Nghiên cứu xác định hàm lượng vitamin c trong một số loại rau bằng phương pháp von ampe

Theo nghiên cứu Vit.C là một hợp chất có tính khử, có thể phân tích bằng các phương pháp điện hóa đặc biệt là phương pháp von-ampe.. Vì vậy tôi chọn đề tài nghiên cứu: NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊN

Vit.C còn được sử dụng trong các ngành công nghiệp thực phẩm với vai trò là chất chống oxi hóa Nó giúp cho các sản phẩm giữ được sự tươi ngon trong quá trình bảo quản Nhiều loại hàng hóa trên thị trường như nước giải khát, nước ép trái cây đóng hộp, bột dinh dưỡng cho trẻ em chứa Vit.C nhằm duy trì chất lượng cũng như là một tiêu chí quảng cáo sản phẩm

Các loại rau xanh và hoa quả là những nguồn cung cấp Vit.C tự nhiên, rất tốt cho sức khỏe Ngoài ra Vit.C cũng được tổng hợp theo con đường nhân tạo, đáp ứng nhu cầu cao về vitamin của cơ thể người cũng như của các ngành công nghiệp có liên quan

Tuy nhiên Vit.C là một chất rất dễ bị phân hủy trong điều kiện nhiệt độ

và ánh sáng bình thường Do đó việc xác định nó trong các đối tượng trên một cách chính xác, nhanh chóng là một yêu cầu hàng đầu được đặt ra Ở Việt Nam, phương pháp xác định Vit.C trong các phòng thí nghiệm chủ yếu vẫn là phương pháp chuẩn độ thể tích, có độ chính xác và độ nhạy không cao Theo nghiên cứu Vit.C là một hợp chất có tính khử, có thể phân tích bằng các phương pháp điện hóa đặc biệt là phương pháp von-ampe Đây là một trong những phương pháp phân tích hợp chất hữu cơ nhanh và đạt được độ chính

xác cao, hơn thế nữa chi phí cho máy móc và hóa chất rất phù hợp với điều kiện của các phòng thí nghiệm ở Việt Nam Vì vậy tôi chọn đề tài nghiên cứu:

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN C TRONG MỘT

SỐ LOẠI RAU BẰNG PHƯƠNG PHÁP VON-AMPE

Nhiệm vụ chính đặt ra:

- Nghiên cứu quy trình xác định Vit.C bằng phương pháp von-ampe một cách nhanh chóng, độ chính xác cao, chi phí thấp, dễ thực thi trong các phòng thí nghiệm ở Việt Nam

- Đánh giá độ tin cậy của quy trình phân tích

- Ứng dụng xác định Vit.C trong đối tượng trên thị trường: một số loại rau

NỘI DUNG

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ VIT.C

H

1

2 3

4

5

6 CH2OH OH

ascobic, axit izo D-ascobic Trong các đồng phân này chỉ có axit L-ascobic và

izo L-ascobic là có tác dụng chữa bệnh, còn các đồng phân D và izo D là các

antivitamin, tức là chất ức chế tác dụng của vitamin Trong thiên nhiên chỉ tồn

tại dạng axit L-ascobic, còn các đồng phân khác chỉ thu được bằng con đường

tổng hợp

Axit ascobic rắn là những tinh thể đơn tà, không màu, không mùi, có vị

chua, nóng chảy ở 1930

C Axit ascobic dễ tan trong nước, ít tan hơn trong rượu và không tan trong các dung môi hữu cơ không phân cực

Axit ascobic rất dễ bị phân hủy dưới tác dụng của ánh sáng, nhiệt độ vì

vậy cần bảo quản axit ascobic trong bóng tối và nhiệt độ thấp

H

CH2OH OH

O

O

O O

CH2OH OH

Thế khử của nó phụ thuộc nhiều vào PH của môi trường

Axit ascobic ở dạng khan khá bền vững, nhưng do trong phân tử có 2

nhóm OH đính vào C chưa no (C2, C3) nên khi bị ẩm ướt hoặc ở trong dung

dịch nó rất dễ bị oxi hóa, ngay cả bởi oxi không khí, nhất là khi có mặt các

ion kim loại đồng, sắt, magie theo phản ứng sau:

O

O

OH O

CH2OH OH

 + 2H+ + 2e– Axit L-ascobic Axit L-đehiđroascobic

+ 1/2 O2

Sản phẩm tạo ra là axit L- đehiđroascobic, chất này cũng có hoạt tính sinh học tương tự như axit L-ascobic, nhưng không bền, nó dễ bị thủy phân phá vòng tạo axit 2,3-đixetogulonic CH2OH–(CHOH)2–CO–CO–COOH, là chất không có tác dụng sinh lý

Tốc độ oxi hóa axit ascobic thành axit L-đehiđroascobic càng lớn khi

PH càng tăng Các chất saccarozơ, carotenoit, flavonoit có khả năng làm chậm quá trình oxi hóa của axit ascobic nên được dùng làm chất ổn định hóa Vit.C

Cơ chế sự phân hủy của axit ascobic bởi chất oxi hóa có thể được biểu diễn theo sơ đồ sau:

