XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG KHÁNG SINH TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC – MSMS (Liquid Chromatography – Mass SpectrometryMass Spectrometry)

Phương pháp phân tích kháng sinh sử dụng hệ thống sắc ký lỏng khối phổ hai lần Liquid Chromatography – Mass Spectrometry/Mass Spectrometry hãng Waters được thực hiện để xác định hàm lượn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  

       

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG KHÁNG SINH TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC – MS/MS (Liquid Chromatography – Mass Spectrometry/Mass Spectrometry)

     Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện : NGUYỄN THỊ KIM NGÂN Niên khóa : 2008 - 2012

 

 

     

  

Tháng 07 năm 2013

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

  XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG KHÁNG SINH TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC – MS/MS (Liquid Chromatography – Mass Spectrometry/Mass Spectrometry)

   

ThS NGUYỄN VĂN SANG

         

Tháng 07 năm 2013

iii

 

LỜI CÁM ƠN

Em xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Cô Phùng Võ Cẩm Hồng

Cảm ơn Cô đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, động viên và truyền đạt những kiến thức

quí báu để em có thể hoàn thành bài khóa luận này

Em xin chân thành cảm ơn tất cả các Thầy Cô bộ môn Công nghệ sinh học

trường Đại Học Nông Lâm -TPHCM đã tận tụy giảng dạy cho em trong những năm

học tập ở trường

Với tất cả lòng thành, tôi trân trọng nhớ ơn ThS Phùng Võ Cẩm Hồng và ThS

Nguyễn Văn Sang đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong

suốt thời gian thực hiện đề tài và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Tôi chân thành cám ơn các anh chị trong Trung Tâm Kĩ Thuật Tiêu Chuẩn Đo

Lường Chất Lượng 3 đã tận tình hướng dẫn tôi trong thời gian thực hiện đề tài tại

Trung tâm

Tôi cám ơn tập thể lớp DH08SH đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt

thời gian làm đề tài

Con thành kính ghi ơn ba mẹ cùng những người thân trong gia đình luôn tạo

điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập

Tôi xin chân thành cảm ơn bạn Mỹ Hạnh, Thùy Dung, Thị Hoa, Kim Thoa đã

động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Tp.Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2013

Nguyễn Thị Kim Ngân

Phương pháp phân tích kháng sinh sử dụng hệ thống sắc ký lỏng khối phổ hai lần (Liquid Chromatography – Mass Spectrometry/Mass Spectrometry) (hãng Waters) được thực hiện để xác định hàm lượng 18 loại kháng sinh (Arsanilic, Roxarsone, Virginiamycin, Clopidol, Lasalocid, Monensin, Nitarsone, Salinomycin, Narasin, Amprolium, Tylosin, Decoquinate, Licomycin, Bacitracin, Oxytetracyline, Chlotetracyline, Sulfadimethoxin, Tetracycline) trong các mẫu thức ăn chăn nuôi.

Đề tài: “Xác định hàm lượng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi bằng phương pháp LC – MS/MS” được tiến hành tại phòng Sắc ký – Quang phổ thuộc Trung tâm

Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng 3 từ tháng 02/ 2012 đến tháng 06/2012, với mục đích: Khảo sát định tính và định lượng 18 loại kháng sinh có trong mẫu thức

ăn chăn nuôi, từ đó tối ưu hóa quy trình phân tích các loại kháng sinh trên những nền mẫu thức ăn khác nhau

Đề tài đã đạt được những kết quả sau: hiệu suất thu hồi của phương pháp là khá cao nằm trong khoảng 87 % đến 115%, kết quả cho độ lặp lại tốt, giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp trên các loại kháng sinh là khá thấp, khoảng từ 0,2 – 2,2 µg/kg, hàm lượng các loại kháng sinh nằm trong khoảng 0,5 – 17,6 µg/g

Từ những kết quả đạt được ở trên, chúng tôi thấy rằng việc xác định hàm lượng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi bằng phương pháp LC – MS/MS kết hợp với quy trình xử lý mẫu hợp lý cho kết quả khá chính xác Phương pháp này có thể đưa ra để phân tích các mẫu thật

The analysis of antibiotics using Liquid Chromatography - Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry) system was performed to determine eighteen antibiotics (Arsanilic, Roxarsone, Virginiamycin, Clopidol, Lasalocid, Monensin, Nitarsone, Salinomycin, Narasin, Amprolium, Tylosin, Decoquinate, Salinomycin, Bacitracin, Oxytetracyline, Chlotetracyline, Sulfadimethoxin, Tetracycline) in animal feed

The results were achieved: the recovery of the method is quite high in the range

of 87% to 115%, the results for good repeatability, limit of detection (LOD) of the method is quite low, from 0.2 – 2.2 µg/kg, concentration of antibiotics in the range of 0.5 – 17.6 µg/g

From the above results has been shown that antibiotics content is determined by LC–MS/MS method with the processing of samples according appropriate procedure for quite accurate result This method can provide for the analysis of real samples Key words: Antibiotics, LC-MS/MS

vi

 

MỤC LỤC

Trang

Lời cảm ơn i

Tóm tắt iv

Summary iv

Mục lục ivi

Danh sách các chữ viết tắt vii

Danh sách các hình viii

Danh sách các bảng ix

Chương 1 MỞ ĐẦU i

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu ii

1.3 Nội dung thực hiện 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu chung về kháng sinh iii

2.1.1 Khái niệm kháng sinh 3

2.1.2 Phân loại kháng sinh 3

2.1.3 Sử dụng kháng sinh 5

2.1.3.1 Tình hình sử dụng kháng sinh ở Việt Nam và một số nước trên thế giới 5

2.1.3.2 Các trường hợp sử dụng kháng sinh 5

2.1.3.3 Tiêu chí lựa chọn kháng sinh 5

2.1.3.4 Các vấn đề tồn tại khi sử dụng kháng sinh không đúng 5

2.1.4 Lợi ích của sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi và cơ chế tác động 6

2.1.4.1 Lợi ích của việc sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi 6

2.1.4.2 Cơ chế tác động của kháng sinh như chất kích thích tăng trưởng 6

vii

 

