột rất ít

* Tiêm không chia dòng: Toàn bộ mẫu được chuyển thẳng vào cột,

tiêm không chia dòng sử dụng buồng tiêm giống như tiêm chia dòng nhưng khác ở chỗ trong quá trình tiêm mẫu van thoát khí sẽ đóng lại Thời gian tiêm không chia dòng từ 40-90 giây, thể tích tiêm 1-2µl

- Nhiệt độ cột sắc ký lúc đầu thấp, sau đó tăng lên Nhiệt độ đầu thấp hơn nhiệt độ của dung môi 20-300C, khi vào đầu cột gặp nhiệt độ thấp hơn hỗn hợp hơi sẽ đọng lại (gồm hơi chất phân tích và hơi dung môi) như vậy sẽ giúp lôi kéo toàn thể chất phân tích trong buồng tiêm vào cột Khi tăng nhiệt

độ hơi dung môi ra trước, các chất phân tích từ từ ra sau cho mũi tương đối nhỏ

- Phương pháp này thích hợp cho phân tích dạng vết, siêu vết nhưng không dùng cho chất có nhiệt độ sôi thấp hơn dung môi

- Độ giảm áp suất nhỏ với một tốc độ khí mang nhất định

- Vật liệu dùng chế tạo cột phải có tính bền ở nhiệt độ cao

 Cột sắc ký được chia làm hai loại cột nhồi và cột mao quản:

* Cột nhồi: Vật liệu làm cột nhồi thường là thủy tinh, poly

tetrafluoethylene, thép không gỉ, niken hoặc đồng Chiều dài của cột từ 1-3m

Do các hạt nhồi thường làm giảm áp suất lớn nên các cột thường ngắn hơn

3m Đường kính của cột khoảng 1/8 đến 1/4 inches Đối với cột nhồi yếu tố quan trọng nhất chính là pha tĩnh của cột bởi nó quyết định tính chọn lọc của cột

- Cột nhồi thường cho hiệu quả tách thấp Một cột có chiều dài 1m được nhồi bởi các hạt có kích thước 125-150µm và không bao giờ tạo ra quá

3000 đĩa lý thuyết

- Tuy nhiên cột nhồi cũng có những ưu điểm nhất định như: Hệ số lưu giữ cao, thích hợp với các detector có thể tích lớn, dung lượng mẫu cao, ít chịu ảnh hưởng của chất bẩn trong mẫu nên ít tốn công tinh chế mẫu

* Cột mao quản: Là loại cột tách có đường kính nhỏ hơn 1mm và thành

trong của cột được tẩm pha tĩnh Nhờ cấu trúc đặc biệt này của cột mao quản, khí mang sẽ đưa mẫu đi qua cột tách rất dài (do vậy năng suất tách cao) mà không gặp trở kháng gì lớn (độ chêch lệch áp suất thấp) So với cột nhồi thì cột mao quản có ưu điểm là:

- Các hỗn hợp phức tạp được tách với hiệu suất cao hơn hẳn

- Tách được cả các chất có cấu trúc hoá học rất gần nhau

- Độ tin cậy cao hơn trong việc nhận biết các cấu tử

- Độ nhạy phát hiện cao hơn

- Giảm thời gian phân tích

- Cho phép nối trực tiếp với khối phổ kế mà không cần bộ tách Cột mao quản được chia làm hai loại chính:

+ Cột WCOT (Wall Coated Open Tubular): Kết cấu gồm một ống mao quản bằng fused silica được phủ trực tiếp một lớp pha tĩnh Đường kính trong khoảng 0,2-0,5mm Bề dày df của lớp pha tĩnh này quyết định hệ

số lưu giữ và dung lượng của cột Ở nhiệt độ thường lớp pha tĩnh này ở dạng sệt gần như đặc, đây chính là dạng sắc ký khí-lỏng Nếu lớp pha tĩnh không được gắn lên thành cột mà qua một lớp trung gian thì ta có cột SCOT

(Support coated open tubular) với tính chất giống như cột WCOT Hầu hết các phép phân tích GC được thực hiện trên cột WCOT

+ Cột PLOT (Porous Layer Open Tubular): Cũng cấu tạo bởi một ống silica nóng chảy nhưng còn có thêm một lớp mỏng các hạt chất hấp phụ xốp đường kính dp đóng vai trò như chất mang giữa thành trong của cột tách và lớp film pha tĩnh Do lực cản áp suất thấp nên có thể sản xuất cột PLOT có độ dài lớn để tăng hiệu quả tách (50-100m) Cột thường có đường kính trong khoảng 0.53mm

