KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG KHÁNG SINH HỌ TETRACYCLINE VÀ AMOXICILLINE TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI TRÊN ĐỊA BÀN TP HỒ CHÍ MINH BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC

KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG KHÁNG SINH HỌ TETRACYCLINE VÀ AMOXICILLINE TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI TRÊN ĐỊA BÀN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC Tháng 09 năm 2010... TÓM TẮT Đề tài: “ Khảo

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG KHÁNG SINH HỌ

TETRACYCLINE VÀ AMOXICILLINE TRONG THỨC ĂN

CHĂN NUÔI TRÊN ĐỊA BÀN TP HỒ CHÍ MINH

KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG KHÁNG SINH HỌ TETRACYCLINE VÀ AMOXICILLINE TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI TRÊN ĐỊA BÀN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC

Tháng 09 năm 2010

LỜI CẢM TẠ

Tôi xin chân thành cảm ơn:

- Ban giám hiệu trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều

kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập

- Các Thầy Cô trong bộ môn Công Nghệ Hóa Học đã chỉ bảo, hướng dẫn tôi

- Các ThS Phùng Võ Cẩm Hồng, Th.S Nguyễn Lê Kiều Thư đã trực tiếp hướng

dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp

- Các anh chị tại Trạm Chẩn đoán- Xét nghiệm và Điều trị( Chi Cục Thú Y Tp

Hồ Chí Minh) đã luôn tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi

- Toàn thể các bạn trong lớp DH06HH đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tôi trong

suốt thời gian làm đề tài

Con thành kính ghi ơn ba mẹ cùng những người thân trong gia đình luôn tạo điều kiện

và động viên con trong suốt quá trình học tập tại trường

Chân thành cảm ơn

Tháng 09 năm 2010

TÓM TẮT

Đề tài: “ Khảo sát hàm lượng kháng sinh họ tetracycline và amoxicilline trong thức ăn chăn nuôi trên địa bàn TP HCM bằng phương pháp HPLC” được tiến hành tại Phòng phân tích dược thuộc Bộ môn Hóa lý- Trạm Chẩn đoán, xét nghiệm và điều trị (Chi Cục Thú Y Tp Hồ Chí Minh), thời gian từ tháng 3/2010 đến tháng 8/2010

Những kết quả đạt được:

• Phân tích hàm lượng kháng sinh họ tetracycline:

- Thiết bị sử dụng : hệ thống HPLC- UV VIS bước sóng 355 nm, dùng cột Synergy 4u, C18, 15 cm x 4,6 mm và cột Synergy 5u, C18, 15 cm x 4,6 mm

- Áp dụng theo quy trình đã công bố của Bộ NN & PTNT (2006)

- Đường chuẩn được dựng ở nồng độ từ 5 ppm đến 50 ppm

- LOD của kháng sinh OTC là 0,2 ppm, CTC là 0,3 ppm

- Hiệu suất thu hồi R của OTC từ 88,69% đến 100,34%; CTC có hiệu suất thu hồi từ 53,133% đến 101,89%

- Tiến hành phân tích 61 mẫu thức ăn chăn nuôi, kết quả có 55,74% mẫu thức ăn dương tính với CTC với hàm lượng từ 12,33 ppm đến 538,17 ppm Có 34,43% mẫu vượt qua khỏi giới hạn cho phép, vượt từ 1,16 đến 10,76 lần so với giới hạn tối đa quy định Có 52,46% mẫu dương tính với OTC với hàm lượng

từ 8,84 ppm đến 860,71 ppm , trong đó 24,59% mẫu vượt qua mức quy định cho phép, vượt từ 1,17 lần đến 17,21 lần so với giới hạn tối đa quy định

• Phân tích hàm lượng kháng sinh AMO:

- Thiết bị sử dụng: hệ thống HPLC - FL bước sóng Ex: 358 nm, Em: 440 nm, dùng cột Zorbax 5u, C18, 25 cm x 4,6 mm

- Áp dụng theo quy trình đã công bố của đại học Ghent, Bỉ (2006)

- Đường chuẩn được dựng ở nồng độ từ 0,2 ppm đến 2 ppm

- LOD của kháng sinh AMO là 0,1 ppm

- Hiệu suất thu hồi R của mẫu từ 65,94% đến 129,6%

- Tiến hành phân tích 61 mẫu thức ăn chăn nuôi, kết quả có 24,59% mẫu thức

ăn dương tính với AMO với hàm lượng từ 16,40 ppm đến 368,33 ppm, vượt gấp 16,4 đến 368,33 lần so với khuyến cáo sử dụng của EU

SUMMARY

Topic:“Quantitative investigation of amoxicilline and tetracycline antibiotics in animal feed at HCM City using HPLC" was conducted at Pharmaceutical Analysis Room, The genres of of physiochemistry - Diagnostic Station, Testing and Treatment (Department of Veterinary Ho Chi Minh), from March 2010 to August 2010

The results were achieved:

• Quantitative analysis of tetracycline antibiotics:

- Equipment: HPLC-UV-VIS system, wavelength: 355 nm, Synergy 4u column, C18, 15 cm x 4,6 mm and Synergy 5U column, C18, 15 cm x 4.6 mm

- To apply by Ministry of Agriculture and Rural Development (2006)

- The directrix has been from 5 ppm to 50 ppm

- LOD of the method: OTC has been 0,2 ppm, CTC has been 0,3 ppm

- The performance of recovery: OTC has been from 88,69% to 100,34%; CTC has been from 53,133% to 101,89%

- Quantitive analysis of 61 samples, 55,74% samples was positive for CTC with content from 12,33 ppm to 538,17 ppm, 34.43% of the samples overcame beyond the permitted limits from 1.16 to 10.76 times.52,46% samples was positive for OTC with content from 8,84 ppm to 860,71 ppm, 24,59% of the samples overcame beyond the permitted limits from 1,17 to 17,21 times

• Quantitative analysis of AMO:

- Equipment: HPLC- FL system - Ex: 358 nm, Em: 440 nm, Zorbax 5U column, C18, 25 cm x 4,6 mm

- To apply by Ghent University, Belgium (2006)

- The directrix has been from 0,2 ppm to 2 ppm

- LOD of the method has been 0,1 ppm

- The performance of recovery has been from 65,94% to 129,6%

- Quantitive analysis of 61 samples, resulting in 24,59% samples was positive for AMO with content from 16,40 ppm to 368,33 ppm, was overcome from 16,4 to 368,33 times when we compared with the recommended use of the EU

MỤC LỤC

Trang

Trang tựa i Cảm tạ ii Tóm tắt iii Summary iv

1.3.Nội dung đề tài 3

2.2.1.2.Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký 11

2.2.1.3.Phân loại các phương pháp sắc ký 11

2.2.2.Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC 11

2.2.2.1.Giới thiệu về phương pháp HPLC 11

2.2.2.2.Ưu và nhược điểm của phương pháp HPLC 15

3.1.Thời gian, địa điểm và vật liệu nghiên cứu 16

3.1.1 Thời gian thực hiện 16

3.1.2 Địa điểm 16 3.1.3 Vật liệu 16 3.2 Hóa chất- dụng cụ và thiết bị 17

3.2.1 Đối với quy trình phân tích hàm lượng kháng sinh họ tetracycline 17

3.2.2 Đối với quy trình phân tích hàm lượng kháng sinh AMO 18

3.3 Phương pháp thí nghiệm 19

3.3.1 Quy trình phân tích kháng sinh họ tetracycline 19

3.3.2 Quy trình phân tích kháng sinh AMO 24

4.1.Kết quả phân tích kháng sinh họ tetracycline 29

4.1.1.Kết quả xây dựng đường chuẩn kháng sinh họ tetracycline 29

4.1.2.Giới hạn phát hiện (LOD, LOQ) kháng sinh họ tetracycline của phương pháp 30