2.1.4.3 Mặt trái của kháng sinh 7

2.2 Phương pháp sắc ký 9

2.2.1 Lịch sử phương pháp sắc ký 9

2.2.2 Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký 10

2.2.3 Phân loại sắc ký 10

2.3 Giới thiệu về hệ thống LC-MS/MS API 4000 được dùng trong nghiên cứu 11

2.3.1 LC Agilent 1200 11

2.3.2 Khối phổ API 4000 12

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

3.1 Thời gian, địa điểm thực hiện đề tài 17

3.2 Vật liệu nghiên cứu 17

3.3 Chuẩn bị dung dịch chất chuẩn làm việc 18

3.4 Phương pháp nghiên cứu 20

3.4.1 Phương pháp phân tích kháng sinh 21

3.4.2 Tối ưu hóa các thông số kỹ thuật của hệ thống LC – MS/MS 23

3.4.2.1 Điều kiện phân tích các kháng sinh thuộc nhóm 1 23

3.4.2.2 Điều kiện phân tích các loại kháng sinh thuộc nhóm 2 24

3.5 Xử lý kết quả 25

3.5.1 Xử lý định tính 25

3.5.2 Xử lý định lượng 25

3.5.3 Khảo sát hiệu suất thu hồi của quy trình phân tích 26

3.5.4 Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 27

3.5.4.1 Định nghĩa LOD, LOQ 27

3.5.4.2.Cách xác định giới hạn LOD, LOQ 27

3.5.5 Khảo sát trên mẫu thật 27

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

4.1 Kết quả khảo sát độ tuyến tính của các loại kháng sinh 28

viii

 

4.2 Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi của quy trình phân tích 29

4.3 Kết quả khảo sát giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp 34

4.4 Kết quả khảo sát trên mẫu thật 35

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 36

5.1 Kết luận 36

5.2 Đề nghị 36

TÀI LIỆU THAM KHẢO 37

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ix

 

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ACN: Acetonnitril

BMCNSH: Bộ môn Công nghệ Sinh học

CE: Collision Energy

CN: Chăn nuôi

CNSH–MT: Viện Công nghệ Sinh học – Môi trường

CXP: Collision Cell Exit Potential

HPLC: High Performance Liquid Chromatography

ISO: International Standard Organization

x

 

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Hệ thống LC-MS/MS API 4000 11

Hình 2.2 Nguồn ion Turbo V 12

Hình 2.3 Sơ đồ bộ phân tích khối của khối phổ API 4000 13

Hình 2.4 Hình 1 tứ cực 14

Hình 2.5 Hình bộ ghi tín hiệu của khối phổ API 4000 15

Hình 3.1 Sơ đồ tóm tắt các bước thực nghiệm 20

Hình 3.2 Quy trình xử lý mẫu thức ăn chăn nuôi 22

 

 

 

xi

 

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Hàm lượng kháng sinh cho phép trong thức ăn hỗn hợp cho lợn 8

Bảng 2.2 Hàm lượng kháng sinh cho phép trong thức ăn hỗn hợp cho gà 9

Bảng 3.1 Các chất chuẩn dùng trong việc xác định hàm lượng kháng sinh 18

Bảng 3.2 Cách pha dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian 19

Bảng 3.3 Cách pha dung dịch chuẩn làm việc 20

Bảng 3.4 Chương trình đẳng dòng thành phần pha động 23

Bảng 3.5 Điều kiện khối phổ của 9 loại kháng sinh nhóm 1 24

Bảng 3.6 Chương trình đẳng dòng thành phần pha động 24

Bảng 3.7 Điều kiện khối phổ của 9 loại kháng sinh nhóm 2 25

Bảng 4.1 Kết quả khảo sát độ tuyến tính của các loại kháng sinh 28

Bảng 4.2 Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi của quy trình (thêm chuẩn 50 ppb) 30

Bảng 4.3 Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi của quy trình (thêm chuẩn 100 ppb) 31 Bảng 4.4 Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi của quy trình (thêm chuẩn 200 ppb) 32 Bảng 4.5 Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi của quy trình phân tích 33

Bảng 4.6 Kết quả khảo sát LOD, LOQ của phương pháp 34

Bảng 4.7 Kết quả khảo sát hàm lượng các loại kháng sinh trong mẫu thật 35

Hiện đã biết trên 8000 chất kháng sinh và mỗi năm có khoảng vài trăm chất kháng sinh mới được phát hiện Trong tương lai chắc chắn còn có nhiều chất kháng sinh khác nữa cũng sẽ được tìm ra vì đa số các vi sinh vật có khả năng tạo thành chất

kháng sinh đã được nghiên cứu cho tới nay đều chỉ thuộc về các chi Streptomyces và

Bacillus Nhiều nhà nghiên cứu về các chất kháng sinh tin rằng sẽ có nhiều chất

kháng sinh mới được phát hiện nếu tìm thêm ở các nhóm vi sinh vật khác Mặt khác các kỹ thuật của công nghệ di truyền sẽ cho phép thiết kế một cách nhân tạo các chất kháng sinh mới khi mà các chi tiết về bản đồ gen của các vi sinh vật sản sinh chất kháng sinh đã được biết rõ

Ngày nay, chất kháng sinh được sử dụng rộng rãi trong ngành nông nghiệp như chăn nuôi, trồng trọt, nuôi trồng thủy hải sản, có tác dụng rất lớn là giúp cho vật nuôi, cây trồng chống lại bệnh tật từ vi sinh vật Tuy vậy, chất kháng sinh như một con dao hai lưỡi Một mặt giúp sinh vật chống lại bệnh tật, mặt khác, có thể làm cho sinh vật xuất hiện phản ứng phụ, và đặc biệt là lượng chất kháng sinh tồn dư trong sinh vật có thể ảnh hưởng đến chất lượng thực phẩm, nhất là sức khỏe người tiêu dùng

Với một lượng thực phẩm khổng lồ từ động vật đang được tiêu thụ trên thị trường, song ít ai nghĩ đến việc mỗi ngày trong cơ thể chúng ta đang phải tích lũy dần dần dư lượng chất kích thích tăng trọng và thuốc kháng sinh trong từng miếng thịt động vật của các loại sản phẩm này Bởi trong chăn nuôi gia súc, gia cầm hiện nay, người dân sử dụng rất tùy tiện các loại thức ăn tăng trọng và thuốc kháng sinh nhằm ngăn ngừa, trị bệnh và giúp vật nuôi mau ăn chóng lớn Hậu quả là dư lượng chất kích thích và thuốc kháng sinh trong thịt gia súc, gia cầm vượt ngưỡng cho phép gấp