CH2OH OH -2e, -2H+

+2e, +2H+

H2O

COOH C C

CH2OH

O O OH O H

H2O

COOH COOH CHO

CH2OH

OH O H

[O] CHO

CH2OH

O H

CH2OH

O O H

[O]

CH2OH C

CH2OH

COOH C

CH2OH O

Ngoài sự phân hủy theo kiểu oxi hóa, axit ascobic còn có xu hướng phân hủy theo kiểu thủy phân trong môi trường kiềm hoặc axit mạnh thành fufurol và các sản phẩm khác qua phản ứng decacboxyl hóa và dehydrat hóa

Tương tự như vậy, axit ascobic dễ dàng cho hiđro cho các peoxit, vì vậy ngăn không cho các peoxit oxi hóa các hợp chất khác Do đó người ta sử dụng axit ascobic làm chất chống oxi hóa trong công nghiệp chế biến

Axit L-ascobic Axit L-đehiđroascobic Axit 2,3-đixetogulonic

b, Tính axit

Trong dung dịch nước axit ascobic là một axit yếu ở nấc 1, pKa,1 = 4,2

tưong ứng với quá trình phân ly H+

của nhóm OH đính vào C3 (*), và rất yếu

ở nấc 2, pKa,2 = 11,6 tương ứng với sự phân ly H+ của nhóm OH đính vào C2

(*)

Axit ascobic dễ dàng phản ứng với dung dịch bazơ mạnh như NaOH,

KOH, Ca(OH)2 tạo muối

O

O

OH O

CH2OH OH

Các muối này dễ tan trong nước hơn axit ascobic nên trong công

nghiệp họ sử dụng dạng muối của axit ascobic làm chất bảo quản các dung

H

CH2OH

OH

Tuy nhiên khi axit hóa và đun nhẹ thì vòng lacton lại lập lại

c, Tác dụng với axit hữu cơ tạo este

Trong CTCT của axit ascobic có nhiều nhóm OH như nhóm chức rượu,

có khả năng tạo este với các axit hữu cơ, đặc biệt là các axit béo như axit

panmitic, axit stearic Sản phẩm este dạng 6-O-axyl L-ascobic (ascobyl panmitat, ascobyl stearat) có mạch cacbon dài, dễ tan trong dầu Những este này được tổng hợp dùng làm chất bảo quản chất béo trong công nghiệp chế biến Một số dẫn xuất khác của axit ascobic cũng được sử dụng là:

CH2OH OH

O

O

OH O

H

CH2OH OH

O

O

OH ROCO

CH2OH OH

6-O-ankanoyl ascobat 2-O-ankanoyl ascobat 3-O-ankanoyl ascobat

Trong đó, R là các gốc hiđrocacbon mạch dài, có thể no hoặc không no, giúp cho các dẫn xuất của axit ascobic dễ tan trong dầu béo hơn

1.1.3 Tính chất sinh lý

Vit.C có tác dụng tăng cường sức đề kháng cho cơ thể, chống lại các hiện tượng choáng hoặc ngộ độc hóa chất, độc tính của vi trùng do tính chất khử mạnh của Vit.C

Vit.C tham gia vào quá trình oxi hóa khử khác nhau của cơ thể như: chuyển hóa hợp chất thơm thành phenol; quá trình hydroxyl hóa triptophan thành colagen, nhờ có quá trình hydroxyl hóa prolin thành oxyprolin cần thiết cho việc tổng hợp colagen, vì vậy Vit.C làm cho vết thương mau lành

Vit.C có vị trí quan trọng trong quá trình hình thành các hoormon của tuyến giáp trạng và tuyến trên thận

Khi cơ thể thiếu Vit.C sẽ xuất hiện các triệu chứng bệnh lý như chảy máu ở lợi, răng, lỗ chân lông hoặc các cơ quan nội tạng Đó là do thành các mạch máu bị mỏng

Cơ thể bình thường có nhu cầu Vit.C trong 24 giờ là 60–80 mg

1.1.4 Các nguồn cung cấp Vit.C

Trong tự nhiên, thực vật tổng hợp được Vit.C, do đó Vit.C có nhiều trong rau xanh đặc biệt là ớt và các loại rau cải, rau ngót , trong các loại quả như cam, chanh, bưởi, ổi, khế, táo, dưa hấu Không thấy xuất hiện Vit.C trong các sản phẩm từ động vật như thịt, trứng, sữa

Một số cơ thể sống có khả năng tổng hợp Vit.C từ D-glucozơ nhờ tác dụng của enzim theo sơ đồ sau:

CH2OH OH

Axit L - ascobic

Ngoài ra con người tổng hợp Vit.C nhằm các mục đích khác nhau Các chế phẩm dược chỉ chứa Vit.C, hay các viên Vitamin tổng hợp trong đó có Vit.C dùng mục đích chữa bệnh, tăng cường sức đề kháng cho người ốm Các loại nước hoa quả giải khát, bột dinh dưỡng trẻ em, sữa chứa một lượng nhỏ Vit.C, là một tiêu chí quảng cáo cho sản phẩm Một lượng lớn Vit.C làm chất bảo quản thực phẩm