4.1.3.Kết quả xác định hiệu suất thu hồi phân tích kháng sinh họ tetracycline 31

4.1.4.Kết quả phân tích hàm lượng kháng sinh họ tetracycline trên mẫu thử 32

4.2.Kết quả phân tích kháng sinh AMO 36

4.2.1.Kết quả xây dựng đường chuẩn kháng sinh AMO 36

4.2.2.Giới hạn phát hiện (LOD, LOQ) kháng sinh AMO của phương pháp 37

4.2.3.Kết quả xác định hiệu suất thu hồi phân tích kháng sinh AMO 37

4.2.4.Kết quả phân tích hàm lượng kháng sinh AMO trên mẫu thử 38

5.1 Kết luận 40 5.2 Đề nghị 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 42

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

ACN : Acetonitril

TCA : Trichloroacetic acid

HPLC : High Performance Liquid Chromatography ( sắc ký lỏng hiệu năng cao) LOD : Limit of Detection (giới hạn phát hiện)

S/N : Signal – to - noise ( Tỉ số tương đối của tín hiệu so với nhiễu nền) SPE : Solid phase extraction ( Cột chiết pha rắn)

FL : Fluorescence ( Huỳnh quang)

UV-VIS : Ultra-Violet/Visible ( Quang phổ tử ngoại khả kiến)

AMO : Amoxicilline

VSATTP : Vệ sinh an toàn thực phẩm

TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam

CTC : Chlotetracycline hydrochloride

OTC : Oxytetracycline hydrochloride

EDTA : Etilendiamin tetraacetic acid (Titriplex)

Ex : Bước sóng kích thích

Em : Bước sóng phát quang

NN & PTNT : Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn

S : Diện tích peak

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Cấu trúc chung của các kháng sinh họ tetracycline 5

Hình 2.2 Cấu tạo hóa học của kháng sinh chlortetracycline và oxytetracycline 6

Hình 2.3 Cấu trúc kháng sinh amoxicilline 9

Hình 2.4 Hệ thống HPLC tại phòng phân tích dược 12 Hình 2.5 Sơ đồ hệ thống HPLC 13

Hình 3.1.Mẫu thức ăn chăn nuôi được sử dụng làm mẫu phân tích 16

Hình 3.2 Một số giai đoạn trong quy trình chuẩn bị mẫu phân tích CTC và OTC 22

Hình 3.3 Một số giai đoạn trong quy trình chuẩn bị mẫu phân tích AMO 26

Hình 4.1.Đồ thị đường chuẩn 4 điểm kháng sinh OTC với R2 = 0,99980 29

Hình 4.2 Đồ thị đường chuẩn 4 điểm kháng sinh CTC với R2 = 0,99963 30

Hình 4.3 Sắc kí đồ OTC tại LOD= 0,2 ppm và CTC tại LOD = 0,3 ppm 31

Hình 4.4 Đồ thị đường chuẩn 3 điểm kháng sinh AMO với R2 = 0,99971 36

Hình 4.5 Sắc kí đồ chuẩn AMO ở nồng độ 2 ppm (thời gian lưu 3,898 phút) 36

Hình 4.6 Sắc kí đồ chuẩn AMO tại giá trị LOD = 0,1 ppm 37

 

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Cấu trúc của một số dẫn chất tiêu biểu trong họ tetracycline 6

Bảng 2.2 Một số chỉ tiêu dược lý của các kháng sinh họ tetracycline 7

Bảng 2.3 Hàm lượng kháng sinh họ tetracycline tối đa cho phép trong thức ăn hỗn  

hợp cho lợn 8 Bảng 2.4 Hàm lượng kháng sinh họ β-lactam tối đa EU khuyến cáo trong thức ăn 10

Bảng 3.1 Địa điểm và số mẫu khảo sát trong chương trình “ VSATTP” 17

Bảng 3.2 Gradient pha động trong phân tích kháng sinh họ tetracycline 22

Bảng 3.3 Cách đưa chuẩn kháng sinh tetracycline vào mẫu thêm chuẩn xác định hiệu

suất thu hồi 23 Bảng 3.4 Gradient pha động trong phân tích AMO 26

Bảng 3.5 Cách đưa chuẩn AMO vào mẫu thêm chuẩn xác định hiệu suất thu hồi 27

Bảng 4.1 Kết quả xây dựng đường chuẩn 4 điểm kháng sinh oxytetracycline 29

Bảng 4.2 Kết quả xây dựng đường chuẩn 4 điểm kháng sinh chlortetracycline 30

Bảng 4.3 Kết quả xác định hiệu suất thu hồi kháng sinh chlortetracycline dựa vào mẫu

trắng và mẫu thêm chuẩn 31

Bảng 4.4 Kết quả xác định hiệu suất thu hồi kháng sinh oxytetracycline dựa vào mẫu

trắng và mẫu thêm chuẩn 31

Bảng 4.5 Bảng kết quả phân tích kháng sinh CTC theo từng quận, huyện 32

Bảng 4.6 Bảng kết quả phân tích kháng sinh OTC theo từng quận, huyện 32

Bảng 4.7 Kết quả xây dựng đường chuẩn 3 điểm kháng sinh AMO 36

Bảng 4.8 Kết quả xác định hiệu suất thu hồi dựa vào mẫu trắng và mẫu thêm chuẩn ở

các nồng độ 0,2 ppm; 1 ppm; 2 ppm 37

Bảng 4.9 Kết quả phân tích kháng sinh AMO theo từng quận, huyện 38

Sơ đồ 3.1 Quy trình chuẩn bị mẫu được công bố bởi Bộ NN& PTNT 21

Sơ đồ 3.2 Quy trình chuẩn bị mẫu được công bố bởi đại học Ghent- Bỉ 25

tế, người chăn nuôi thường sử dụng các loại kháng sinh trong quá trình chăn nuôi Nhưng với kiến thức còn hạn chế hoặc vì những lý do khác nhau, họ lại sử dụng kháng sinh một cách không hợp lý

Hiện nay, vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm là vấn đề được đặt lên hàng đầu

Khi vật nuôi ăn thức ăn bị nhiễm kháng sinh, ít nhiều trong cơ thể chúng còn chứa đựng lượng tồn dư kháng sinh này Tồn dư kháng sinh trên sản phẩm động vật ( thịt, trứng, sữa…) đe dọa đến sức khỏe người tiêu dùng như tình trạng ngộ độc hoặc dị ứng ngay cả đối với hàm lượng thấp Nó còn ảnh hưởng đến chất lượng của sản phẩm, cản trở các quá trình chế biến các sản phẩm thứ cấp (yaourt, phomat…) [4] Ngoài ra, kháng sinh được thải ra môi trường gây ảnh hưởng có hại đến môi trường sống: phá vỡ

hệ sinh thái vi sinh vật đất, sự tồn tại và luân chuyển của nguồn gen kháng kháng sinh trong môi trường…[17]