Thao tác thực hiện thí nghiệm chính xác

Xử lý mẫu đưa vào phân tích có độ tinh sạch cao

Sử dụng hệ thống LC-MS/MS để tiến hành xử lý và phân tích các mẫu thức ăn chăn nuôi tại phòng Sắc ký-Quang phổ thuộc Trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng 3

1.3 Nội dung thực hiện

Khảo sát khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn 5 điểm của 18 loại kháng sinh ở các nồng độ khác nhau cho độ tuyến tính cao để quá trình phân tích định lượng kháng sinh trong các mẫu thức ăn chăn nuôi được phân tích bằng thiết bị LC-MS/MS đạt kết quả chính xác và sai số trong mức cho phép

Định lượng kháng sinh có trong mẫu thử để xác định hiệu suất thu hồi nhằm đánh giá độ đúng, độ lặp lại và độ tái lặp của quy trình phân tích

Nhằm đánh giá độ nhạy của phương pháp, đề tài khảo sát giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

Khảo sát trên một số mẫu nền thực tế khi các điều kiện phân tích đã tối ưu

iii

 

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu chung về kháng sinh

2.1.1 Khái niệm kháng sinh

Kháng sinh (antibiotics) là những chất chuyển hóa vi sinh vật hay chất tương đồng tổng hợp, hoặc chất tổng hợp không liên quan đến những chất thiên nhiên, ở liều nhỏ các chất này ức chế sự phát triển và sống sót của vi sinh vật mà không có độc tính trầm trọng trên ký chủ

Năm 1909 nhà vật lý học người Đức (Paul Ehrlich) đã tạo ra một chất và đặt tên

là Salvarsan dùng điều trị bệnh giang mai rất có hiệu quả Năm 1928 Alexander Fleming - một nhà vi trùng học người Anh phát hiện ra penicillin Bốn năm sau (1932) Gerhard Domagk (nhà vật lý học người Đức) phát hiện ra sulfanilamide Năm

1944 Wakeman tìm ra streptomycine

Việc phát hiện ra kháng sinh và các đặc tính của chúng đã tạo ra một cuộc cách mạng trong y học và cứu loài người thoát khỏi nhiều thảm dịch do vi trùng gây ra Việc sử dụng kháng sinh trong thức ăn (TA) chăn nuôi được đánh dấu bằng một thí nghiệm của Stokstad và Juke (1949) khi cho gia cầm ăn TA có bổ sung aureomycin, nhận thấy tốc độ sinh trưởng và hiệu quả sử dụng TA của gia cầm tăng rõ rệt Từ đó rất nhiều công trình nghiên cứu về kháng sinh như chất bổ sung trong TA chăn nuôi được thực hiện và bắt đầu từ những năm 1950 và 1960 của thế kỷ 20, một kỷ nguyên mới của ngành chăn nuôi đã được mở ra khi kháng sinh được coi như một yếu tố không thể thiếu và đã tạo nên một bước đột phá về năng suất và hiệu quả chăn nuôi ở nhiều nước trên thế giới

2.1.2 Phân loại kháng sinh

 Nhóm penicillin: là nhóm kháng sinh đầu tiên được phát hiện ra Ban đầu

penicillin được chiết xuất từ nấm penicillium notatum Bây giờ penicillin được

tổng hợp nhiều từ một số loại hóa chất khác Các dòng penicillin gồm có :

- Penicillin G và penicillin V : là 2 loại được tổng hợp lần đầu tiên

- Aminopenicillin : là penicillin bán tổng hợp gồm có ampicillin, amoxillin

- Các penicillin kháng enzyme penicillinase: oxacillin, methicillin, chloxacillin

rét,

 Nhóm macrolide: erythromycin, spiramycin, azthromycin, rovamycin, tylosin Là kháng sinh có hoạt phổ kháng khuẩn rộng, tác dụng mạnh hơn trên gram âm, nhóm này hầu hết được thải trừ qua thận Độc tính trên thận (gây hoại tử ống thận cấp) và thính giác (gây ù tai, điếc) nếu dùng kéo dài Các thuốc của nhóm như: gentamycin, novomycin các thuốc này hầu hết không hấp thu qua đường tiêu hóa, nếu dùng điều trị nhiễm khuẩn toàn thân thì phải dùng dạng tiêm

 Nhóm lincoxinamid: như Lincocine

 Nhóm quinolon: ciprofloxacin, ciprofloxacin-d8, oxolinic acid, danofloxacin, enrofloxacin, difloxacin, sarafloxacin, ofloxacin, norfloxacin

 Nhóm Aminosid: có từ nguồn gốc vi sinh, có phổ tác dụng rộng, chủ yếu trên

vi khuẩn Gram(-), theo nguồn gốc vi sinh có thể chia ra:

- Thuốc chiết xuất từ nấm Streptomyces: Streptomicin, Dihydrostreptomycin, Kanamycin, Neomycin, Paromomycin,

- Thuốc chiết xuất từ Microspora: Gentamicin, Sisimicin,

- Sau này, khi thay đổi cấu trúc của các hợp chất tự nhiên nói trên, người ta thu được các thuốc bán tổng hợp như: Amikacin, Netilmicin, Dibekacin,

 Nhóm Chloramphenicol (hay Phenicol): gồm 2 kháng sinh

- Chloramphenicol: thường được gọi là Chlorocid, được phân lập từ nấm Streptomyces, nay sản xuất bằng phương pháp tổng hợp toàn phần Có tác

2.1.3.1 Tình hình sử dụng kháng sinh ở Việt Nam và một số nước trên thế giới

Ở Việt Nam, có 143 loại biệt dược chứa kháng sinh đang được sử dụng trong chăn nuôi, trong đó có 36 loại kháng sinh đang được sử dụng phổ biến như: Colistin, Enrofloxacin, Sulfamide, Trimethoprim, Gentamycin, nhóm Tetracycline, …

Ở Úc, từ giai đoạn 1992 – 1997 có khoảng 55,8% lượng kháng sinh nhập khẩu được sử dụng; 36,4% sử dụng cho người và 7,8% cho thú y