Trong công nghiệp dược phẩm, Vit.C được tổng hợp qua các giai đoạn sau:

H OH O

H2/Ni oxi hoa

Acetobacter xylinum

CH2OH C

CH2OH

O O

H3C C

H3O

[O]

H H

H3C C

H3O

OC C

CH2OH

O O

1.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH VIT.C

Có thể chia các phương pháp xác định Vit.C thành 2 nhóm lớn:

- Nhóm các phương pháp phân tích hóa học

- Nhóm các phương pháp phân tích công cụ

1.2.1 Phương pháp phân tích hóa học

Trong các phương pháp phân tích hoá học, phương pháp chuẩn độ oxi hóa khử được sử dụng nhiều nhất, dựa vào tính chất dễ bị oxi hóa thành axit đehiđroascobic của axit ascobic Để oxi hóa người ta sử dụng các thuốc thử khác nhau như: 2,6-điclophenolindophenol, brom, iot, thuốc thử Feling

2,6-điclophenolindophenol được coi như là thuốc thử chuẩn dùng để chuẩn độ xác định Vit.C một cách trực tiếp Nó là một chất oxi hóa có màu xanh đậm, có công thức phân tử là C12H6Cl2NO2,maxtrong dung dịch nước =

602 nm Khi phản ứng với axit ascobic nó bị khử thành một hợp chất không màu

C6H8O6 - 2H+ - 2e- C6H6O6

C12H7Cl2NO2 + 2H+ + 2e- C12H9Cl2NO2

Người ta có thể theo dõi quá trình chuẩn độ bằng mắt, đo quang hay đo điện thế

Việc chuẩn độ axit ascobic thông thường được tiến hành bằng cách nhỏ

từ từ dung dịch thuốc thử từ buret vào dung dịch nghiên cứu chứa axit ascobic trong môi trường có PH thích hợp Điểm cuối chuẩn độ được nhận ra khi có

sự xuất hiện màu của giọt thuốc thử dư đầu tiên Phương pháp này có thể được áp dụng trực tiếp để xác định Vit.C trong dược phẩm Tuy nhiên trong các đối tượng khác như rau quả, lương thực, thực phẩm thường chứa các chất khử khác nữa và dung dịch nghiên cứu thường có màu và đục, gây khó khăn cho việc xác định điểm cuối chuẩn độ

Người ta cũng có thể chuẩn độ axit ascobic bằng dung dịch iot, với chất chỉ thị hồ tinh bột để xác định Vit.C trong bắp cải, hoặc chuẩn độ gián tiếp, xác định Vit.C trong mật ong, bằng cách thêm lượng dư dung dịch KBr vào dung dịch mẫu đã được axit hóa bằng dung dịch H2SO4 1:1 Hỗn hợp này được chuẩn độ bằng dung dịch KBrO3 cho đến khi xuất hiện màu vàng của

Br2 dư

Thực chất đã xảy ra phản ứng:

5Br- + BrO3- + 6H+ 3Br2 + 3H2O

C6H8O6 + Br2 C6H6O6 + 2Br- + 2H+

Khi hết axit ascobic lượng BrO3

cho vào, sẽ sinh ra Br2 không được phản ứng tiếp Sau đó lại xác định lượng Br2 dư đó bằng phương pháp chuẩn

độ iot bằng dung dịch natri thiosunphat chuẩn

Tuy nhiên các phương pháp chuẩn độ tiến hành khá phức tạp, đồng thời

có độ chọn lọc, độ nhạy và độ chính xác không cao Vì vậy từ khi các phương pháp phân tích công cụ ra đời, người ta đã khắc phục được rất nhiều nhược điểm của các phương pháp phân tích hóa học

1.2.2 Nhóm các phương pháp phân tích công cụ

Thời gian gần đây, cùng với sự phát triển như vũ bão trong tất cả các lĩnh vực của xã hội, những yêu cầu đặt ra cho ngành phân tích là phải nhanh, chích xác, quy trình đơn giản, lượng mẫu tiêu thụ nhỏ, không những tiết kiệm tiền của, công sức mà cả thời gian cho xã hội Với sự hỗ trợ của các phương pháp phân tích công cụ và những thiết bị hiện đại, việc xác định Vit.C cũng

đã đạt được những yêu cầu đó Đặc biệt, quy trình phân tích nhanh và đa số trường hợp không phải xử lý mẫu trước đã giảm thiểu được sự mất mát Vit.C trong quá trình định lượng

Các phương pháp công cụ có thể xác định Vit.C gồm các phương pháp phân tích quang học và nhóm các phương pháp phân tích điện hóa