Tình hình sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi ở Việt Nam và nước ngoài:

a Trong nước

Khảo sát 55 cơ sở chăn nuôi tại Đồng Nai, Bình Dương (2008), có 13 loại kháng sinh được dùng nhiều nhất là : Tylosine (16,39%), Amoxicilline (11,89%), Gentamycine (8,61%), Enrofloxacine (6,56%), Penicilline (6,15%), Lincomycine (5,74%), Tiamuline (5,74%),Colistine (5,33%), Streptomycine (4,51%), Norfloxacine (4,51%), Tetracycline (4,1%), Ampicilline (4,1%) và Florphenicole (3,28%) [9]

b Ngoài nước

- Theo số liệu của viện Thú y Mỹ (AHI), lượng kháng sinh được sử dụng trong chăn nuôi (1999) khoảng 20,42 triệu pao, trong đó kháng sinh nhóm Ionophore

và arsen chiếm nhiều nhất (47,5%), tetracycline (15,67%); penicilline (4,26%) và các loại khác (32,57%) [17]

- Ở Châu Âu, (1997), tỷ lệ các loại kháng sinh được sử dụng trong chăn nuôi: penicilline: 9%; tetracycline: 66%; macrolide: 12%; Aminoglycoside: 4%; Fluoroquinolone: 1%; Trimethomprim/sulpha: 2% và các kháng sinh khác: 6%

Hiện nay, nhiều quốc gia đã cấm dùng kháng sinh trong thức ăn gia súc gia cầm (Đan Mạch, Thụy Điển…) hoặc cho phép dùng như có quy định chặt chẽ về loại kháng sinh, liều lượng được phép sử dụng (Nhật Bản, Úc…)

Kháng sinh họ tetracycline và kháng sinh amoxicilline trong họ β - lactam là những kháng sinh khá phổ biến và thường được sử dụng nhiều nhất trong chăn nuôi Các kháng sinh này được bổ sung vào trong thức ăn chăn nuôi với hàm lượng khá cao:

150 – 500 mg/kg [16] Đối với các ngành chức năng, để quản lý tốt vấn đề này cũng như khuyến cáo người dân sử dụng kháng sinh an toàn, việc phân tích định tính, định lượng kháng sinh là rất cần thiết Hiện nay, có nhiều phương pháp để phân tích hàm lượng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi, trong đó phân tích bằng pháp sắc ký khá hiện đại, cho kết quả nhanh, chính xác, có thể định tính lẫn định lượng hợp chất hoặc đơn chất Phương pháp sắc kí lỏng HPLC thích hợp để phân tích mẫu thức ăn chăn nuôi có hàm lượng kháng sinh lớn

Từ những vấn đề đáng quan tâm trên, được sự phân công của BM CNHH, dưới

sự hướng dẫn của ThS Phùng Võ Cẩm Hồng (Viện nghiên cứu Công Nghệ Sinh Học

và Môi Trường, Đại học Nông Lâm - TP HCM) và Th.S Nguyễn Lê Kiều Thư (Bộ môn Hóa Lý- Trạm chẩn đoán, xét nghiệm và điều trị, Chi Cục Thú Y TP HCM), tôi thực hiện đề tài “Khảo sát hàm lượng kháng sinh họ tetracyclin và amoxicillin trong thức ăn chăn nuôi trên địa bàn TP Hồ Chí Minh bằng phương pháp HPLC”

1.3.Nội dung đề tài

- Dựng đường chuẩn 4 điểm (nồng độ 5 ppm; 10 ppm; 25 ppm và 50 ppm) kháng sinh họ tetracycline ( chlortetracycline và oxytetracycline)

- Tìm giới hạn phát hiện (LOD, LOQ) của phương pháp phân tích kháng sinh

họ tetracycline

- Xác định hiệu suất thu hồi của họ tetracycline trên nền thức ăn chăn nuôi

- Dựng đường chuẩn 3 điểm (nồng độ 0,2 ppm, 1 ppm, 2 ppm) AMO

- Tìm giới hạn phát hiện (LOD, LOQ) của phương pháp phân tích kháng sinh AMO

- Xác định hiệu suất thu hồi của AMO trên nền thức ăn chăn nuôi

- Tiến hành phân tích các mẫu thử để xác định hàm lượng kháng sinh họ tetracycline và AMO, so sánh với ngưỡng tối đa cho phép kháng sinh sử dụng bổ sung trong thức ăn chăn nuôi

- Đưa ra một số khuyến cáo về việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi góp phần thực hiện VSATTP và bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng

1.4.Yêu cầu

- Các mẫu thức ăn được lấy trong chương trình: “ VSATTP” do Chi Cục Thú

Y TP HCM tiến hành

- Tạo được mẫu đưa vào phân tích có độ tinh sạch cao

- Thao tác thực hiện thí nghiệm chính xác

- Sử dụng thiết bị HPLC (đầu dò UV và FL) của Phòng phân tích dược- Bộ Môn Hóa lý thuộc Trạm chẩn đoán, xét nghiệm và điều trị ( Chi Cục Thú Y Tp Hồ Chí Minh) và một số dụng cụ, thiết bị khác để tiến hành phân tích định lượng kháng sinh

họ tetracycline và kháng sinh amoxicilline trên nền mẫu thức ăn chăn nuôi

Độc tính chọn lọc là điểm quan trọng để phân biệt thuốc kháng sinh (antibiotic)

với các thuốc sát khuẩn (antiseptic) [7]

2.1.1.2 Sử dụng kháng sinh

a.Tình hình sử dụng kháng sinh ở Việt Nam và một số nước trên thế giới: [5]

Ở Việt Nam, có 143 loại biệt dược chứa kháng sinh đang được sử dụng trong chăn nuôi, trong đó có 36 loại kháng sinh đang được sử dụng phổ biến như: colistin, enrofloxacin, sulfamide, trimethoprim, norfloxacin, gentamycin, nhóm tetracycline, nhóm β-lactam…

Ở Úc, từ giai đoạn 1992 - 1997 có khoảng 55,8% lượng kháng sinh nhập khẩu được sử dụng ; 36,4% sử dụng cho người và 7,8% cho thú y Tại Mỹ, có khoảng 6 triệu pound kháng sinh được sản xuất ra mỗi năm; trong đó 60% sử dụng cho người, 40% dùng cho chăn nuôi(32% dùng cho phòng bệnh, 8% dùng điều trị bệnh gia súc gia cầm) ( Barton, 2000)

Tại Châu Âu ( 1996 - 1997): 52% kháng sinh được sử dụng cho người, 33% cho thú y và 15% cho mục đích kích thích tăng trưởng bằng cách bổ sung trong chăn nuôi thú y Năm 1999, số lượng kháng sinh sử dụng tại EU và Switzeland ước tính là 13,288 tấn, trong đó có 65% dùng cho người, 29% dùng trong thú y và 6% dùng trong kích thích tăng trưởng (Nicole, 2008)

b Các trường hợp sử dụng kháng sinh [8]