Tại Mỹ, có khoảng 6 triệu pound kháng sinh được sản xuất ra mỗi năm, trong

đó 60% sử dụng cho người, 40% dùng cho chăn nuôi (32% dùng cho phòng bệnh, 8% dùng điều trị bệnh gia súc gia cầm) (Barton, 2000)

Tại Châu Âu (1996 – 1997): 52% kháng sinh được sử dụng cho người, 33% cho thú y và 15% cho mục đích tăng trưởng bằng cách bổ sung trong chăn nuôi thú y Năm 1999, số lượng kháng sinh sử dụng tại Châu Âu và Thụy Sĩ ước tính là 13.288 tấn, trong đó có 65% dùng cho người, 29% dùng trong thú y và 6% dùng trong kích thích tăng trưởng (Nicole, 2008)

2.1.3.2 Các trường hợp sử dụng kháng sinh

- Sử dụng kháng sinh trong điều trị

- Sử dụng kháng sinh trong phòng bệnh

- Sử dụng kháng sinh với mục đích tăng trọng

2.1.3.3 Tiêu chí lựa chọn kháng sinh

- Sự hiểu biết về mức độ nhạy cảm với kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh

- Sự hiểu biết về tác động dược lý để đánh giá khả năng mà kháng sinh đi tới ổ

bệnh với nồng độ đủ ức chế hay tiêu diệt vi khuẩn

- Sự hiểu biết về độc tính của kháng sinh và các yếu tố làm tăng độc tính của nó

- Sự hiểu biết về chi phí của việc điều trị, đi kèm với hiệu quả điều trị

2.1.3.4 Các vấn đề tồn tại khi sử dụng kháng sinh không đúng

vi

 

Vi khuẩn gây bệnh tiếp xúc thường xuyên với kháng sinh liều thấp sẽ tạo thích ứng với một số chủng thay đổi cấu trúc ADN để chống lại kháng sinh, dần dần chúng biến kháng sinh thành yếu tố cần thiết để tránh sự tấn công của vi khuẩn khác

Đối với vật nuôi và con người: Gây rối loạn tiêu hóa, cơ thể mất đi sức đề kháng bản thân, sức chống chọi với bệnh tật ngày càng yếu Sử dụng kháng sinh thời gian dài làm tăng hiện tượng kháng kháng sinh, làm cho việc điều trị không hiệu quả Đối với chất lượng sản phẩm chăn nuôi: Vật nuôi ăn thức ăn bị nhiễm kháng sinh trong thời gian dài sẽ để lại lượng tồn dư kháng sinh trong sữa, gây ức chế vi khuẩn sử dụng trong chế biến các sản phẩm từ sữa như phomat, sữa chua,…

Đối với môi trường: Kháng sinh do vật nuôi đào thải ra ngoài môi trường trong thời gian dài, gây ảnh hưởng có hại đến môi trường sống, phá vỡ hệ sinh thái vi sinh vật đất, sự tồn tại và luân chuyển của nguồn gen kháng kháng sinh trong môi trường

2.1.4 Lợi ích của sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi và cơ chế tác động của kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi

2.1.4.1 Lợi ích của việc sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi

Trong chăn nuôi, kháng sinh (KS) được sử dụng với 3 mục đích: (1) điều trị bệnh; (2) phòng bệnh và (3) dùng như chất kích thích sinh trưởng Tuỳ theo mục đích

sử dụng mà liều lượng và phương thức sử dụng KS có khác nhau Có nhiều ý kiến khác nhau về lợi ích của việc sử dụng KS bổ sung trong thức ăn như chất kích thích sinh trưởng, nhưng tựu chung lại những lợi ích chính như sau:

- Tăng năng suất sinh trưởng và sinh sản ở gia súc, gia cầm

- Tăng hiệu quả sử dụng thức ăn, làm cho vật nuôi thích ứng nhanh chóng với

sự thay đổi bất thường về cơ cấu và chủng loại nguyên liệu trong khẩu phần ăn

- Nâng cao chất lượng sản phẩm (giảm tỷ lệ thịt mỡ, tăng tỷ lệ thịt nạc, làm cho thịt trở nên mềm hơn và không nhiễm mầm bệnh)

- Phòng các bệnh mạn tính và ngăn chặn xảy ra những dịch bệnh do vi trùng

- Tăng hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi

2.1.4.2 Cơ chế tác động của kháng sinh như chất kích thích sinh trưởng

Có rất nhiều thuyết khác nhau và mỗi thuyết đều có những cơ sở khoa học rất thuyết phục Dưới đây là một số giải thích về cơ chế tác động của KS như những chất kích thích sinh trưởng:

- Kiểm soát bệnh tật

vii

 

- Tiết kiệm chất dinh dưỡng

- Ảnh hưởng đến trao đổi chất

- Ảnh hưởng đến khả năng thu nhận thức ăn và nước uống

2.1.4.3 Mặt trái của kháng sinh

Kháng sinh cũng có những phản ứng phụ, tạo ra phản ứng của cơ thể đối với chất kháng sinh chẳng hạn như chứng ban đỏ và các triệu chứng khác Phản ứng trầm trọng nhất là dẫn tới tử vong Đôi khi, chất kháng sinh không có hữu hiệu đối với một

số vi khuẩn mầm bệnh

Theo một tài liệu của bộ môn Công nghệ thực phẩm, Đại học Bách Khoa Tp HCM, lượng kháng sinh tồn dư trong gia súc, gia cầm cao sẽ chuyển hóa protein thành các histamins gây chứng nhức đầu cho người sử dụng Người thường xuyên sử dụng gia súc, gia cầm nhiễm kháng sinh sẽ rất dễ bị “nhờn” thuốc, khi bị bệnh khó chữa trị do lượng kháng sinh này sẽ tích tụ trong cơ thể gây nên hiện tượng vi khuẩn thích ứng với kháng sinh

Các loại kháng sinh này thường không bị phân hủy và tồn lưu trong môi trường nuôi trồng thủy sản trong thời gian dài, khiến các loại vi khuẩn thích nghi với môi trường có kháng sinh Kết quả là các loại vi khuẩn gây bệnh trong thủy sản lại có khả năng kháng thuốc kháng sinh Nếu kháng sinh được trộn lẫn vào thức ăn nuôi thủy sản, có thể tìm thấy dư lượng kháng sinh trong thịt thủy sản và các sản phẩm chế biến Những người ăn thủy sản chứa dư lượng kháng sinh sẽ vô tình hấp thụ kháng sinh vào cơ thể, dẫn đến những thay đổi trong môi trường vi khuẩn bình thường, khiến họ trở nên dễ bị nhiễm khuẩn hơn