Trong đó hầu hết các phương pháp đều xác định Vit.C một cách gián tiếp Như đã trình bày, dung dịch Vit.C là không màu, do đó không thể cho tín hiệu đo quang ở vùng khả kiến, vì vậy người ta thường dùng một tính chất nào đó của Vit.C mà sự biến đổi nồng độ Vit.C sẽ gây ra tín hiệu quang biến đổi tương ứng, cùng tăng hoặc cùng giảm theo hàm lượng Vit.C Hay khi dùng phương pháp hấp thụ nguyên tử, do Vit.C rất dễ bị phân hủy ở nhiệt độ cao nên không thể cho tín hiệu trực tiếp trên máy AAS Người ta dùng một ion kim loại mang tính oxi hóa (ví dụ Fe III) để tác dụng với Vit.C theo tỷ lệ xác định Việc xác định hàm lượng kim loại đó trên máy AAS là dễ dàng, từ

đó có thể tính ra hàm lượng Vit.C ban đầu Nhóm các phương pháp điện hóa, trong đó xác định Vit.C bằng phương pháp cực phổ, sử dụng điện cực giọt thủy ngân, là trực tiếp dựa trên tính chất oxi hóa khử của Vit.C Ngoài điện cực giọt Hg, người ta còn dùng các điện cực biến tính, bằng cách tạo một lớp màng có hoạt tính điện hóa với Vit.C trên bề mặt điện cực rắn

Để hỗ trợ thêm cho các phương pháp phát hiện Vit.C, các kỹ thuật tách cũng được kết hợp để tăng độ chính xác, độ nhạy và độ chọn lọc của phương pháp phân tích Có thể kể đến các kỹ thuật sắc ký, gồm sắc ký khí (GC), sắc

ký lỏng cao áp (HPLC) kỹ thuật tiêm mẫu phân tích vào dòng chảy (FIA)

1.2.2.1 Các phương pháp phân tích quang học

Vit.C là chất rắn dạng tinh thể không màu, dung dịch Vit.C cũng trong suốt nhưng nó dễ bị oxi hóa và có tác dụng ức chế hay xúc tác cho các phản ứng phát quang Thông qua đó người ta có thể định lượng Vit.C

Các tác giả sử dụng các chất oxi hóa khác nhau và thông qua nó gián tiếp xác định hàm lượng Vit.C

Kali cromat được sử dụng làm chất oxi hóa axit ascobic, kali cromat còn dư sẽ phản ứng với điphenyl cacbazit (DPC) có mặt axit nitric tạo phức màu có max= 548 nm Mật độ quang A đo ở max= 548 nm sẽ tỷ lệ thuận với lượng kali cromat dư, và tỷ lệ nghịch với lượng Vit.C trong mẫu

2CrO42- + 3C6H8O6 + 10H+ Cr3+ + 3C6H6O6 + 8H2O CrO4

Trong điều kiện thí nghiệm đó, tác giả và cộng sự đã xây dựng được đường chuẩn tuyến tính đến hàm lượng Vit.C đến 5µg/mL (tương ứng 5ppm, khoảng 3.10-5 mol/L), và giới hạn phát hiện tới 0,02µg/mL (20ppm, khoảng

10-7 mol/L) Ứng dụng xác định Vit.C trong thuốc viên và thuốc nước chứa Vit.C, nước ép hoa quả, các loại rượu hoa quả cho kết quả tốt

Chen, Xu-wei và các cộng sự đã nghiên cứu quy trình xác định Vit.C bằng phương pháp tiêm mẫu vào dòng chảy kết nối với detectơ đo quang Trên cơ sở sử dụng Fe(III) làm chất oxi hóa axit ascobic, sản phẩm Fe(II) sinh

ra tạo phức màu với 2,2’-đipiridin trong môi trường axit yếu (PH=5), kết quả

đo A ở max= 523nm sẽ tỷ lệ thuận với lượng axit ascobic trong mẫu Ưu điểm của phương pháp này là khả năng tự động hóa, cho phép xác định 60 mẫu thuốc/giờ

Trong khi đó, Yebra-Biurrun và cộng sự lại sử dụng pemanganat làm chất oxi hóa axit ascobic, dùng kỹ thuật FIA và đầu ghi AAS để xác định hàm lượng Mn(VII) còn dư, Mn(II) tạo ra sẽ được giữ trên lớp nhựa poly (axit aminophotphoric) sẽ không gây ảnh hưởng đến kết quả xác định Mn(VII) dư Theo báo cáo cho biết thì giới hạn phát hiện chỉ khoảng 0,06 µg/mL (khoảng 60ppm, 3,5.10-4mol/L), tuy nhiên điều này không quan trọng lắm, vì hàm lượng Vit.C trong mẫu phân tích thường lớn Nhưng quy trình phân tích này cho phép xác định tự động 90 mẫu/h, có khả năng ứng dụng trong các phòng phân tích của các nhà máy

Việc tăng độ nhạy xác định Vit.C đạt được khi sử dụng các phản ứng quang hóa mà axit ascobic có tác dụng xúc tác cho quá trình chuyển mức năng lượng Dựa trên phản ứng quang hóa của Rodamin B và Ceri(IV) trong môi trường axit sunfuric, quy trình cho phép xác định Vit.C tới 10-13

mol/L, đường chuẩn tuyến tính trong khoảng 3,8.10-13

đến 10-10 mol/L

Vit.C có khả năng phản ứng với nhiều chất oxi hóa khác nhau, do vậy các tài liệu nghiên cứu xác định hàm lượng Vit.C bằng phương pháp phân tích quang học rất phong phú và đa dạng Tuy nhiên không tránh khỏi một phần Vit.C có thể phản ứng với oxi không khí hay các chất khử khác cũng có thể phản ứng với các chất oxi hóa đó