Việc lựa chọn cột mao quản phụ thuộc vào bản chất và độ phức tạp của mẫu phân tích Chiều dài cột, đường kính trong của cột, pha tĩnh và độ dày của lớp phim pha tĩnh ảnh hưởng đến độ phân giải, thời gian phân tích và độ nhạy của phép đo

- Mỗi pha tĩnh đều có nhiệt độ chặn trên và chặn dưới Nhiệt độ chặn dưới được xác định bởi điểm nóng chảy, còn nhiệt độ chặn trên được xác định bởi áp suất hơi và độ bền nhiệt của pha tĩnh Nhiệt độ sử dụng tối đa phải thấp hơn điểm sôi khoảng 700

C sao cho áp suất hơi không vượt quá 1mmHg

- Tuy nhiên đối với các loại detector nhạy, nhiệt độ đó vẫn còn quá cao, đặc biệt đối với các pha tĩnh thuộc loại các hợp chất mà phân tử dễ bị bay hơi

sẽ làm thay đổi khả năng tách của cột Do vậy, điều quan trọng là tất cả các cột tách sau khi nhồi phải được luyện thật kỹ để thành phần trong cột trở nên

ổn định hoàn toàn

- Một nguyên tắc cơ bản để chọn pha tĩnh là: Pha tĩnh phân cực sẽ giữ tốt các chất phân cực, tương tự pha tĩnh không phân cực sẽ giữ tốt các chất không phân cực Lựa chọn pha tĩnh cho một dãy đồng đẳng không khó khăn, nhưng để tách các chất có điểm sôi tương tự nhau, phải chọn pha tĩnh sao cho

hệ số hoạt độ của chúng phải khác nhau

- Một số pha tĩnh thông dụng dùng cho cột mao quản trong sắc ký khí: + Pha tĩnh có độ phân cực thấp: Dimethyl polysiloxan; methyl polysiloxan;… dùng phân tích các hidrocarbon, thuốc trừ sâu có chứa vài nhóm phân cực

+ Pha tĩnh có độ phân cực cao hơn: Thêm vào các pha tĩnh có độ phân cực thấp các gốc phenyl, cyano

1.4.3.5 Đầu dò (detector):

- Detector là bộ phận ghi nhận sự xuất hiện và nồng độ các chất trong dòng khí mang Detector có nhiệm vụ chuyển hoá một đại lượng không điện (nồng độ của các chất được tách khỏi cột sắc ký) thành tín hiệu điện

- Tính chất cần có của một detector: Độ nhạy cao, có khả năng cho tính hiệu với nhiều loại hợp chất, khoảng tuyến tính rộng, cho tín hiệu nhanh, ổn định, độ ồn thấp

- Các loại detector thông dụng trong sắc ký khí:

+ Phổ quát: FID, TCD, MS

+ Chọn lọc: ECD

+ Bảo toàn chất phân tích: TCD

+ Phá huỷ chất phân tích: ECD, FPD, FID, MS

1.5 Phương pháp định tính và định lượng [3], [4], [6]

1.5.1 Phương pháp định tính:

Trong sắc ký thường có hai phương pháp định tính:

- Phương pháp 1: Dựa vào thời gian lưu tR của chất cần phân tích và chất chuẩn trong cùng điều kiện phân tích sắc ký

- Phương pháp 2: Thêm chuẩn vào mẫu, so sánh cường độ của chất cần phân tích trong mẫu ban đầu và mẫu thêm chuẩn (cường độ tăng) trong cùng điều kiện phân tích sắc ký

1.5.2 Phương pháp định lượng:

Diện tích (S) hay chiều cao (S) của peak sắc ký trên sắc ký đồ tỉ lệ thuận với nồng độ của chất, do đó từ diện tích hay chiều cao của peak ta có thể tính được chính xác nồng độ của mỗi hợp chất trong hỗn hợp cần phân tích

Có hai phương pháp dùng để định lượng:

1.5.2.1 Phương pháp ngoại chuẩn:

So sánh trực tiếp diện tích peak sắc ký của mẫu theo diện tích mũi sắc

ký của chất chuẩn từ đó suy ra nồng độ mẫu

Trong phương pháp này, chúng ta dùng chất chuẩn tinh khiết của chất cần xác định pha thành nhiều nồng độ khác nhau, dựng đường chuẩn theo diện tích peak trên sắc ký đồ và nồng độ chất phân tích Dựa vào đường chuẩn

và diện tích peak của chất cần phân tích trên sắc ký đồ có thể suy ra nồng độ chất cần phân tích

Phương trình đường chuẩn cho phương pháp ngoại chuẩn:

A = kC + b Với: A: diện tích peak sắc ký chất phân tích;

C: nồng độ chất phân tích

1.5.2.2.Phương pháp nội chuẩn:

So sánh gián tiếp peak sắc ký của chất phân tích theo diện tích peak sắc

ký của chất chuẩn thông qua diện tích của chất nội chuẩn, từ đó suy ra nồng

độ của chất phân tích trong mẫu

* Chất nội chuẩn được sử dụng cần có các tính chất:

- Có tính chất hoá - lý gần giống với chất cần phân tích

- Không hiện diện trong thành phần mẫu

- Có thời gian lưu gần với các chất cần phân tích nhưng phải tách hoàn toàn khỏi chất phân tích

- Cường độ tín hiệu đo tương đương với chất cần phân tích

- Không tham gia phản ứng với chất phân tích

* Phương pháp nội chuẩn có ưu điểm là cho kết quả chính xác hơn, tránh được sai số do thể tích mẫu đưa vào máy sắc ký không đều nhau.Tuy nhiên cũng có hạn chế do khó chọn được chất nội chuẩn phù hợp với điều kiện phân tích

* Phương trình đường chuẩn trong phương pháp nội chuẩn:

Ax/Anc = kCx + b Với: Ax, Anc : diện tích của chất cần phân tích và chất nội chuẩn;

a) Định nghĩa: Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích là

khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích

Khoảng làm việc của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ

giữa giới hạn trên và giới hạn dưới của chất phân tích (bao gồm cả các giới hạn này), tại đó được chứng minh là có thể xác định được bởi phương pháp nhất định với độ đúng, độ chính xác và độ tuyến tính như đã nêu

Hình 1.4: Mô tả khoảng tuyến tính và khoảng làm việc của đường chuẩn

b) Xác định khoảng tuyến tính:

Đối với hầu hết các phương pháp định lượng, cần phải thực hiện việc xác định khoảng tuyến tính Việc xác định khoảng tuyến tính thường được khảo sát từ giới hạn định lượng đến giới hạn tuyến tính (điểm thấp nhất - điểm cao nhất) Nói chung, để xác định khoảng tuyến tính cần khoảng 10 (tối thiểu là 6) nồng độ khác nhau

Để xác định khoảng tuyến tính cần đo các dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu vào nồng độ Vẽ đường cong phụ thuộc giữa tín hiệu đo và nồng độ, sau đó quan sát sự phụ thuộc cho đến khi không còn tuyến tính Khoảng tuyến tính dài hay ngắn phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đó quan trọng nhất là bản chất của chất cần phân tích và

1.6.1.2 Các phương pháp xây dựng đường chuẩn:

Sau khi xác định được khoảng tuyến tính cần xây dựng đường chuẩn và xác định hệ số hồi quy tương quan Trong phân tích thực tế, có thể xây dựng các đường chuẩn ngắn, trùm lên vùng nồng độ trong mẫu, không nhất thiết phải lập đường chuẩn toàn bộ khoảng tuyến tính Nồng độ trong mẫu không được vượt ra ngoài giới hạn thấp nhất và cao nhất của đường chuẩn, tốt nhất phải nằm ở vùng giữa đường chuẩn Một số phương pháp xây dựng đường chuẩn thường sử dụng:

a) Đường chuẩn với chuẩn tinh khiết:

Chuẩn bị dãy chuẩn (tối thiểu 6 nồng độ) Xác định các giá trị đo được

y theo nồng độ x (lặp lại 2 lần lấy giá trị trung bình) Nếu sự phụ thuộc tuyến

tính, ta có khoảng khảo sát đường biểu diễn là một phương trình: y = ax + b

Trong đó:

- y: diện tích peak; - x: Nồng độ

- a: giá trị độ dốc slope; - b: giá trị hệ số chặn intercept

Hệ số tương quan:

Nếu 0,995 < R ≤1 thì đường chuẩn có tương quan tuyến tính rõ rệt

b) Đường chuẩn trên nền mẫu trắng:

Phân tích các mẫu trắng thêm chuẩn với nồng độ khác nhau (ít nhất 6 nồng độ), trong khoảng tuyến tính ước lượng ở trên (lặp lại 3 lần lấy giá trị trung bình) Vẽ đường cong phụ thuộc giữa tín hiệu đo (trục tung y) phụ thuộc vào nồng độ (trục hoành x) như trên

Đường chuẩn xây dựng trên nền mẫu trắng thường cho độ tin cậy cao hơn khi xây dựng với chuẩn tinh khiết, do có thể loại trừ phần nào các ảnh

hưởng của nền mẫu Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp khó tìm được mẫu trắng phù hợp và không được có chất phân tích Do đó, có thể sử dụng phương pháp lập đường chuẩn trên nền mẫu thực như sau

c) Đường chuẩn trên nền mẫu thực:

Phân tích mẫu thực có cho thêm các nồng độ chuẩn khác nhau tương tự như trong phần làm với mẫu trắng Vẽ đường cong tín hiệu đo (trục tung y) phụ thuộc vào nồng độ chuẩn thêm (trục hoành x) như trên

Khi sử dụng đường chuẩn trên nền mẫu thực có thể loại trừ được cá cảnh hưởng của nền mẫu đến kết quả phân tích

d) Đường chuẩn có sử dụng nội chuẩn:

Một phương pháp rất hữu ích trong phân tích, đặc biệt trong phân tích hiện đại là sử dụng nội chuẩn Nội chuẩn được thêm vào dung dịch chuẩn với nồng độ phù hợp và giống nhau (Cnc).Vẽ đường cong phụ thuộc giữa tỷ lệ tín hiệu chất chuẩn chia cho nội chuẩn (Sc/Snc, trục tung y) phụ thuộc vào nồng

độ chất chuẩn (trục hoành x) Tính các hệ số hồi quy (a, b trong phương trình hồi quy y = ax + b) và hệ số tương quan (R) tương tự như trên

Khi phân tích mẫu, nội chuẩn cũng phải được thêm vào (tốt nhất là từ đầu, sau khi cân, đong) để sao cho tạo được nồng độ cuối cùng bằng nồng độ nội chuẩn trong các dung dịch chuẩn.Với cách tiến hành như thế này có thể hạn chế được hầu hết các ảnh hưởng trong quá trình phân tích (từ cân mẫu, chuẩn bị mẫu đến phân tích trên thiết bị) đến kết quả phân tích

* Điều kiện cơ bản của chất nội chuẩn:

- Có các tính chất hóa lý gần giống chất phân tích

- Phân tích được bằng phương pháp đang thực hiện

1.6.1.3 Các lưu ý:

a) Khi xây dựng đường chuẩn:

- Cần đảm bảo nồng độ chuẩn chính xác, vì đường chuẩn là yếu tố sống

còn, quyết định mức độ đúng của kết quả phân tích, do đó nếu trong quá trình xây dựng đường chuẩn mắc những sai số lớn sẽ dẫn đến sự mất độ chính xác của kết quả Điều đầu tiên để kiểm soát được độ chính xác của các nồng độ chuẩn khi xây dựng đường chuẩn là cần đảm bảo độ chính xác của chất chuẩn (chất chuẩn mua từ nhà sản xuất) về hàm lượng, độ tinh khiết

- Theo yêu cầu của ISO 17025, các chất chuẩn khi sử dụng cần có chứng nhận của nhà sản xuất và vẫn còn hạn sử dụng Trong một số trường hợp, có thể bố trí các thí nghiệm để đánh giá chất lượng các chất chuẩn trước khi đưa vào sử dụng

- Tín hiệu các lần đo của mỗi nồng độ phải có độ lặp lại đạt yêu cầu: Khi thẩm định phương pháp, mỗi nồng độ cần được đo vài lần (3 lần) để kiểm tra độ lặp của các nồng độ chuẩn

- Loại trừ sai số thô nếu cần thiết: Một số trường hợp, có thể gặp các sai

số thô (ngẫu nhiên) xuất hiện dẫn đến việc đường chuẩn không đáp ứng yêu cầu Trong trường hợp này, có thể cân nhắc loại trừ các điểm này để đảm bảo

sự chính xác

b)Giới hạn chấp nhận của đường chuẩn:

- Hệ số hồi quy tuyến tính (R): Chỉtiêu đầu tiên của một đường chuẩn đạt yêu cầu là hệ số tương quan hồi quy (Coefficient of correlation) R phải đạt theo yêu cầu sau: 0,995 ≤ R ≤ 1 hay 0,99 ≤ R2 ≤1

- Độ chệch các điểm nồng độ dùng xây dựng đường chuẩn Sau khi lập đường chuẩn xong cần kiểm tra bằng phương pháp tính ngược lại nồng độ của các điểm chuẩn sử dụng để xây dựng đường chuẩn, từ đó tính các giá trị độ chệch theo công thức sau:

Trong đó:

Δi : Độc hệch của từng điểm chuẩn dùng xây dựng đường chuẩn

Ct : Nồng độ tính ngược theo đường chuẩn của các điểm chuẩn

Cc : Nồng độ của các điểm chuẩn

1.6.2 Phương pháp một điểm chuẩn

Nguyên tắc định lượng của phương pháp một điểm chuẩn cũng giống như phương pháp xây dựng đường chuẩn là dựa vào diện tích peak của chất cần phân tích (Sm) hay tỉ lệ của peak chất cần phân tích trên diện tích peak chất nội chuẩn Sm/Snc

Ở phương pháp này, chúng ta chỉ chọn 1 điểm chuẩn phù hợp (điểm chuẩn có nồng độ gần với mẫu thử) và tính kết quả theo phương pháp tam xuất

Giới hạn phát hiện là nồng độ mà tại đó giá trị xác định được lớn hơn

độ không đảm bảo đo của phương pháp, đây là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu có thể phát hiện được nhưng chưa thể định lượng

tại đó tín hiệu lớn gấp 2  3 lần nhiễu đường nền, thông thường lấy: S/N =3

quả có độ chụm như mong muốn LOQ chỉ áp dụng đối với các phương pháp định lượng

Giống như LOD, có nhiều cách khác nhau để xác định LOQ, phụ thuộc vào từng phương pháp cụ thể mà lựa chọn cho phù hợp

Việc xác định LOQ cần tính đến các yếu tố ảnh hưởng trong mẫu phân tích, do đó cần thực hiện trên nền mẫu thật LOQ trong nhiều trường hợp có thể là điểm thấp nhất của khoảng tuyến tính

Hình 1.6: Mô tả mối quan hệ giữa LOD, LOQ và khoảng tuyến tính 1.7.2.2.Cách xác định:

Cũng có nhiều cách để xác định LOQ Trong đề tài này, chúng tôi cũng chọn phương pháp xác định LOQ dựa trên tỉ lệ chất phân tích trên tính hiệu nhiễu đường nền

LOQ được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10  20 lần nhiễu đường nền, thông thường thường lấy: LOQ = S/N = 10

Trong thực nghiệm, LOQ được tính thông qua LOD như sau:

LOQ = (10.LOD)/3

1.8 Phương pháp khảo sát độ lặp lại [4], [6]

- Khi chọn thiết bị và xây dựng phương pháp để phân tích thì chúng ta cần khảo sát nhiều yếu tố như: Độ lặp lại, độ tái lặp, độ ổn định, độ đúng, … của quy trình và thiết bị phân tích để xác định các điều kiện tối ưu

- Xác định độ lặp lại nhằm mục đính đánh giá độ chính xác của qui trình khi thực hiện trong cùng điều kiện về thiết bị, phòng thí nghiệm, con người trong một khoảng thời gian ngắn

- Trong giới hạn của đề tài, chúng tôi chỉ khảo sát độ lặp lại (độ ổn định) của thiết bị và độ lặp lại của phương pháp trên hai nền mẫu là: Mẫu chuẩn và mẫu thử, tính toán kết quả theo công thức sau:

- RSD: Độ lệch chuẩn tương đối (độ lặp lại)

* Theo quy định của nhiều tổ chức châu Âu thì RSD% (thiết bị) <= ± 2%; RSD% (phương pháp) <= ± 15% cho tất cả các nồng độ, riêng ở nồng độ LOQ có thể chấp nhận giới hạn ± 20%

1.9 Phương pháp khảo sát hiệu suất thu hồi [4], [6]

* Để đánh giá một phương pháp, người ta thường xác định độ đúng của

nó Độ đúng của phương pháp là khái niệm chỉ mức độ gần nhau giữa kết quả

1

) (

n

i

i