Đặc biệt việc lạm dụng chất kháng sinh sẽ gây lờn thuốc, dẫn đến sự phát triển của các loại vi khuẩn có khả năng kháng thuốc trong cơ thể động vật cũng như trong thủy sản

Khoa chăn nuôi Thú y, trường Đại học Nông Lâm TP HCM mới đây đã tiến hành khảo sát tình hình sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi và dư lượng kháng sinh trong thịt ở các quầy kinh doanh gia súc, gia cầm Đa số người chăn nuôi sử dụng kháng sinh không hợp lý như liều lượng cao, sử dụng liên tục để phòng ngừa bệnh cho gia súc đến khi nào bán được Xét nghiệm các mẫu thịt được lấy trực tiếp tại các chợ cho thấy có 26 loại kháng sinh được phát hiện Trong đó loại được sử dụng nhiều nhất là chloramphenicol (chiếm 15,35%), tylosin (15%), colistin (13,24%),

viii

 

norfloxacin (10%), gentamycin (8,35%), nhóm tetracycline (7,95%) Trong đó,

chloramphenicol là kháng sinh hiện đã bị cấm sử dụng trên nhiều quốc gia

Trong 149 mẫu thịt gà được kiểm tra, phân tích có đến 44,96% số mẫu có dư

kháng sinh vượt quá mức quy định cho phép từ 2,5 đến 1100 lần so với tiêu chuẩn

ngành Trong đó loại kháng sinh chloramphenicol chiếm tỷ lệ cao nhất 87,5%,

flumequin chiếm 83,33%, chlortetracycline chiếm 62,5%, amoxillin chiếm 60%

Do đó cần phải biết được phương pháp xác định dư lượng kháng sinh trong thực

phẩm để hạn chế được những nguy hại từ những thực phẩm chứa dư lượng thuốc

kháng sinh quá tiêu chuẩn cho phép

 Hàm lượng kháng sinh tối đa cho phép trong thức ăn hỗn hợp hoàn chỉnh cho

lợn theo quy chuẩn kỹ thuật quốc gia được trình bày trong bảng 2.1

Bảng 2.1 Hàm lượng kháng sinh, hóa dược tối đa cho phép trong thức ăn hỗn hợp

Thời gian ngừng sử dụng thức ăn

có kháng sinh, hóa dược trước khi giết mổ (ngày)

0

50 (cho lợn <4 tháng tuổi)

20 (cho lợn <6 tháng tuổi)

ix

 

Thông tư của Bộ Nông Nghiệp và Phát triển Nông Thôn số 81/2009/TT-BNNPTNT

 Hàm lượng kháng sinh tối đa cho phép trong thức ăn hỗn hợp hoàn chỉnh cho

gà thịt theo quy chuẩn kỹ thuật quốc gia được trình bày trong bảng 2.2

Bảng 2.2 Hàm lượng kháng sinh, hóa dược tối đa cho phép trong thức ăn hỗn hợp

hoàn chỉnh cho gà

Số thứ

tự

Tên kháng sinh,hóa dược

Hàm lượng tối

đa cho phép (µg/g) Thời gian ngừng sử dụng thức ăn có kháng sinh,hóa dược trước khi giết

x

 

Năm 1952, Archer John Porter Martin và Richard Laurence Millington Synge

đã đoạt giải Nobel hóa học về sắc ký phân tách

Kĩ thuật sắc ký phát triển nhanh chóng trong suốt thế kỉ 20 Các nhà nghiên cứu nhận thấy nguyên tắc nền tảng của sắc ký Tsvet có thể được áp dụng cho nhiều cách khác nhau, từ đó xuất hiện nhiều loại sắc ký khác nhau Đồng thời kĩ thuật sắc ký ngày càng được phát triển cao hơn cho đến ngày nay

2.2.2 Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký

Sắc ký (Chromatography) là phương pháp phân tách, phân ly, phân tích các hợp chất dựa vào sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha động và pha tĩnh

Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với tính chất của chúng (tính bị hấp thu, tính tan, …) Trong các

hệ thống sắc ký chỉ có các phân tử pha động mới chuyển động dọc theo hệ thống sắc

ký Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh Trong quá trình chuyển động dọc theo hệ thống sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ, phản hấp phụ Hệ quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất tương tác yếu hơn pha này Nhờ đặc điểm này mà người ta cố thể tách các chất qua quá trình sắc ký

Hầu hết các phương pháp sắc ký đều được dựa theo nguyên lý trên, và hiệu quả của từng phương pháp phụ thuộc vào sự lựa chọn giữa pha động và pha tĩnh

Tùy theo tính chất phân cực của cột ghi sắc ký và dung môi, người ta phân ra hai loại HPLC :

- HPLC pha thường (normal phase HPLC): cột hấp phụ chứa các hạt silic dioxit (silica – một hợp chất phân cực) rất nhỏ, dung môi là chất không phân cực, ví

xi

 

dụ hexan Thông thường cột hấp phụ có đường kính trong 4,6 mm, chiều dài

150 – 250 mm Các hợp chất không phân cực sẽ di chuyển qua ống nhanh hơn các hợp chất phân cực Tuy nhiên phương pháp này ít khi được sử dụng

- HPLC đảo pha (reversed phase HPLC): kích thước cột như phương pháp pha thường nhưng các hạt silica được biến trở thành không phân cực bằng cách gắn các chuỗi hydrocacbon lên các hạt này Thông thường, mỗi hạt gắn khoảng 8-18 nguyên tử Cacbon Dung dịch là chất phân cực, ví dụ hỗn hợp nước + rượu Các hợp chất không phân cực trong hỗn hợp có xu hướng gắn kết với các nhóm hydrocacbon nhờ lực Van de Waals Các hợp chất không phân cực cũng khó hòa tan hơn trong dung môi phân cực Do đó, các hợp chất không phân cực sẽ di chuyển qua ống chậm hơn các hợp chất phân cực Phương pháp này thường được sử dụng phổ biến hơn phương pháp pha thường