1.2.2.2 Các phương pháp phân tích điện hóa

1.2.2.2.1 Sơ lược về phương pháp von-ampe

• Nguyên tắc của phương pháp

Phương pháp von-ampe (phương pháp phân tích cực phổ) là phương pháp quan trọng nhất trong số các phương pháp phân tích điện hóa Phương pháp này dựa trên lý thuyết về quá trình điện cực, phụ thuộc chủ yếu vào việc đưa chất điện hoạt từ trong lòng dung dịch đến bề mặt điện cực làm việc và ghi đường von-ampe (đường biểu diễn sự phụ thuộc cường độ dòng Faraday vào giá trị thế của điện cực làm việc so với điện cực so sánh)

• Hình 1.1: Sơ đồ thiết bị phân tích von-ampe

SP: nguồn điện SW: cầu chia thế

W: điện cực làm việc R: điện cực so sánh

A: điện cực phù trợ V: vôn kế

i: điện kế

• Điện cực làm việc:

Phương pháp phân tích von-ampe sử dụng điện cực giọt Hg, hay dùng

là điện cực giọt treo (HMDE), điện cực giọt rơi (DME), và điện cực giọt tĩnh (SMDE) Điện cực là giọt Hg lỏng hình cầu có đường kính khá nhỏ ( ≤ 1mm), được rơi ra từ một mao quản có chiều dài khoảng 10-15 cm, với đường kính trong khoảng 30-50 µm, mao quản được nối với bình chứa Hg bằng một ống dẫn nhỏ polietilen

Trong điện cực giọt rơi, giọt Hg liên tục được hình thành ở đầu ống mao quản và rơi ra do lực hấp dẫn, kích thước và chu kì (hay tốc độ chảy) của giọt Hg được điều khiển bởi kích thước mao quản và chiều cao của bình chứa

Hg Tốc độ đó được quy ước tính bằng khối lượng Hg rơi ra khỏi mao quản trong một vị thời gian (theo mg/s) Thông thường người ta chọn kích thước mao quản và chiều cao bình chứa sao cho tốc độ chảy khoảng 1,5  4,0 mg/s Chu kì mỗi giọt khoảng từ 2-6s

Trong điện cực giọt treo (thường dùng trong phân tích von-ampe hòa tan và von-ampe vòng), giọt Hg có kích thước nhỏ, có thể thay đổi được tùy theo yêu cầu thực nghiệm Giọt được hình thành rất nhanh và được giữ ở đầu mao quản trong quá trình đo

Ưu điểm của điện cực giọt Hg

- Khoảng thế phân tích rộng, quá thế H2 trên điện cực giọt Hg lớn, vì vậy mở rộng khoảng thế phân tích đến -1V (so với điện cực calomen bão hòa) trong môi trường axit và đến -2V trong môi trường bazơ Tuy nhiên do có quá trình oxi hóa của Hg lỏng nên điện cực chỉ được sử dụng đến -0,3V hoặc 0,4V (so với điện cực calomen bão hòa) tùy môi trường

- Bề mặt giọt luôn được đổi mới và không bị làm bẩn bởi sản phẩm của phản ứng điện cực

- Với các điện cực hiện đại, giọt Hg được điều khiển bởi hệ thống van khí, do vậy độ lặp lại của giọt cao, tăng độ lặp, độ đúng và độ chính xác khi phân tích

- Kích thước giọt nhỏ nên lượng chất tiêu tốn khi phân tích là không đáng kể, do đó sự giảm nồng độ trong quá trình phân tích do sự oxi hóa khử trên điện cực thực tế là không xảy ra

- Với kỹ thuật quét thế, kỹ thuật ghi dòng hiện đại đã khắc phục được nhược điểm đó, đồng nghĩa với tăng độ nhạy lên rất nhiều Có thể kể đến

+ Cực phổ sóng vuông (SqW)

+ Cực phổ dòng xoay chiều hình sin (AC)

+ Cực phổ xung thường và xung vi phân (NP và DP)

+ Các phương pháp von ampe trên điện cực đĩa quay

+ Phân tích điện hóa hòa tan

Với độ nhạy đối với

+ Cực phổ cổ điển (DC) 10-4 – 10-6

M + Cực phổ sóng vuông và xung vi phân 10-6 – 10-8

M + Von ampe hòa tan anot điện cực giọt Hg treo 10-6 – 10-9

M + Von ampe hòa tan anot dùng cực màng Hg 10-8 – 10-10

M trên cực rắn đĩa

Có thể thấy các phương pháp phân tích điện hóa rất phong phú và đa dạng Phạm vi đối tượng nghiên cứu rộng, cả hợp chất vô cơ và hàng nghìn hợp chất hữu cơ các loại Trong đó Vit.C là một trong những hợp chất hữu cơ được nghiên cứu ứng dụng xác định theo nhiều cách khác nhau dưới lý thuyết của các phương pháp phân tích điện hóa

