KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG KHÁNG SINH HỌ TETRACYCLINE VÀ AMOXICILLINE TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI TRÊN ĐỊA BÀN TP HỒ CHÍ MINH BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG KHÁNG SINH HỌ TETRACYCLINE VÀ AMOXICILLINE TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI TRÊN ĐỊA BÀN TP HỒ CHÍ MINH BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC Họ tên sinh viên : LÂM THỊ THẢO MY Ngành: CƠNG NGHỆ HĨA HỌC Niên khóa : 2006 – 2010 Tháng 09/2010  i    KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG KHÁNG SINH HỌ TETRACYCLINE VÀ AMOXICILLINE TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI TRÊN ĐỊA BÀN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC Tác giả LÂM THỊ THẢO MY Khóa luận đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp kĩ sư ngành Công Nghệ Hóa Học GVHD : Th.S Phùng Võ Cẩm Hồng Th.S Nguyễn Lê Kiều Thư Tháng 09 năm 2010 i    LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành cảm ơn: - Ban giám hiệu trường Đại Học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh tạo điều kiện cho tơi suốt thời gian học tập - Các Thầy Cô mơn Cơng Nghệ Hóa Học bảo, hướng dẫn - Các ThS Phùng Võ Cẩm Hồng, Th.S Nguyễn Lê Kiều Thư trực tiếp hướng dẫn giúp đỡ suốt thời gian thực đề tài tốt nghiệp - Các anh chị Trạm Chẩn đoán- Xét nghiệm Điều trị( Chi Cục Thú Y Tp Hồ Chí Minh) ln tận tình hướng dẫn giúp đỡ tơi - Tồn thể bạn lớp DH06HH hỗ trợ, giúp đỡ động viên suốt thời gian làm đề tài Con thành kính ghi ơn ba mẹ người thân gia đình ln tạo điều kiện động viên suốt trình học tập trường Chân thành cảm ơn Tháng 09 năm 2010 Lâm Thị Thảo My ii    TÓM TẮT Đề tài: “ Khảo sát hàm lượng kháng sinh họ tetracycline amoxicilline thức ăn chăn nuôi địa bàn TP HCM phương pháp HPLC” tiến hành Phịng phân tích dược thuộc Bộ mơn Hóa lý- Trạm Chẩn đốn, xét nghiệm điều trị (Chi Cục Thú Y Tp Hồ Chí Minh), thời gian từ tháng 3/2010 đến tháng 8/2010 Những kết đạt được: • Phân tích hàm lượng kháng sinh họ tetracycline: - Thiết bị sử dụng : hệ thống HPLC- UV VIS bước sóng 355 nm, dùng cột Synergy 4u, C18, 15 cm x 4,6 mm cột Synergy 5u, C18, 15 cm x 4,6 mm - Áp dụng theo quy trình cơng bố Bộ NN & PTNT (2006) - Đường chuẩn dựng nồng độ từ ppm đến 50 ppm - LOD kháng sinh OTC 0,2 ppm, CTC 0,3 ppm - Hiệu suất thu hồi R OTC từ 88,69% đến 100,34%; CTC có hiệu suất thu hồi từ 53,133% đến 101,89% - Tiến hành phân tích 61 mẫu thức ăn chăn ni, kết có 55,74% mẫu thức ăn dương tính với CTC với hàm lượng từ 12,33 ppm đến 538,17 ppm Có 34,43% mẫu vượt qua khỏi giới hạn cho phép, vượt từ 1,16 đến 10,76 lần so với giới hạn tối đa quy định Có 52,46% mẫu dương tính với OTC với hàm lượng từ 8,84 ppm đến 860,71 ppm , 24,59% mẫu vượt qua mức quy định cho phép, vượt từ 1,17 lần đến 17,21 lần so với giới hạn tối đa quy định • Phân tích hàm lượng kháng sinh AMO: - Thiết bị sử dụng: hệ thống HPLC - FL bước sóng Ex: 358 nm, Em: 440 nm, dùng cột Zorbax 