- Sử dụng kháng sinh trong điều trị

- Sử dụng kháng sinh trong phòng bệnh

- Sử dụng kháng sinh với mục đích tăng trọng (đối với vật nuôi)

c.Việc lựa chọn kháng sinh dựa vào

- Sự hiểu biết về mức độ nhạy cảm với kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh

- Sự hiểu biết về tác động dược lý để đánh giá khả năng mà kháng sinh đi tới ổ bệnh với nồng độ đủ ức chế hoặc tiêu diệt vi khuẩn

- Sự hiểu biết về độc tính của kháng sinh và các yếu tố làm tăng độc tính của nó

- Sự hiểu biết về chi phí của việc điều trị, đi kèm với hiệu quả điều trị

d Các vấn đề tồn tại khi sử dụng kháng sinh không đúng

Vi khuẩn gây bệnh tiếp xúc thường xuyên với kháng sinh liều thấp sẽ tạo thích ứng Một số biến chủng thay đổi cấu trúc ADN để chống lại kháng sinh, dần dần, chúng biến kháng sinh thành yếu tố cần thiết để tránh sự tấn công của vi khuẩn khác

- Đối với vật nuôi và con người: gây rối loạn tiêu hóa, cơ thể mất đi sức đề kháng bản thân, sức chống chọi với bệnh tật ngày càng yếu Sử dụng kháng sinh thời gian dài làm tăng hiện tượng kháng kháng sinh, làm cho việc điều trị bệnh không còn hiệu quả

- Đối với chất lượng sản phẩm chăn nuôi: vật nuôi ăn thức ăn bị nhiễm kháng sinh trong thời gian dài sẽ để lại lượng tồn dư kháng sinh trong sữa, gây ức chế vi khuẩn sử dụng trong chế biến các sản phẩm từ sữa như phomat, sữa chua

- Đối với môi trường: kháng sinh do vật nuôi đào thải ra ngoài môi trường trong thời gian dài, gây ảnh hưởng có hại đến môi trường sống: phá vỡ hệ sinh thái vi sinh vật đất, sự tồn tại và luân chuyển của nguồn gen kháng kháng sinh trong môi trường…

2.1.2 Kháng sinh họ tetracycline và kháng sinh AMO

2.1.2.1 Kháng sinh họ tetracycline

a Giới thiệu chung về họ tetracycline :

Hình 2.1 Cấu trúc chung của các kháng sinh họ tetracycline

Bảng 2.1 Cấu trúc của một số dẫn chất tiêu biểu trong họ tetracycline

Tên R1 R2 R3 R4 R5 R6

Thiên nhiên Oxytetracycline H CH3 OH OH NH2 H Clorotetracycline Cl CH3 OH H NH2 H Tetracycline H CH3 OH H NH2 H

Tổng hợp Doxycycline H H CH3 OH NH2 H

Đây là họ kháng sinh có hoạt phổ rộng, rất thông dụng Chất đầu tiên là Clorotetracycline còn gọi là aureomycin, do Benjamin Duggar ly trích được năm 1948

từ môi trường nuôi cấy Streptomyces aureofaciens Sau đó, năm 1950, Finlay đã ly trích oxytetracycline từ Streptomyces rimosus và năm 1952 mới tìm ra chất cơ bản là tetracycline Những năm sau, doxycycline, minocycline, metacycline, amicycline là các chất bán tổng hợp được tìm ra

Hình 2.2 Cấu tạo hóa học của kháng sinh chlortetracycline và oxytetracycline

- Các tetracycline cho phản ứng alcaloid với acid picric, iodomercuric, iodoiodid

- Tan được trong dung dịch kiềm và phản ứng tạo tạo màu với Fe3+.

- Kết hợp với các ion hóa trị 2 và 3, thường nhất là Fe3+, Cu2+, Fe2+, Co2+, Zn2+, tạo

Oxytetracycline Chlortetracycline

các phức chelat không tan, kém hấp thu qua ruột

- Kém bền với nóng ẩm và ánh sáng chiếu trực tiếp, dẫn đến sự phân hủy thuốc, tạo thành một số dẫn chất như anhydrotetracycline 4 - epitetracycline, anhydro 4 - epitetracycline có độc tính cao trên thận

c.Cơ chế tác động

Tất cả kháng sinh họ tetracycline đều có tác dụng kiềm khuẩn, ngoại trừ minicycline có tác động diệt khuẩn Tuy nhiên, ở nồng độ cao, các tetracycline có thể diệt khuẩn Các kháng sinh họ tetracycline kết dính với tiểu thể 30S của ribosome sau khi đi qua màng tế bào của vi khuẩn Sự kết dính dẫn đến ngăn cản ARN –t gắn vào ARN-m, cuối cùng acid amin không được phóng thích tại ribosome, do vậy sự tổng hợp protein bị ức chế

- Tích lũy trong hệ võng mạc nội mô, lách, tủy xương, ngà răng, men răng, qua được nhau thai, sữa mẹ, các mô và dịch cơ thể nhưng kém vào dịch não tủy

- Đào thải chủ yếu qua nước tiểu

Bảng 2.2 Một số chỉ tiêu dược lý của các kháng sinh họ tetracycline

Tên thuốc

Hấp thu theo đường uống (%)

Độ thanh thải của thận (ml/phút)

Thời gian bán hủy ( h)

Phân loại tác dụng Chlotetracycline

Oxytetracycline

Tetracycline

30 60-70

e Phổ kháng khuẩn

Nhóm tetracycline có tác động kìm khuẩn (bacteriostatic), độ nhạy cảm và sự

đề kháng giữa các chất trong cùng nhóm, nói chung tương tự nhau

Các tetracycline có hoạt phổ rộng không chỉ trên vi khuẩn gram dương và gram

âm, mà còn trên một số mầm nội bào khác: Rickettsia, Chlamydia, Mycoplasma,

Plasmodium, có hoạt tính yếu trên vi nấm Candida, tác động ức chế gián tiếp sự phát

triển của amib ruột

Kháng sinh nhóm này tác động trên vi khuẩn gram dương ở liều thấp hơn so với

vi khuẩn gram âm, nhưng thực tế ít dùng điều trị nhiễm khuẩn gram dương do các

chủng này đề kháng nhanh với thuốc

Bảng 2.3 Hàm lượng kháng sinh họ tetracycline tối đa cho phép trong thức ăn hỗn

hợp cho lợn [2]

Tên kháng sinh Hàm lượng tối đa cho phép (ppm)

Chlotetracycline 50 Oxytetracycline 50

f.Các kháng sinh cụ thể:

• Chlotetracycline:

- Công thức tổng quát của Chlotetracycline: C22H23ClN2O8

- Phân tử lượng : 478,5

- Tên khoa học: (4S, 4aS, 5aS, 6S, 12aS)-7-cloro-4-dimethylamino1, 4, 4a, 5,

5a, 6, 11, 12a-octahydro-3, 6, 10, 12, 12a – pentahydroxy - 6- methyl -1,

11-dioxo naphthacen - 2- carboxamid

- Điều chế: Phân lập từ môi trường nuôi cấy Streptomyces aureofaciens

Người ta cũng đã phân lập được bromtetracyclin từ môi trường nuôi cấy

Streptomyces aureofaciens, chất này có tác dụng tương tự clotetracyclin

- Tính chất: Bột vàng, tan nhẹ trong nước và alcol, tan trong dung dịch kiềm và

carbonat

• Oxytetracycline:

- Công thức tổng quát của Oxytetracycline: C22H24N2O9

- Phân tử lượng : 460,4

- Tên khoa học: (4S, 4aS, 5aS, 6S, 12aS) - 4-dimethylamino - 1, 4, 4a, 5, 5a, 6,

11, 12a-octahydro-3, 5, 6, 10, 12, 12a – pentahydroxy - 6- methyl -1, 11-dioxo

+ Kết hợp với K+ tạo các phenolat ở các oxy 1, 12a, 12 và 11

+ Tạo muối hydroclorid với acid hydrocloric ở nhóm 4-dimethylamino

+ Hai dạng mất hoạt tính trong môi trường kiềm và các dung dịch pH < 2

2.1.2.2 Kháng sinh amoxicilline

- Công thức tổng quát của amoxicilline: C16H19 N3O5S

- Phân tử lượng: 365,41

Hình 2.3 Cấu trúc kháng sinh amoxicilline

- Tên khoa học: Acid (2S,5R,6R)-6-[(R)-2-amino-2-(parahydroxyphenyl)

acetamido]-3, 3-dimethyl-7-oxo-4-thia-1-azabicyclo[acetamido]-3,2,0]heptan-2-carboxylic

- Tính chất

+ Amoxicilline là dẫn xuất bán tổn hợp của penicillin

+ Bột kết tinh trắng, vị đắng

+ Độ ẩm cao và nhiệt độ > 37 oC ảnh hưởng bất lợi đến độ bền

+ Độ tan: 1 g/370 ml nước hoặc 1000 ml alcol

- Cơ chế tác động :

Amoxicilline ức chế sự tổng hợp vách tế bào vi khuẩn bằng cách tấn công vào

những protein đặc biệt bên trong màng tế bào vi khuẩn Trên tế bào tăng trưởng, sự

liên kết amoxicilline trong vách tế bào gây trở ngại cho việc sản xuất peptidoglycan

của vách tế bào và tiêu hủy tế bào Xâm nhập qua vách tế bào vi khuẩn gram âm

- Sự hấp thu của thuốc : Amoxicilline bền vững trong dịch dạ dày

- Sự phân bố của thuốc :

Sau khi được hấp thu, amoxicilline có thể phân bố rộng rãi đến hầu hết các mô:

gan, phổi, mô cơ, túi mật, máng phổi và hoạt dịch, nồng độ rất thấp trong nước mắt,

mồ hôi, nước bọt

- Sự bài tiết của thuốc

Amoxicilline chủ yếu được bài tiết qua thận, khoảng 10 – 25% liều cấp của

amoxicilline

Bảng 2.4.Hàm lượng kháng sinh họ β-lactam tối đa EU khuyến cáo trong thức ăn [16]

Kháng sinh họ β-lactam Hàm lượng tối đa nên sử dụng (ppb)

Amoxicilline 100 Ampicilline 100 Penicilline G (benzylpenicilline) 100

Penicilline V (phenoxymethylpenicilline) 100

Oxacilline 100 Cloxacilline 100 Dicloxacilline 100 Nafcilline 100

2.2.Phương pháp sắc ký

2.2.1 Giới thiệu chung về phương pháp sắc ký

2.2.1.1 Lịch sử phương pháp sắc ký [21]

Nhà thực vật học người Nga Mikhail Tsvet (Mikhail Semyonovich Tsvet) phát

minh ra kĩ thuật sắc kí vào năm 1903 khi ông đang nghiên cứu về chlorophyll Chữ sắc

trong sắc kí có nghĩa là màu; nó vừa là tên của Tsvet trong nghĩa tiếng Nga, và vừa là

màu của các sắc tố thực vật ông phân tích vào lúc bấy giờ Tên này vẫn tiếp tục được

dùng dù các phương pháp hiện đại không còn liên quan đến màu sắc

Năm 1952 Archer John Porter Martin và Richard Laurence Millington Synge

được trao giải Nobel Hoá học cho phát minh của họ về sắc ký phân bố

Kĩ thuật sắc ký phát triển nhanh chóng trong suốt thế kỉ 20 Các nhà nghiên cứu nhận thấy nguyên tắc nền tảng của sắc ký Tsvet có thể được áp dụng theo nhiều cách khác nhau, từ đó xuất hiện nhiều loại sắc ký khác nhau Đồng thời, kĩ thuật thực hiện sắc kýcũng tiến bộ liên tục, cho phép phân tích các phân tử tương tự nhau.

2.2.1.2.Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký [20]

Sắc ký (Chromatography) là phương pháp tách, phân ly, phân tách các chất dựa vào sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha động và tĩnh

Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với tính chất của chúng (tính bị hấp phụ, tính tan, …) Trong hệ thống sắc ký chỉ có các phân tử pha động mới chuyển động dọc theo hệ sắc ký Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh Trong quá trình chuyển động dọc theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ, phản hấp phụ Hệ quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyện động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất tương tác yếu hơn pha này Nhờ đặc điểm này mà người ta có thể tách các chất qua quá trình sắc ký

2.2.1.3 Phân loại các phương pháp sắc ký

Trong phương pháp sắc ký, pha động phải là các lưu thể (các chất ở dạng khí hay lỏng), còn pha tĩnh có thể là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn Dựa vào trạng thái tập hợp của pha động, người ta có thể chia sắc ký thành hai nhóm lớn: sắc ký khí (gas chromatography- GC) và sắc ký lỏng (liquid chromatography - LC) Dựa vào cơ chế trao đổi của các chất giữa hai pha động và tĩnh người ta lại chia các phương pháp sắc

ký thành các nhóm nhỏ hơn

2.2.2 Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC [11], [12], [19]

2.2.2.1 Giới thiệu về phương pháp HPLC

HPLC: Sắc ký lỏng hiệu năng cao ( High Performance Liquid Chromatography), trước kia gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography) Phương pháp này ra đời từ năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển

Hình 2.4 Hệ thống HPLC tại phòng phân tích dược

a Khái niệm

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đó được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn ,hay một chất mang đó được biến đổi bằng liên kết hoá học với các nhóm chức hữu cơ Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay phân loại theo kích cỡ ( Rây phân tử)

b Nguyên tắc

Nguyên tắc của phương pháp HPLC dựa trên sự phân bố của chất tan giữa hai chất lỏng không trộn lẫn vào nhau khi cho một chất lỏng di chuyển (pha động) qua chất lỏng đứng im (pha tĩnh) Pha tĩnh bị hấp phụ trên bề mặt chất rắn (chất mang)

c Cấu tạo và các bộ phận của HPLC

Hệ thống HPLC gồm các bộ phận cơ bản được tóm tắt theo sơ đồ sau :

Hình 2.5 Sơ đồ hệ thống HPLC

(1).Bình chứa dung môi pha động

(2) Bộ khử khí Degasse

(3).Hệ thống bơm mẫu (bơm cao áp)

(4).Cột sắc ký (pha tĩnh)(để ngoài môi trường hay trong bộ điều nhiệt) (5).Đầu dò ( detector) (nhận tín hiệu)