1.2.2.2.2 Ứng dụng các phương pháp phân tích điện hóa xác định Vit.C

Phương pháp phân tích điện hóa được dùng chủ yếu là phương pháp von-ampe Trong đó việc sử dụng điện cực thủy ngân đặc biệt là có sự hỗ trợ của thiết bị điện tử, kết nối với máy vi tính, tăng độ nhạy và độ chính xác của phép phân tích lên rất nhiều, đồng thời quy trình cho phép phân tích nhanh, không cần xử lý mẫu phức tạp, tránh được sự mất mát Vit.C do sự oxi hóa của không khí

Trước năm 1950, phương pháp cực phổ cổ điển đã được áp dụng xác địmh hàm lượng Vit.C trong nhiều mẫu thuốc, rau, quả Nhiều công trình nghiên cứu đã tìm được điều kiện thích hợp cho phép xác định Vit.C Tuy nhiên do giới hạn của phương pháp cực phổ cổ điển, mà việc định lượng

Vit.C vẫn bị gây cản trở bởi một số chất có thế khử gần với thế khử của axit ascobic Các hợp chất sunfuhydryl thường có mặt trong các mô thực vật là một trong số đó Vì vậy đối tượng phân tích còn hạn chế

Gần đây, các kĩ thuật quét thế, và ghi dòng được hỗ trợ bởi các thiết bị điện tử hiện đại, những máy điện hóa đa chức năng ra đời và rất phổ biến ở các phòng thí nghiệm Những nhược điểm đó được khắc phục, nhưng không nhiều công trình nghiên cứu xác định Vit.C trực tiếp trên điện cực giọt thủy ngân mà một số nghiên cứu đi theo hướng chế tạo điện cực biến tính, điện cực sinh học Chủ yếu là tạo màng sinh học, hay màng polime, các loại màng được chế tạo đều có khả năng hoạt động điện hóa với axit ascobic

Sự xuất hiện của ion Cu2+

có mặt trong các enzym trong vỏ quả dưa chuột, và các loại quả khác, cũng như các ion Cu2+

, Ni2+ được tạo ra trên bề mặt màng polime là tác nhân oxi hóa axit ascobic Tín hiệu đo được tỷ lệ thuận với hàm lượng axit ascobic trong mẫu phân tích Các chất khác có mặt trong mẫu đều không ảnh hưởng đến phép phân tích Giới hạn phát hiện theo những nghiên cứu này đạt được lớn nhất là 2,5.10-7

M

Khả năng tự động hóa tăng lên, cho phép xác định 120 mẫu/h Tuy nhiên tuổi thọ của các điện cực này ngắn, do trong quá trình phân tích, axit ascobic đã khử các ion kim loại trên bề mặt điện cực Để duy trì điện cực người ta thường cho thêm vào hỗn hợp phản ứng một chất oxi hóa để tái tạo các ion trên bề mặt, Julio Cesar đã dùng H2O2 là chất oxi hóa giúp tái tạo ion

Cu2+ từ ion Cu+, là sản phẩm của phản ứng điện cực với axit ascobic

Quay trở lại điện cực giọt Hg, ngoài nhược điểm duy nhất là tính độc của Hg thì nó vẫn là điện cực tối ưu trong phương pháp cực phổ xác định các chất hữu cơ Tuy nhiên các hãng sản xuất cũng đã khắc phục tối đa nhược điểm này, kích thước hạt nhỏ ( đường kính < 1 mm ), nếu sử dụng giọt treo thì

khối lượng Hg cho phép đo là không đáng kể, có thể thu hồi được, ví dụ một giọt Hg ở thiết bị phân tích điện hóa đa năng VA757 của Metrohm có diện tích bề mặt từ 0,15 đến 0,60 mm2

Thế của axit ascobic trên điện cực Hg, trong điều kiện nền thích hợp, (so với điện cực Calomen bão hòa) cách khá xa thế khử của các ion kim loại cũng như các vitamin và các hợp chất khác Các vitamin A, D, B1, B2, B6, B12, Bc đều có sóng cực phổ ở khoảng thế âm, từ -0,3V của Vit.B2 trong nền đệm Britton-Robinson pH=1,81 đến -2,01V của vitamin D2 trong nền H2O: dioxan 1:9, TBAOHO 1M, còn thế của Vit.C là +0,23V trong nền axetat 0,05M pH=3, NaNO3 0,01M Thêm nữa, dùng kỹ thuật xung vi phân (DDP), giúp cho việc xác định vị trí và chiều cao pic của Vit.C một cách rõ ràng và chính xác Điều này có nghĩa là có khả năng xác định trực tiếp Vit.C trên điện cực giọt Hg mà không cần xử lý mẫu để loại những chất nền ảnh hưởng đến bản chất hóa học của phương pháp Quy trình nhanh, chính xác, khả năng phân tích hàng loạt là có thể đạt được Vì vậy tôi chọn sử dụng điện cực giọt