2.3 Giới thiệu về hệ thống LC-MS/MS API 4000 được dùng trong nghiên cứu

Hình 2.1 Hệ thống LC-MS/MS API 4000 của hãng Water (thuộc phòng Sắc

ký-Quang phổ, Trung tâm 3)

Hệ thống này gồm 2 phần: LC của Agilent 1200 và khối phổ MS/MS API 4000 của hãng API

2.3.1 LC Agilent 1200

LC Agilent 1200 gồm các bộ phận và đặc tính kỹ thuật sau:

Khay chứa dung dịch pha động: dùng để các bình chứa dung môi pha động Có

4 bình chứa phân biệt là A1, B1 và A2, B2

xii

 

Bộ khử khí: Bộ phận này có tác dụng loại khí hòa tan còn lẫn trong pha động nhằm giúp cho quá trình tách sắc ký trở nên tốt hơn, thời gian lưu ổn định hơn và

“peak” thu được trở nên đối xứng hơn

Bơm (pump): Là hệ Binary Pump, có tác dụng đưa thành phần pha động và chất phân tích vào cột sắc ký để tiến hành tách các chất cần thiết và đưa vào khối phổ Tốc

độ cho phép từ 50-5000 µL/ phút và áp suất tối đa là 6000 psi

Binary Pump: còn được gọi là bơm đôi, là hệ thống gồm 2 bơm giống nhau và

có đường dây dẫn dung môi vừa ra khỏi bơm được nối vào cùng một nơi để trộn dung môi từ 2 bơm này với nhau Binary pump cho phép một chương trình gradient được trộn ở áp suất cao nên tốc độ dòng đòi hỏi thấp, thường dùng với cột có đường kính nhỏ từ 1 đến 2 mm Pump này được thiết kế có một van dung môi cho phép người dùng chọn hỗn hợp 2 dung môi từ khay chứa 4 chai dung môi

Bộ phận tiêm mẫu tự động (autosampler): Có tác dụng tiêm chất phân tích từ các vial chứa vào cột sắc ký Autosampler của LC Agilent 1200 có khay chứa 100 vial

Buồng ổn nhiệt cột: Có tác dụng giữ nhiệt độ nhất định để cho thời gian lưu của chất cần phân tích ổn định Nhiệt độ buồng cột từ 20-60 0C

Pilot: Bộ phận điều khiển tay có tác dụng điều khiển LC mà không cần thông qua phần mềm, có thể coi sắc ký đồ trực tiếp trên đó

2.3.2 Khối phổ API 4000

 Nguồn tạo ion (ion source) dùng nguồn Turbo V để tạo ion

Hình 2.2 Nguồn ion Turbo V

 Bộ phận tách khối (mass analyzer)

Hình 2.3 Sơ đồ bộ phân tích khối của khối phổ API 4000

Gồm 2 vùng chính là vùng chuyển tiếp và vùng phân tích

Vùng chuyển tiếp gồm 4 phần chính:

Curtain plate: Là 1 đĩa hình nón bằng thép không rỉ, có 1 lỗ tròn đường kính 2

mm ở trung tâm được áp một điện tích nhất định Khi dòng ion đi vào “curtain plate” thì gặp một dòng “curtain gas” (khí N2) thổi ngược lại để loại bỏ hoàn toàn dung môi, không cho hơi dung môi chưa được bốc hơi hết vào “orifice plate”

Orifice plate: Ion sau khi qua “curtain plate” tiếp tục vào “orifice plate”, có đường kính rất nhỏ 0.317 mm để hạn chế ion không cần thiết vào MS và được áp một thế nhất định tùy thuộc vào cấu trúc của chất phân tích nên khi chỉ có những chất cần phân tích mới qua được “orifice plate” “Orifice plate” là vách ngăn giữa vùng áp

xiv

 

suất khí quyển và vùng chân không thấp khoảng 1 torr Vùng chân không này được tạo ra do một “roughing pump” “Orifice plate” được làm bằng gốm (ceramic) nên rất

dễ vỡ do đó khi vệ sinh nguồn phải hết sức cẩn thận

Skimmer cone được thiết kế hình nón để hướng ion vào Q0

Q0: được thiết kế là một tứ cực, có chân không khoảng 8.10-3 torr do một turbo pump được thiết kế bên cạnh Q0 Q0 có tác dụng như một bộ lọc ion đầu tiên có tác dụng loại bỏ các tạp chất, hạn chế bẩn MS

 Vùng tách khối

Gồm 3 thành phần chính là Q1, Q2, Q3 là 3 tứ cực được thiết kế bằng 4 thanh kim loại làm bẳng thép không rỉ, được đặt song song từng cặp với nhau Khi hoạt động, một tứ cực được áp dòng điện 1 chiều (DC) và dòng điện xoay chiều (AC) lên hai cặp đối nhau của 4 thanh kim loại Bằng cách lựa chọn tỉ lệ AC/DC thích hợp trên mỗi cặp thanh kim loại, các ion có khối lượng được chọn trước đi qua 4 thanh kim loại này và tiếp tục đi xa hơn (đến detector), trong khi đó các ion khác do có quỹ đạo không phù hợp, bị loại bỏ khỏi tứ cực và bị hút ra ngoài

xv

 

Q1: Được áp một thế nhất định phụ thuộc vào ion mẹ Q1 có tác dụng như một

bộ lọc ion, chỉ có những ion có m/z giống với m/z của ion phân tích (không phân giải được) mới qua được Q1, còn những ion tạp bị loại bỏ khi bay qua tứ cực thứ nhất Q2: Có chân không sâu khoảng 8.10-3 torr, được tạo ra bởi một turbo pump thứ hai tạo được chân không từ ST2 đến ST3 là 10-5 torr Q2 là một buồng va chạm (collision cell) làm bằng ceramic, được áp một thế thích hợp để cung cấp năng lượng cho khí N2 bắn phá ion mẹ để hình thành các ion con (có m/z nhỏ hơn)

Q3 được thiết kế giống như Q1, cũng có tác dụng lọc ion Q3 được áp một thế nhất định chỉ cho phép các mảnh ion con nhất định được tạo thành từ Q2 đi qua Q3 vào detector