5u, C18, 25 cm x 4,6 mm - Áp dụng theo quy trình cơng bố đại học Ghent, Bỉ (2006) - Đường chuẩn dựng nồng độ từ 0,2 ppm đến ppm - LOD kháng sinh AMO 0,1 ppm - Hiệu suất thu hồi R mẫu từ 65,94% đến 129,6% - Tiến hành phân tích 61 mẫu thức ăn chăn ni, kết có 24,59% mẫu thức ăn dương tính với AMO với hàm lượng từ 16,40 ppm đến 368,33 ppm, vượt gấp 16,4 đến 368,33 lần so với khuyến cáo sử dụng EU iii    SUMMARY Topic:“Quantitative investigation of amoxicilline and tetracycline antibiotics in animal feed at HCM City using HPLC" was conducted at Pharmaceutical Analysis Room, The genres of of physiochemistry - Diagnostic Station, Testing and Treatment (Department of Veterinary Ho Chi Minh), from March 2010 to August 2010 The results were achieved: • Quantitative analysis of tetracycline antibiotics: - Equipment: HPLC-UV-VIS system, wavelength: 355 nm, Synergy 4u column, C18, 15 cm x 4,6 mm and Synergy 5U column, C18, 15 cm x 4.6 mm - To apply by Ministry of Agriculture and Rural Development (2006) - The directrix has been from ppm to 50 ppm - LOD of the method: OTC has been 0,2 ppm, CTC has been 0,3 ppm - The performance of recovery: OTC has been from 88,69% to 100,34%; CTC has been from 53,133% to 101,89% - Quantitive analysis of 61 samples, 55,74% samples was positive for CTC with content from 12,33 ppm to 538,17 ppm, 34.43% of the samples overcame beyond the permitted limits from 1.16 to 10.76 times.52,46% samples was positive for OTC with content from 8,84 ppm to 860,71 ppm, 24,59% of the samples overcame beyond the permitted limits from 1,17 to 17,21 times • Quantitative analysis of AMO: - Equipment: HPLC- FL system - Ex: 358 nm, Em: 440 nm, Zorbax 5U column, C18, 25 cm x 4,6 mm - To apply by Ghent University, Belgium (2006) - The directrix has been from 0,2 ppm to ppm - LOD of the method has been 0,1 ppm - The performance of recovery has been from 65,94% to 129,6% - Quantitive analysis of 61 samples, resulting in 24,59% samples was positive for AMO with content from 16,40 ppm to 368,33 ppm, was overcome from 16,4 to 368,33 times when we compared with the recommended use of the EU iv    MỤC LỤC Trang Trang tựa i Cảm tạ ii Tóm tắt iii Summary iv Mục lục v Danh sách chữ viết tắt vii Danh sách hình viii Danh sách bảng ix Danh sách biểu đồ sơ đồ x CHƯƠNG MỞ ĐẦU 1.1.Đặt vấn đề 1.2.Mục đích đề tài 1.3.Nội dung đề tài 1.4.Yêu cầu CHƯƠNG TỔNG QUAN 2.1.Kháng sinh 2.1.1.Giới thiệu chung kháng sinh 2.2.1.1.Khái niệm 2.2.1.2.Sử dụng kháng sinh 2.1.2 Kháng sinh họ tetracycline kháng sinh AMO 2.1.2.1.Kháng sinh họ tetracycline 2.1.2.2.Kháng sinh amoxicilline 2.2.Phương pháp sắc ký 10 2.2.1.Giới thiệu chung phương pháp sắc ký 10 2.2.1.1.Lịch sử phương pháp sắc ký 10 2.2.1.2.Đặc điểm chung phương pháp sắc ký 11 2.2.1.3.Phân loại phương pháp sắc ký 11 2.2.2.Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao HPLC 11 v    2.2.2.1.Giới thiệu phương pháp HPLC 11 2.2.2.2.