Hg treo trong phân tích Vit.C

1.2.2.2.3 Phương pháp cực phổ xung vi phân

Phương pháp cực phổ xung vi phân là phương pháp phân tích điện hóa hiện đại, được cải tiến cả về kỹ thuật quét thế và kỹ thuật ghi dòng, khắc phục được đa số nhược điểm của phương pháp cực phổ cổ điển và phương pháp xung thường

Trong phương pháp xung vi phân, điện cực được phân cực bằng một điện áp một chiều biến thiên tuyến tính với tốc độ chậm Ghi dòng tại hai thời điểm trước khi nạp xung và trước khi ngắt xung Đường biểu diễn sự khác nhau giữa hai dòng này vào thế điện cực có dạng píc, rất dễ xác định, có độ

phân giải cao Do vậy mà phương pháp xung vi phân giảm tối đa dòng dư, một hạn chế của cực phổ cổ điện (hình 1.2)

Sự phụ thuộc dòng cực đại trong cực phổ xung vi phân vào các thông

số của quá trình đo cực phổ được tính toán lý thuyết cho hệ thức sau:

i = nFSC (D/tx)1/2 P ( 2

– 1)/[( +P)(1+P )] (1.1) Trong đó

n: số e– trao đổi trong phản ứng điện cực

W1/2 = 2RT/(nF) cosh-1[2 + cosh(nF∆E/(2RT))] (1.6)

Do vậy khi tăng biên độ xung thì theo phương trình (1.4) dòng i tăng lên, nhưng đồng thời bán chiều rộng píc cũng tăng theo (1.6), do đó giảm độ phân giải của phương pháp Trong trường hợp biên độ xung đủ nhỏ thì bán chiều rộng được tính bởi công thức (1.7)

Qua phân tích một số đặc điểm của Vit.C và nhận thấy ưu điểm của phương pháp von-ampe tôi tiến hành thực nghiệm Mục đích là tìm ra điều kiện tối ưu xác định Vit.C theo phương pháp này một cách phù hợp với điều kiện thiết bị phòng thí nghiệm của Việt Nam và ứng dụng xác định Vit.C trong các đối tượng thực tế

Hình 1.2: Sơ đồ biểu diễn sự biến thiên thế theo thời gian và dạng sóng cực phổ trong một số phương pháp

(a): Thế biến thiên trong thời gian đo cực phổ

(b): Thế biến thiên trong 1 chu kì giọt

(c): Sóng cực phổ

DC: Cực phổ cổ điển NP: Cực phổ xung thường DP: Cực phổ xung vi phân

Chương II: THỰC NGHIỆM

2.1 DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT

2.1.1 Dụng cụ:

Các dụng cụ thủy tinh, buret, pipet, bình định mức của Đức có độ chính xác cao, được ngâm rửa thường xuyên bằng hỗn hợp kali đicromat và axit sunfuric đặc 98%

2.1.2 Thiết bị, máy móc

• Máy phân tích điện hóa đa chức năng 757VA Computrace, Metrohm

- Điện cực làm việc: điện cực giọt Hg

- Điện cực so sánh: điện cực Ag/AgCl

- Điện cực phù trợ: điện cực Pt

• Máy pH meter Precisa 900, Thụy Sĩ

• Cân phân tích STARTORIUS ( độ chính xác 0,2 mg)

• Xử lý số liệu trên máy tính, dùng chương trình Excel

2.1.3 Hóa chất

• Axit ascobic ( North general pharmaceutical factory China )

• Axit axetic băng

• Natri axetat, natri clorua, NaH2PO4.2H2O, K2HPO4.3H2O

• Axit pecloric, axit oxalic, axit tactric, axit citric

Các hóa chất đều thuộc loại tinh khiết phân tích (PA)

Các dung dịch nghiên cứu đều được pha từ lượng cân chính xác hóa chất chuẩn bằng bình định mức đã được kiểm tra độ chính xác thể tích

2.2 CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

2.2.1 Nghiên cứu cơ bản

Trong bản luận văn này, tôi tập trung nghiên cứu điều kiện tối ưu xác định Vit.C trên cơ sở thiết bị, máy móc, hóa chất, môi trường phòng thí nghiệm ở Việt Nam Mục đích là xác định Vit.C trong các đối tượng thực tế một cách nhanh chóng, chính xác và hiệu quả

Bảng 2.1: Chương trình ghi sóng cực phổ của Vit.C

Thời gian khuấy sau khi cho mẫu 3 s

Thời gian cân bằng trước khi quét thế 10 s

2.2.1.1 Khảo sát tính chất cực phổ của Vit.C trong một số nền

Xét phương trình cho e– của axit ascobic

O

O

OH O

CH2OH OH

Trong phương trình trên, có sự góp mặt của H+, vì vậy nồng độ H+

ảnh hưởng nhiều đến hoạt tính cực phổ của axit ascobic Tôi chọn điều kiện ghi tín hiệu cực phổ của axit ascobic trong các nền đệm, nhằm duy trì pH ổn định trong suốt quá trình đo Theo tài liệu nghiên cứu, ba loại đệm hay được dùng trong phân tích các chất hữu cơ bằng phương pháp cực phổ là đệm xitrat + hiđrophotphat, đệm axetat, đệm photphat Tôi tiến hành ghi sóng cực phổ xung vi phân của axit ascobic trong ba nền như trên