(6).Bộ phận tiêm mẫu (bằng tay hay autosample)

(7).Hệ thống xử lý dữ liệu

o Pha động:

Tùy vào mô hình của HPLC mà pha động có thể thay đổi Đối với pha thuận, dung môi thường không phân cực Đối với pha đảo, sử dụng pha trộn giữa nước và dung môi hữu cơ phân cực như acetonitrile (CH3CN)

o Hệ thống khử khí Degasse

- Mục đích của bộ khử khí: loại trừ bọt nhỏ sót lại trong dung môi pha động

- Nếu trong quá trình phân tích, dung môi pha động còn sót các bọt khí, một số hiện tượng sau đây sẽ sảy ra:

+ Tỷ lệ pha động của các đường dung môi lấy không đúng sẽ làm cho thời gian lưu của Peak thay đổi

+ Trong trường hợp bọt quá nhiều, bộ khử khí không thể loại trừ hết được, có thể bơm sẽ không hút được dung môi, khi đó áp suất không lên và máy sắc ký sẽ ngừng hoạt động

- Trong bất cứ trường hợp nào nêu trên cũng cho kết quả phân tích sai

o Bơm cao áp

- Mục đích để bơm pha động vào cột thực hiện quá trình chia tách sắc ký Bơm phải tạo được áp suất cao khoảng 3000 - 6000 PSI hoặc 250 - 500 at ( 1at = 0,98 Bar)

và bơm phải tạo dòng liên tục Lưu lượng bơm từ 0,1 đến 9,999 ml/phút

Máy sắc ký lỏng hiện nay thường có áp suất tối đa 412 Bar Tốc độ dòng 0,1 9,999 ml/phút

Tốc độ bơm là hằng định theo thông số đã được cài đặt Hiện tại bơm có 2 Pistone để thay phiên nhau đẩy dung môi liên tục

o Bộ phận tiêm mẫu (injection):

- Để đưa mẫu vào cột phân tích theo phương pháp không ngừng dòng chảy Với thể tích là 5 - 100μl

- Có 02 cách lấy mẫu vào trong cột : Bằng tiêm mẫu thủ công (tiêm bằng tay)

và tiêm mẫu tự động (Autosample)

- Vấn đề cần lưu ý :

+ Sử dụng dụng cụ tiêm ( injector) cho nhiều cột

+ Có chế độ rửa dụng cụ tiêm cho phù hợp

+ Xác định thể tích tối đa cho việc tiêm mẫu

o Cột sắc ký :

Cột pha tĩnh thông thường làm bằng thép không rỉ, chiều dài cột khoảng 10 30cm , đường kính trong 1 - 10mm, hạt chất nhồi cỡ φ = 5 - 10 μm (Ngoài ra còn có một số trường hợp đặc biệt về kích thước và kích cỡ hạt )

-o Detector (đầu dò) Là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu ghi trên săc ký đồ để có thể định tính và định lượng Tùy theo tính chất của các chất cần phân tích mà người ta sử dụng loại đầu dò thích hợp và phải thoả mãn điều kiện trong một vùng nồng độ nhất định của chất phân tích

- Trên cơ sở đó người ta chế tạo các lọai đầu dò sau :

+ Đầu dò quang phổ tử ngoại 200 - 380 nm để phát hiện UV

+ Đầu dò quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-VIS): 190 - 900 nm để phát hiện các chất hấp thụ quang Đây là loại thông dụng nhất

+ Đầu dò huỳnh quang (FL) để phát hiện các chất hữu cơ phát huỳnh quang tự

nhiên cũng như các dẫn chất có huỳnh quang Là loại đầu dò có độ chọn lọc cao nhất + Loại hiện đại đại hơn có đầu dò Diod Array, ELSD (Đầu dò tán xạ bay hơi) Các đầu dò này có khả năng quét chồng phổ để định tính các chất theo độ hấp thu cực đại của các chất

- Ngoài ra còn có một số loại đầu dò khác là :

+ Đầu dò khối phổ : MS

+ Đầu dò điện hóa : Đo dòng, cực phổ, độ dẫn, điện lượng )

+ Đầu dò chiết suất vi sai : Đầu dò khúc xạ

+ Đầu dò đo độ dẫn nhiệt, hiệu ứng nhiệt …

o Bộ phận ghi tín hiệu

- Để ghi tín hiệu phát hiện do đầu dò truyền sang

- Trong các máy thế hệ cũ thì sử dụng máy ghi đơn giản có thể vẽ sắc ký đồ, thời gian lưu, diện tích của Peak, chiều cao

- Các máy thế hệ mới đều dùng phần mềm chạy trên máy tính, có thể lưu tất cả các thông số, phổ đồ và các thông số của Peak như tính đối xứng, hệ số phân giải trong quá trình phân tích, đồng thời xử lý, tính toán các thông số theo yêu cầu của người sử dụng như : Nồng độ, RSD,

+ Độ nhạy cao, độ phân giải cao nhờ quá trình tách trên cột

+ Thu được nhiều cấu tử khác nhau mà các kỹ thuật sắc ký khác không thực hiện được

+ Dễ dàng phân tách số lượng lớn các chất hóa học trộn lẫn vào nhau + Thể tích mẫu phân tích nhỏ ( 1 – 100 µl)

- Nhược điểm

+ Trang thiết bị quá đắt tiền

+ Giá thành phân tích còn khá cao

Chương 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1.Thời gian , địa điểm và vật liệu nghiên cứu

3.1.1 Thời gian thực hiện

Khoá luận được thực hiện từ 3/2010 đến 8/2010

3.1.2 Địa điểm

Phòng phân tích dược –Bộ môn Hóa Lý thuộc Trạm Chẩn đoán - Xét nghiệm

và Điều trị (Chi Cục Thú Y TP HCM), 151- Lý Thường Kiệt, Quận 11, TP Hồ Chí Minh

3.1.3.Vật liệu

Các mẫu thức ăn chăn nuôi được lấy tại các cơ sở chăn nuôi trên địa bàn TP Hồ Chí Minh trong chương trình “ VSATTP” do Chi Cục Thú Y tiến hành và mẫu thức ăn chăn nuôi được bảo quản ở nhiệt độ phòng

Hình 3.1.Mẫu thức ăn chăn nuôi được sử dụng làm mẫu phân tích

Bảng 3.1 Địa điểm và số mẫu khảo sát trong chương trình “ VSATTP”

STT Quận/ Huyện Xã, thị trấn Số mẫu

1 Bình Chánh Vĩnh Lộc A, Vĩnh Lộc B 5

2 Củ Chi An Phú, Bình Mỹ, An Nhơn Tây 9

3 Hóc Môn Tân Thới Nhì, Bà Điểm, Xuân Thới Sơn, Tân Hiệp,

- Máy đo pH ( đo được 0.05 đơn vị)

- Thiết bị trộn mẫu vortex mixer

- Bể siêu âm

- Máy lắc tự động (automatic shacker)