 Bộ phân ghi tín hiệu

Hình 2.5 Hình bộ ghi tín hiệu của khối phổ API 4000

Deflector được áp một thế để chuyển hướng các ion sau khi qua Q3 vào bộ khuếch đại tín hiệu CEM CEM được cấu tạo gồm rất nhiều dynode Khi hoạt động, ion đập vào dynode đầu tiên làm sinh ra các electron sơ cấp, các electron này được tăng tốc đến các dynode kế tiếp sẽ sinh ra các electron thứ cấp với số lượng tăng theo cấp số nhân so với số electron sơ cấp Quá trình này lặp lại qua mỗi dynode, cuối

xvi

 

cùng tạo thành một xung các electron và được khuếch đại và ghi nhận bởi bộ đếm và chuyển thành chuyển thành tín hiệu điện

 Các kiểu chọn lọc ion trong MS

Trong phần này chúng tôi trình bày các chế độ MS trong thiết bị API 4000 MRM (Multiple Reaction Monitoring): là chế độ dùng để định lượng phổ biến nhất trong kỹ thuật MSMS của API Nguyên tắc của chế độ MRM là ion mẹ (ion phân tử) được chọn qua tứ cực thứ nhất Sau đó ion này tiến vào Q2, nơi này sẽ xảy

ra sự bắn phá để phân mảnh ion mẹ thành các mảnh ion con Những mảnh ion con đặc trưng (có độ nhạy và độ ổn định cao) được chọn để cho qua Q3 và tiến vào detector Ở chế độ MRM này thiết bị sẽ lấy tín hiệu 1 cặp ion gồm 1 mảnh mẹ và 1 mảnh con Do đó chỉ có hợp chất nào vừa thỏa mãn điều kiện ion mẹ và ion con (có cùng công thức phân tử và công thức cấu tạo) mới nhận thấy trong chế độ này, nên chế độ này rất nhạy và chọn lọc cho những hợp chất được phân tích.Chế độ MRM của API tương đương với chế độ SRM (Selected Reaction Monitoring) của hãng

Thermo Finigan

Q1 MS: Là chế độ Full scan Chế độ này được cài đặt ở Q1 để tìm mảnh ion phân tử Nguyên tắc của Q1 MS là quét một khoảng khối phổ nhất định có m/z từ thấp tới cao Chế độ này cho phép chúng ta biết thông tin về phân tử lượng của chất

cần phân tích

Q3 MS: Là chế độ full scan, giống hoàn toàn Q1 MS nhưng được cài đặt ở Q3

Q1 Multiple Ion: Là chế độ chọn một mảnh ion mẹ nhất định, mảnh ion này được chọn để đi qua Q1 Chế độ này tương ứng với chế độ SIM (Selected Ion

Monitoring) trong thiết bị Thermo Finigan và Shimadzu

Q3 Multiple Ion: Tương tự như Q1 Multiple Ion nhưng được cài đặt ở Q3

Product Ion (MS 2): Là chế độ đặc trưng chỉ có ở kỹ thuật MS/MS Nguyên tắc của chế độ này là bắn phá những mảnh ion mẹ, để phân mảnh ion mẹ thành các ion

con Chế độ này giúp chúng ta biết được thông tin về cấu trúc hợp chất cần phân tích

xvii

 

3.1 Thời gian, địa điểm thực hiện đề tài

Thời gian thực hiện đề tài từ 15/02/2012 đến 15/06/2012 tại phòng Sắc ký –

Quang phổ thuộc Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng 3, Biên Hòa, Đồng Nai

3.2 Vật liệu nghiên cứu

Mẫu thức ăn chăn nuôi do Trung tâm 3 cung cấp

Thiết bị: Hệ thống sắc ký lỏng ghép khối phổ LC-MS/MS API 4000 của Applied Bio Systems gồm hệ thống sắc ký lỏng LC 1200 của Agilent, hệ thống bơm

2 dòng và tiêm mẫu tự động, cột bảo vệ pha đảo C18 (150*3 mm, 2.1µm)

Cột sắc ký lỏng pha đảo C18 Eclipse XDB C18: (150 x 2.1 mm; 5 µm), đầu dò khối phổ ba tứ cực API 4000 với hai loại nguồn ion hóa ESI và APCI;

Phần mềm điều khiển thiết bị và xử lý dữ liệu sắc ký Analyst 1.5

 Dụng cụ

Cân phân tích có độ chính xác 0.1mg Máy đồng nhất mẫu Turrax

Máy lắc (vortex) Giấy lọc xanh

Ống ly tâm nhựa dung tích 50ml Pipet thủy tinh

 Hóa chất

Chỉ sử dụng hóa chất được công nhận đạt chuẩn chất lượng tinh khiết phân tích

và nước cất cấp hạng 1 theo TCVN 4851 (ISO 3639) Các dung môi phải đạt chất lượng (độ tinh khiết >=99) dùng cho phân tích LC-MS

Bảng 3.1 Các chất chuẩn dùng trong việc xác định hàm lượng kháng sinh

xix

 

Chất chuẩn gốc (1000 mg/L): Cân từng chất chuẩn (trừ Lasalocid A và Virginiamycin) 10 mg vào bình định mức 10 mL, hòa tan và định mức bằng dung môi methanol Bảo quản ở 4 0C, sử dụng trong 12 tháng

Chuẩn gốc Virginiamycin (100 mg/L): Cân 1 mg bằng cân phân tích (có độ chính xác 0,01 mg) vào bình định mức 10 mL, hòa tan và định mức bằng dung môi methanol Bảo quản ở 4 0C, sử dụng trong 12 tháng

Chuẩn trung gian (10 mg/L): Rút lần lượt 100 µL dung dịch chuẩn (1000 mg/L trừ Lasalocid A và Virginiamycin), 1 mL dung dịch chuẩn gốc Lasalocid A (100 mg/L), rút 1 mL chuẩn gốc Virginiamycin (100 mg/L) vào bình định mức 10 mL, hòa tan và định mức bằng dung môi methanol Bảo quản ở 4 0C, sử dụng trong 3 tháng

Chuẩn hỗn hợp trung gian 1 (10 mg/L): Chuẩn hỗn hợp các chất kháng sinh được định mức trong ACN, bảo quản ở 4 0C, sử dụng trong 3 tháng Cách pha dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian được trình bày theo bảng 3.2

Bảng 3.2 Cách pha dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian

Hợp Chất

Nồng độ chuẩn (mg/L)