Ưu nhược điểm phương pháp HPLC 15 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 16 3.1.Thời gian, địa điểm vật liệu nghiên cứu 16 3.1.1 Thời gian thực 16 3.1.2 Địa điểm 16 3.1.3 Vật liệu 16 3.2 Hóa chất- dụng cụ thiết bị 17 3.2.1 Đối với quy trình phân tích hàm lượng kháng sinh họ tetracycline 17 3.2.2 Đối với quy trình phân tích hàm lượng kháng sinh AMO 18 3.3 Phương pháp thí nghiệm 19 3.3.1 Quy trình phân tích kháng sinh họ tetracycline 19 3.3.2 Quy trình phân tích kháng sinh AMO 24 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 4.1.Kết phân tích kháng sinh họ tetracycline 29 4.1.1.Kết xây dựng đường chuẩn kháng sinh họ tetracycline 29 4.1.2.Giới hạn phát (LOD, LOQ) kháng sinh họ tetracycline phương pháp 30 4.1.3.Kết xác định hiệu suất thu hồi phân tích kháng sinh họ tetracycline 31 4.1.4.Kết phân tích hàm lượng kháng sinh họ tetracycline mẫu thử 32 4.2.Kết phân tích kháng sinh AMO 36 4.2.1.Kết xây dựng đường chuẩn kháng sinh AMO 36 4.2.2.Giới hạn phát (LOD, LOQ) kháng sinh AMO phương pháp 37 4.2.3.Kết xác định hiệu suất thu hồi phân tích kháng sinh AMO 37 4.2.4.Kết phân tích hàm lượng kháng sinh AMO mẫu thử 38 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 40 5.1 Kết luận 40 5.2 Đề nghị 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 PHỤ LỤC 45 vi    DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ACN : Acetonitril TCA : Trichloroacetic acid HPLC : High Performance Liquid Chromatography ( sắc ký lỏng hiệu cao) LOD : Limit of Detection (giới hạn phát hiện) S/N : Signal – to - noise ( Tỉ số tương đối tín hiệu so với nhiễu nền) SPE : Solid phase extraction ( Cột chiết pha rắn) FL : Fluorescence ( Huỳnh quang) UV-VIS : Ultra-Violet/Visible ( Quang phổ tử ngoại khả kiến) AMO : Amoxicilline VSATTP : Vệ sinh an toàn thực phẩm TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam CTC : Chlotetracycline hydrochloride OTC : Oxytetracycline hydrochloride EDTA : Etilendiamin tetraacetic acid (Titriplex) Ex : Bước sóng kích thích Em : Bước sóng phát quang NN & PTNT : Nông Nghiệp Phát Triển Nơng Thơn S : Diện tích peak vii    DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Cấu trúc chung kháng sinh họ tetracycline Hình 2.2 Cấu tạo hóa học kháng sinh chlortetracycline oxytetracycline Hình 2.3 Cấu trúc kháng sinh amoxicilline Hình 2.4 Hệ thống HPLC phịng phân tích dược 12 Hình 2.5 Sơ đồ hệ thống HPLC 13 Hình 3.1.Mẫu thức ăn chăn ni sử dụng làm mẫu phân tích 16 Hình 3.2 Một số giai đoạn quy trình chuẩn bị mẫu phân tích CTC OTC 22 Hình 3.3 Một số giai đoạn quy trình chuẩn bị mẫu phân tích AMO 26 Hình 4.1.