Chuẩn bị dung dịch nền:

• Nền đệm xitrat + hidrophotphat:

- Pha dung dịch axit xitric 0,1M (cân 10,500 g axit xitric, hòa tan bằng nước thành 500 mL dung dịch)

- Pha dung dịch hidrophotphat 0,2M ( cân 22,822 muối

K2HPO4.3H2O, hòa tan bằng nước thành 500 mL dung dịch)

- Trộn hai dung dịch trên để được các dung dịch đệm có pH khác nhau

Axit ascobic Axit đehiđroascobic

 +2H+ + 2e–

- Trộn hai dung dịch theo thể tích

pH V dd ax.axetic 0,2M (mL) V dd natri axetat 0,2M (mL)

2.2.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của oxi hòa tan

Đo đường cực phổ của dung dịch chứa Vit.C 2mg/L trong đệm axetat 0,2M, thời gian đuổi khí lần lượt 3s, 30s, 60s, 90s, 120s, 150s Chọn thời gian đuổi khí khi píc của Vit.C đã ổn định

2.2.1.3 Khảo sát pH của nền axetat

Để nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến píc của Vit.C, tôi chuẩn bị một dãy dung dịch đệm axetat 0,1M có pH khác nhau, bằng cách trộn hai dung dịch axit axetic 0,1M và natri axetat 0,1M theo tỷ lệ thể tích (9,5 : 0,5), (8 : 2), (5 : 5), (0,5 : 9,5), đo pH của các dung dịch đó trên máy pH meter

Tiến hành ghi đường cực phổ của Vit.C ở 3 nồng độ 1, 2, 3 mg/L trong các nền đã chuẩn bị Lặp lại 2 lần Chọn nền axetat có pH thích hợp cho các phép

đo tiếp sau

2.2.1.4 Khảo sát nồng độ nền axetat

Để loại trừ dòng điện chuyển, nồng độ chất điện ly trong dung dịch phải lớn hơn nồng độ chất nghiên cứu khoảng 50 lần, khoảng nồng độ chất phân tích đo bằng cực phổ tốt nhất theo tài liệu là 10-5  10-4 M, vậy nồng độ chất điện ly trơ nên lớn hơn hoặc bằng 0,01M tương đương nồng độ nền axetat (5:5) là 0,02M Tuy nhiên thực tế nghiên cứu cho thấy cần nồng độ nền lớn hơn, vì vậy tôi tiến hành khảo sát píc của Vit.C trong các dung dịch nền

có nồng độ khác nhau như sau:

• Chuẩn bị dung dịch đệm axetat

- Dung dịch đệm axetat 1M (CH3COOH 0,5M; CH3COONa 0,5M): Cân 20,5075 g natri axetat cho vào bình định mức 500 mL, thêm nước cất hai lần, hòa tan hoàn toàn, thêm 18,75 mL axit axetic băng, định mức đến vạch

- Pha loãng dung dịch đệm axetat 1M bằng nước cất hai lần để được các dung dịch đệm có nồng độ 0,5M; 0,2M; 0,1M; 0,05M; 0,01M; 0,005M

• Tiến hành đo đường cực phổ của Vit.C trong các nền trên ở 3 khoảng nồng độ 5, 10, 15 mg/L ( 2,8; 5,6; 8,4.10-5M ), đo lặp 2 lần, lấy giá trị trung bình

Chọn nồng độ nền tối ưu

2.2.1.5 Khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính

Xây dựng đường chuẩn ip = f(CVit.C) theo phương pháp hồi quy tuyến tính, từ đó chọn được khoảng nồng độ tối ưu, tại đó chiều cao sóng cực phổ của Vit.C phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ của nó

Các giá trị cho trong bảng

Bảng 2.2: Bảng số liệu xây dựng đường chuẩn theo phương pháp hồi quy tuyến tính





(2.1)

i = 1  n Tìm đường chuẩn dạng y = ax + b (2.2)

i i

i y y n

  (2.8)

Đường chuẩn y = (a ± t.sa)x + (b ± t.sb) (2.9)

t là thừa số studen lý thuyết với độ tin cậy thống kê là 95%

hệ số tự do f = n(k-1)

Đánh giá tính có ý nghĩa của hệ số b

- Nếu t.sb > b thì b là giá trị không có nghĩa, chấp nhận b = 0, tính lại phương trình đường chuẩn theo dạng y = ax

- Nếu t.sb < b thì b có nghĩa, đúng là b ≠ 0

Đánh giá độ đúng của đường chuẩn:

Pha dung dịch Vit.C có nồng độ µx coi như chưa biết, ghi đường cực phổ, thay giá trị Yj vào phương trình đường chuẩn được nồng độ Xj, lặp lại m lần, j = 1  m

Giới hạn phát hiện của phương pháp:

Giới hạn phát hiện là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích còn có thể xác định được bằng phương pháp với độ tin cậy thống kê

yDL = y0 + z o