Thể tích rút (µL)

Thể tích định mức (mL)

Nồng độ chuẩn trung gian 1 (mg/L)

xx

 

Dung dịch chuẩn trung gian hỗn hợp 2 (2 mg/L): Rút chính xác 1 mL dung dịch chuẩn trung gian hỗn hợp 1 (10 mg/L) vào bình định mức 5 mL, định mức tới vạch bằng ACN, bảo quản ở 4 0C, dung dịch bền trong 1 tháng

Dung dịch chuẩn làm việc 20, 50, 100, 200, 400 (µg/L) được pha theo bảng 3.3

Bảng 3.3 Cách pha dung dịch chuẩn làm việc

Thể tích định mức (mL)

Nồng

độ chuẩn làm việc (µg/L)

Dịch chiết từ mẫu trắng (được pha loãng trong dung dịch HCOOH)

Khảo sát khoảng tuyến tính và dựng đường chuẩn 5 điểm của 18

loại kháng sinh ở các nồng độ khác nhau

Xác định hàm lượng 18 loại kháng sinh trên mẫu thử bằng phương

pháp LC-MS/MS

Xác định hiệu suất thu hồi của quy trình phân tích

Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp

xxi

 

Hình 3.1 Sơ đồ tóm tắt các bước thực nghiệm

3.4.1 Phương pháp phân tích kháng sinh

Dựa trên cơ sở tham khảo các công trình nghiên cứu đã được công bố và một số kinh nghiệm thực tế trong quá trình xử lý mẫu, đề tài thực hiện chiết tách kháng sinh trong mẫu thức ăn chăn nuôi bằng dung dịch đệm ly trích MacIIvaine pH 4,6

Chuẩn bị mẫu: Quá trình này đóng vai trò rất quan trọng, ảnh hưởng đến kết quả phân tích Trước khi phân tích kháng sinh cần chuẩn bị các mẫu phân tích và dung dịch chuẩn để dựng đường chuẩn

Dựa vào các điều kiện phân tích, chúng tôi chia 18 loại kháng sinh thành 2 nhóm:

Nhóm 1 (Arsanilic, Clopidol, Lasalocid, Monensin, Narasin, Nitarsone, Roxarsone, Salinomycin, Virginiamycin): lấy khoảng 2g mẫu thức ăn chăn nuôi, thêm 15 mL dung dịch ly trích lắc đều và siêu âm trong vòng 15 phút Tiếp đó ly tâm

5000 vòng/phút trong vòng 10 phút, lọc mẫu qua giấy lọc băng xanh Chuyển dịch mẫu qua ống nhựa 50 mL mới , để mẫu trong tủ đông trong 60 phút ở -180C Sau đó lấy ra ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút, lọc mẫu qua giấy lọc băng xanh Hút chính xác 1 mL dịch mẫu vào bình định mức 10 mL, định mức tới vạch bằng ACN Sau đó lọc mẫu qua giấy lọc 0,45 µm trước khi tiêm vào hệ thống LC-MS/MS

Nhóm 2 (Amprolium, Bacitracin, Chlotetracyline, Decoquinate, Licomycin, Oxytetracyline, Sulfadimethoxin, Tetracycline, Tylosin): lấy khoảng 2g mẫu thức ăn chăn nuôi, thêm 15 mL dung dịch ly trích lắc đều và siêu âm trong vòng 15 phút Tiếp đó ly tâm 5000 vòng/phút trong vòng 10 phút, lọc mẫu qua giấy lọc băng xanh Chuyển dịch mẫu qua ống nhựa 50 mL mới , để mẫu trong tủ đông trong 60 phút ở -

Khảo sát trên một số mẫu thật

xxii

 

180C Sau đó lấy ra ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút, lọc mẫu qua giấy lọc băng xanh Sau đó hút chính xác 1 mL dịch mẫu vào bình định mức 10 mL, định mức tới vạch bằng dung dịch HCOOH 0,1% Sau đó lọc qua giấy lọc 0,45 µm trước khi tiêm vào hệ thống LC-MS/MS

Quy trình xử lý mẫu thức ăn được tóm tắt trong hình 3.2

Cân khoảng 2g mẫu thức ăn vào ống nhựa dung tích 50 mL

Nhóm 2: Hút chính xác

1 mL dịch mẫu vào bình định mức 10 mL, định mức tới vạch bằng dung dịch HCOOH 0,1%

Lọc mẫu qua giấy lọc băng xanh

Lọc mẫu qua giấy lọc băng xanh

Ly tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút

Chuyển qua ống nhựa 50 mL, để mẫu trong tủ đông trong 60 phút ở -18oC

Thêm vào 15 mL dung dịch ly trích, lắc đều, siêu âm trong 15 phút

Nhóm 1: Hút chính xác

1 mL dịch mẫu vào bình định

mức 10 mL, định mức tới vạch

bằng ACN

xxiii

 

Hình 3.2 Quy trình xử lý mẫu thức ăn chăn nuôi

3.4.2 Tối ưu hóa các thông số kỹ thuật của hệ thống LC-MS/MS

Dựa vào độ phân cực, khả năng ion hóa, độ phân hủy nhiệt, khả năng chiết tách, rửa giải…khác nhau của các hợp chất cần phân tích mà chúng tôi chọn phương pháp phân tích thích hợp có độ chính xác và độ tin cậy phù hợp để nhận danh đúng và định lượng tốt chất phân tích trong nền mẫu (đặc biệt đối với những nền mẫu phức tạp có khả năng gây nhiễu lớn)

Phương pháp LC-MS/MS đáp ứng được các yêu cầu trên có thể cho hiệu suất thu hồi tốt từ 91-105% Do đó, việc khảo sát và tối ưu hóa các thông số trên hệ thống LC-MS/MS có ý nghĩa quan trọng, ảnh hưởng đến kết quả phân tích

3.4.2.1 Điều kiện phân tích các loại kháng sinh thuộc nhóm 1

 Điều kiện LC

Máy sắc ký lỏng LC/MS 01 - API 4000

Cột sắc ký: Cột silica có kích thước 250 mm x 4,6 mm, kích thước hạt 5µm Thể tích tiêm mẫu: 50 μL

Pha động A: Nước chứa 0,1 % dung dịch HCOOH

Pha động B: Acetonitril chứa 0,1 % dung dịch HCOOH