Đồ thị đường chuẩn điểm kháng sinh OTC với R2 = 0,99980 29 Hình 4.2 Đồ thị đường chuẩn điểm kháng sinh CTC với R2 = 0,99963 30 Hình 4.3 Sắc kí đồ OTC LOD= 0,2 ppm CTC LOD = 0,3 ppm 31 Hình 4.4 Đồ thị đường chuẩn điểm kháng sinh AMO với R2 = 0,99971 36 Hình 4.5 Sắc kí đồ chuẩn AMO nồng độ ppm (thời gian lưu 3,898 phút) 36 Hình 4.6 Sắc kí đồ chuẩn AMO giá trị LOD = 0,1 ppm 37   viii    DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1 Cấu trúc số dẫn chất tiêu biểu họ tetracycline Bảng 2.2 Một số tiêu dược lý kháng sinh họ tetracycline Bảng 2.3 Hàm lượng kháng sinh họ tetracycline tối đa cho phép thức ăn hỗn   hợp cho lợn Bảng 2.4 Hàm lượng kháng sinh họ β-lactam tối đa EU khuyến cáo thức ăn 10 Bảng 3.1 Địa điểm số mẫu khảo sát chương trình “ VSATTP” 17 Bảng 3.2 Gradient pha động phân tích kháng sinh họ tetracycline 22 Bảng 3.3 Cách đưa chuẩn kháng sinh tetracycline vào mẫu thêm chuẩn xác định hiệu suất thu hồi 23 Bảng 3.4 Gradient pha động phân tích AMO 26 Bảng 3.5 Cách đưa chuẩn AMO vào mẫu thêm chuẩn xác định hiệu suất thu hồi 27 Bảng 4.1 Kết xây dựng đường chuẩn điểm kháng sinh oxytetracycline 29 Bảng 4.2 Kết xây dựng đường chuẩn điểm kháng sinh chlortetracycline 30 Bảng 4.3 Kết xác định hiệu suất thu hồi kháng sinh chlortetracycline dựa vào mẫu trắng mẫu thêm chuẩn 31 Bảng 4.4 Kết xác định hiệu suất thu hồi kháng sinh oxytetracycline dựa vào mẫu trắng mẫu thêm chuẩn 31 Bảng 4.5 Bảng kết phân tích kháng sinh CTC theo quận, huyện 32 Bảng 4.6 Bảng kết phân tích kháng sinh OTC theo quận, huyện 32 Bảng 4.7 Kết xây dựng đường chuẩn điểm kháng sinh AMO 36 Bảng 4.8 Kết xác định hiệu suất thu hồi dựa vào mẫu trắng mẫu thêm chuẩn nồng độ 0,2 ppm; ppm; ppm 37 Bảng 4.9 Kết phân tích kháng sinh AMO theo quận, huyện 38 ix    Phụ lục Sắc ký đồ số mẫu thức ăn dương tính với kháng sinh OTC CTC Hình Sắc ký đồ mẫu thức ăn Cargill 1202S ( STT: 50)     Hình Sắc ký đồ mẫu thức ăn Cargill 1600 (STT: 56)     Hình Sắc ký đồ mẫu thức ăn Cargill 1102 (STT: 59)     Hình Sắc ký đồ mẫu thức ăn Master 1040 (STT: 51)     Hình Sắc ký đồ mẫu thức ăn Vạn Sanh 9000 (STT:30)     Hình Sắc ký đồ mẫu thức ăn Hi-gro 151 (STT:25)     Hình Sắc ký đồ mẫu thức ăn Greenfeed 9200 (STT:53)     Phụ lục 10 Sắc ký đồ mẫu trắng phân tích hàm lượng kháng sinh AMO     Phụ lục 11 Sắc ký đồ mẫu thêm chuẩn ppm     Phụ lục 12 Sắc ký đồ mẫu thêm chuẩn ppm     Phụ lục 13 Sắc ký đồ số mẫu thức ăn dương tính với kháng sinh AMO Hình Sắc ký đồ mẫu thức ăn Hi-gro 553(STT:1)     Hình Sắc ký đồ mẫu thức ăn tự trộn (STT: 61)     Hình 10 Sắc ký đồ mẫu thức ăn Cargill 1022 (STT:57)     Hình 11 Sắc ký đồ mẫu thức ăn Greenfeed 9200 (STT: 53)     Hình 12 Sắc ký đồ mẫu thức ăn NewHope 0918 (STT: 13)     ... tetracyline thức ăn chăn nuôi địa bàn TP HCM phương pháp HPLC (đầu dò quang phổ tử ngoại khả kiến) - Khảo sát hàm lượng kháng sinh amoxicilline thức ăn chăn nuôi địa bàn TP HCM phương pháp HPLC (đầu... Thú Y TP HCM), thực đề tài ? ?Khảo sát hàm lượng kháng sinh họ tetracyclin amoxicillin thức ăn chăn ni địa bàn TP Hồ Chí Minh phương pháp HPLC? ?? 1.2.Mục đích - Khảo sát hàm lượng kháng sinh họ tetracyline...KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG KHÁNG SINH HỌ TETRACYCLINE VÀ AMOXICILLINE TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI TRÊN ĐỊA BÀN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC Tác giả LÂM THỊ THẢO MY