- Máy ly tâm ( bench- centrifuge) thể tích lớn

- Ống nghiệm ly tâm nhựa hoặc thủy tinh 50 ml, có nắp

- Xyranh thủy tinh, ống tiêm, găng tay, phin lọc mẫu 0,45µm, 0,2 µm

- Pipet tự động điều chỉnh được từ 1ml đến 10 ml

- Phễu lọc Buchner đường kính 5,5 cm

- Bình định mức 10, 20, 100, 500, 1000 ml

- Cột trích pha rắn SPE C18 , 6ml, 500mg

- Bình lọc chân không

- Màng lọc dung môi 0,45µm, giấy lọc Whatman

- Hệ thống manifold và bơm hút chân không

-Thuốc thử: Dung dịch đệm McILvaine – EDTA, dung dịch H2C2O4/CH3OH

3.2.2 Đối với quy trình phân tích hàm lượng kháng sinh AMO [13], [15]

- Máy đo pH ( đo được 0.05 đơn vị)

- Thiết bị trộn mẫu vortex mixer

- Bể siêu âm

- Bể điều nhiệt

- Máy lắc tự động (automatic shacker)

- Máy ly tâm ( bench- centrifuge) thể tích lớn

- Ống nghiệm ly tâm nhựa hoặc thủy tinh 50ml, có nắp

- Micropipet các loại (10 – 100 µl, 100 – 1000 µl)

- Đầu típ các loại (10 – 100 µl, 100 – 1000 µl)

- Pipet tự động điều chỉnh được từ 1ml đến 10 ml

- Bình định mức 10, 20, 100, 500, 1000 ml

- Màng lọc dung môi 0.45µm

- Phin lọc mẫu 0,2 µm, 0.45µm, cyranh thủy tinh

- Lọ thủy tinh nhỏ ( LC Vial)

- Ống thổi thủy tinh và bơm hút, đẩy chân không

- Ống nghiệm thủy tinh 11 ml có nắp vặn

- Diethyl ether tinh khiết 99%

- Amonium acetate CH3COONH4 khan

- ACN tinh khiết

- H3PO4

3.3 Phương pháp thí nghiệm

3.3.1.Quy trình phân tích kháng sinh họ tetracycline [1]

a Pha hóa chất và thuốc thử

- Dung dịch đệm McILvaine : Pha 312,5 ml dung dịch Na2HPO4 0,1M (cân 14,2 g Na2HPO4 khan, định mức trong bình định mức 500 ml bằng nước cất) với 500

- Chuẩn 25 ppm : lấy 2,5 ml chuẩn 100 ppm định mức trong bình định mức 10

ml bằng dung dịch H2C2O4/CH3OH trong nước với tỷ lệ 3:2

- Chuẩn 10 ppm : lấy 1 ml chuẩn 100 ppm định mức trong bình định mức 10 ml bằng dung dịch H2C2O4/CH3OH trong nước với tỷ lệ 3:2

- Chuẩn 5 ppm : lấy 5 ml chuẩn 10 ppm định mức trong bình định mức 10 ml bằng dung dịch H2C2O4/CH3OH trong nước với tỷ lệ 3:2

c Quy trình chuẩn bị mẫu

• Tiến hành xay mẫu :

+ Mẫu ở dạng bột mịn: Nếu mẫu thí nghiệm ở dạng bột lọt hoàn toàn qua sàng

có kích thước lỗ sàng 1,00 mm thì trộn thật đều mẫu Sau đó chia hỗn hợp cho đến khi thu được lượng mẫu thử không dưới 100 gam

+ Mẫu có kích thước hạt vừa: Nếu mẫu thí nghiệm không lọt hết qua sàng có kích thước lỗ sàng 1,00 mm nhưng lọt hoàn toàn qua sàng có kích thước lỗ 3,00 mm thì trộn thật đều mẫu.Chia mẫu cho đến khi thu được lượng mẫu thử không dưới 100 gam Nghiền lượng mẫu này cẩn thận trong máy nghiền cho đến khi mẫu lọt hoàn toàn qua sàng có kích thước lỗ sàng 1,00 mm

+ Mẫu có kích thước hạt to: Nếu mẫu không lọt qua sàng có kích thước lỗ sàng 3,00 mm thì cần nghiền mẫu trên máy nghiền cho đến khi mẫu lọt hoàn toàn qua sàng

có kích thước lỗ sàng 3,00 mm, sau đó trộn thật đều mẫu Dùng thiết bị chia đôi hoặc thiết bị chia tư mẫu đã trộn đều cho đến khi thu được lượng mẫu thử không dưới 100 gam Nghiền lượng mẫu này cẩn thận trong máy nghiền cho đến khi mẫu lọt hoàn toàn qua sàng có kích thước lỗ sàng 1,00 mm

• Quy trình chuẩn bị mẫu phân tích hàm lượng kháng sinh họ tetracycline:

Sơ đồ 3.1.Quy trình chuẩn bị mẫu được công bố bởi Bộ NN& PTNT

Cân 1,00 ± 0,01 g mẫu vào ống ly tâm 1Thêm 20 ml dung dịch đệm Ilvaine- EDTA, lắc

10 phút, ly tâm 4000 vòng/ 10 phútThu dịch lọc vào ống ly tâm 2

Thêm 20 ml đệm Ilvaine- EDTA vào ống ly tâm 1, Vortex, lắc 10 phút, ly tâm 4000 vòng/ 10 phút Gộp dịch lọc ở ống ly tâm 1vào ống ly tâm 2

Làm khô cột với bơm chân khôngRửa giải mẫu với 6 ml H2C2O4/CH3OH và 4 ml nước cất Lọc qua phin lọc 0.45 µm và tiêm vào máy sắc ký

Rửa cột bằng 5 ml CH3OH 15%

Hình 3.2 Một số giai đoạn trong quy trình chuẩn bị mẫu phân tích CTC và OTC

(a): Lọc mẫu qua phễu Buchner; (b): Mẫu qua cột SPE; (c): Rửa giải

d Tiến hành phân tích trên HPLC

-Gradient pha động :

Bảng 3.2 Gradient pha động trong phân tích kháng sinh họ tetracycline

Thời gian ( phút) CH3CN (%) HOOC-COOH 0.01M (%)

e1 Xây dựng đường chuẩn kháng sinh họ tetracycline

Xây dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa diện tích peak thu được của dung dịch chuẩn với nồng độ của từng loại theo quan hệ tuyến tính bậc 1:

y = ax + b Trong đó: y : diện tích peak (hoặc chiều cao của peak)

(a) (b) (c)

e2 Xác định giới hạn phát hiện (LOD, LOQ) họ tetracycline của phương pháp

Định nghĩa LOD (limit of detection) : là cực tiểu phát hiện được của phương pháp, đó là nồng độ tối thiểu của một chất trong một nền mẫu xác định mà thiết bị có thể phát hiện định tính được

Định nghĩa LOQ (limit of quantitation) : là cực tiểu đo được của phương pháp,

đó là nồng độ tối thiểu của một chất trong một nền mẫu xác định mà thiết bị có thể đo đúng được với một RSD% quy định LOQ = 10 LOD

Tiến hành đo độ nhiễu N của đường nền từ sắc ký đồ Ước lượng giá trị LOD dựa vào tỉ số tương ứng của tín hiệu so với nhiễu nền S/N (S/N = 3)

e3 Xác định hiệu suất thu hồi

- Mẫu trắng: là mẫu thức ăn chăn nuôi không có kháng sinh nhóm tetracycline Mẫu trắng được chuẩn bị tương tự như mẫu thử (sơ đồ 3.1)

- Mẫu thêm chuẩn: Cân 1,00 ± 0,01 g mẫu trắng,cho vào mỗi mẫu nồng độ như bảng 3.3, tiếp tục thực hiện các bước chuẩn bị mẫu giống sơ đồ 3.1

Bảng 3.3 Cách đưa chuẩn kháng sinh tetracycline vào mẫu thêm chuẩn xác định hiệu

suất thu hồi

Nồng độ thềm vào mẫu

( ppm)

Ký hiệu mẫu Chlortetracycline Ký hiệu mẫu Oxytetracycline C1 0,5 O1 0,5 C2 1 O2 1 C3 5 O3 5

- Xác định hiệu suất thu hồi (R) theo công thức sau:

100

sp C C R

C1 : hàm lượng các tetracyline xác định được theo quy trình phân tích (ppm)

Csp : hàm lượng tetracyline được spike thêm vào mẫu

e4 Tính toán kết quả phân tích mẫu khảo sát

Hàm lượng các kháng sinh có trong mẫu được tính theo công thức sau :

C : hàm lượng thật chất cần phân tích có trong mẫu (ppm)

C0 : hàm lượng chất cần phân tích tính từ đường chuẩn (ppm)

m : khối lượng mẫu đem phân tích (g)

f : Hệ số pha loãng (nếu có)

V : thể tích dịch chiết thu được sau khi làm sạch (ml)

3.3.2.Quy trình phân tích kháng sinh AMO [13], [15]

a Pha hóa chất và thuốc thử

- Dung dịch KH2PO4 0,01M (pH=4,5): cân 1,36 g KH2PO4 khan, định mức trong bình định mức 1000 ml bằng nước cất, dùng máy đo pH để điều chỉnh pH dung dịch KH2PO4 về pH = 4.5 ±0,05 bằng dung dịch H3PO4

- Dung dịch CH3COONH4 0,15 M : cân 11,562 g CH3COONH4 khan, định mức trong bình định mức 1000 ml bằng nước cất

- Dung dịch TCA 20% : cân 20g TCA trong 100ml nước cất

- Dung dịch HCHO 7% : pha loãng từ dung dịch HCHO 36% : theo quy tắc đường chéo, pha 0,972 ml HCHO với 4,028 ml nước cất ( 5ml HCHO)

b Pha dung dịch kháng sinh chuẩn

- Chuẩn gốc 1mg/ml (1000 ppm): cân 10,2 mg amoxicillin trihydrate 98% định mức trong bình định mức 10ml bằng KH2PO4 0,01M (pH= 4,5)

- Chuẩn 10 ppm : lấy 100µl chuẩn 1mg/ml định mức trong bình định mức 10ml bằng KH2PO4 0,01M ( nồng độ sau khi pha loãng: 2 ppm)

- Chuẩn 5 ppm : lấy 5ml chuẩn 10 ppm định mức trong bình định mức 10ml bằng KH2PO4 0,01M ( nồng độ sau khi pha loãng: 1 ppm)

- Chuẩn 1 ppm : lấy 1ml chuẩn 10 ppm định mức trong bình định mức 10ml bằng KH2PO4 0,01M ( nồng độ sau khi pha loãng: 0,2 ppm)

V f m

C

(1)

c Quy trình chuẩn bị mẫu

Sơ đồ 3.2 Quy trình chuẩn bị mẫu được công bố bởi đại học Ghent, Bỉ

Cân 5,00 ± 0,05 g mẫu vào ống ly tâm 1

Thêm 25 ml dung dịch KH2PO4 0,01M, Vortex 1 phút, lắc 30 phút, ly tâm 4000 vòng/ 10 phút

Thu dịch lọc vào ống ly tâm 2Lọc dịch lọc qua phin lọc 0,2 µm

Pha loãng dịch lọc 40 lần ( 500 µl dịch lọc định mức trong bình 20 ml bằng nước cất) Hút 100 µl dịch pha loãng cho vào ống nghiệm thủy tinh A Cho tiếp vào ống A 200 µl TCA 20% và 200 µl HCHO 7% Vortex, tạo dẫn xuất trong bể điều nhiệt ( 100oC, 30 phút) 

Xay mẫu

Làm lạnh bằng nước đá, để nguội Cho 3 ml D.E vào ống, vortex, ly tâm 3 phút (lặp lại 2 lần)

Hòa tan cắn trong 500 µl CH3COONH4 0,15 M Vortex, lọc qua phin lọc 0,45 µm, tiêm vào máy sắc ký 

Gộp dịch chiết, thổi khô bằng khí N2

Hình 3.3 Một số giai đoạn trong quy trình chuẩn bị mẫu phân tích AMO

(a): Lọc mẫu qua đầu lọc 0,2 µm; (b): Làm lạnh mẫu; (c): Thổi khô mẫu

d Tiến hành phân tích trên HPLC

Điều kiện sắc ký :

-Gradient pha động :

Bảng 3.4 Gradient pha động trong phân tích AMO

Thời gian( phút) CH3COONH4 0,15M (%) CH3CN (A) (%)

- Thời gian lưu: dựa vào thời gian lưu của mẫu trắng, mẫu thêm chuẩn, mẫu

chuẩn làm việc và mẫu thử, thời gian lưu của AMO là : 3,911 ± 0,019 phút

Cân bằng cột bằng pha động trong 30 phút trước khi tiêm chuẩn hay mẫu vào

hệ thống sắc ký

Sau khi phân tích rửa cột hơn 30 phút bằng ACN : H2O = 73 : 27

e Đánh giá phân tích

e1 Xây dựng đường chuẩn kháng sinh AMO

Xây dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa diện tích peak thu được của dung dịch chuẩn với nồng độ của từng loại theo quan hệ tuyến tính bậc 1:

y = ax + b Trong đó: y : diện tích peak (hoặc chiều cao của peak)

LOQ = 10 LOD e3 Xác định hiệu suất thu hồi

Cân 5 ± 0,05 g mẫu trắng, cho vào mỗi mẫu nồng độ như bảng 3.5, tiếp tục thực hiện các bước chuẩn bị mẫu giống sơ đồ 3.2

Bảng 3.5 Cách đưa chuẩn AMO vào mẫu thêm chuẩn xác định hiệu suất thu hồi

Ký hiệu mẫu Nồng độ thêm vào mẫu

( ppm) A1 0,2 A2 1 A3 2 Xác định hiệu suất thu hồi (R) theo công thức sau:

100

sp C C R

C1 : nồng độ AMO xác định được theo quy trình phân tích (ppm)

Csp : nồng độ AMO được thêm vào mẫu

e4 Tính toán kết quả phân tích mẫu khảo sát

Hàm lượng các kháng sinh có trong mẫu được tính theo công thức sau :

C : hàm lượng thật chất cần phân tích có trong mẫu (ppm)

C0 : hàm lượng chất cần phân tích tính từ đường chuẩn (ppm)

m : khối lượng mẫu đem phân tích (g)

f : Hệ số pha loãng (nếu có)

V : thể tích dịch chiết thu được sau khi làm sạch (ml)

V f m

C

(1)