Định tính saponin trong dược liệu giảo cổ lam bằng HPLC

ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay trên thế giới, xu hướng tìm kiếm và sử dụng sản phẩm chăm sóc sức khỏe có nguồn gốc từ nhiên ngày càng tăng. Con người có khuynh hướng sử dụng nhiều thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên do hiệu quả điều trị cũng như ít tác dụng phụ hơn thuốc tân dược. Việt Nam chúng ta cũng không nằm ngoài xu hướng đó. Điều kiện tự nhiên ưu đãi cho đất nước ta có hệ sinh thái phong phú và đa dạng, có tiềm năng to lớn về tài nguyên cây thuốc. Đất đai và khí hậu nhiệt đới gió mùa phù hợp với nhiều loài cây trồng, trong đó có nhiều loài cây thuốc quý. Đây chính là tiền đề tốt để ngành Dược phát triển thuốc từ dược liệu. Diếp cá là loài thực vật phổ biến ở Việt Nam. Diếp cá không chỉ được sử dụng làm rau ăn hàng ngày mà còn được sử dụng làm thuốc với nhiều công dụng như: trị mụn nhọt, trĩ, viêm ruột, lở ngứa…6. Các thành phần đã được nghiên cứu xác định trong diếp cá như: flavonoid 24, tinh dầu 15, alkaloid 16 trong đó flavonoid là thành phần chính có nhiều tác dụng: chống viêm, phòng chống ung thư, chống oxy hóa 12…Do đó có thể thấy công dụng điều trị của cao diếp cá do các hợp chất flavonoid. Hiện nay diếp cá được nhiều Công ty dược phẩm trong nước quan tâm nghiên cứu, sản xuất thành các sản phẩm lưu hành trên thị trường như An trĩ vương, Herlaf…với thành phần chính là cao diếp cá. Tiến hành nghiên cứu quy trình chiết xuất sẽ giúp xác định các điều kiện chiết xuất tối ưu nhằm thu được cao diếp cá giàu flavonoid, góp phần đảm bảo chất lượng cao thuốc khi đưa vào sản xuất. Ngoài ra, trước khi đưa vào sản xuất cần phải đánh giá chất lượng cao diếp cá, do đó đó việc xây dựng tiêu chuẩn cao thuốc rất có ý nghĩa trong việc kiểm soát chất lượng nguồn nguyên liệu đầu vào này. Vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu chiết xuất và tiêu chuẩn hóa cao bán thành phẩm Diếp cá” với các mục tiêu sau: Nghiên cứu quy trình chiết xuất cao bán thành phẩm diếp cá giàu flavonoid. Tiêu chuẩn hóa cao bán thành phẩm diếp cá giàu flavonoid.

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ BÍCH NGỌC

ĐỊNH TÍNH SAPONIN TRONG DƯỢC LIỆU GIẢO CỔ LAM BẰNG HPLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ

HÀ NỘI - 2014

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ BÍCH NGỌC

ĐỊNH TÍNH SAPONIN TRONG DƯỢC LIỆU GIẢO CỔ LAM BẰNG HPLC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Khóa luận “Định tính saponin trong dược liệu Giảo cổ lam bằng HPLC”

được tôi hoàn thành tại bộ môn Dược liệu và bộ môn Vật Lý - Hóa Lý trường Đại học Dược Hà Nội với sự làm việc nghiêm túc, nỗ lực hết mình của bản thân

và sự khích lệ từ phía nhà trường, thầy cô, gia đình và bè bạn

Trước hết tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ThS Phạm Tuấn

Anh người thầy đã dành nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn nghiên cứu,

giúp tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn DS Lê Xuân Kỳ, DS Đào Văn Nam đã giúp đỡ,

chỉ bảo, động viên trong quá trình tôi thực hiện khóa luận tại bộ môn Vật Lý- Hóa Lý

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội cũng như các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Dược liệu, bộ môn Vật Lý - Hóa Lý đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Cuối cùng tôi xin tỏ lòng biết ơn gia đình, bạn bè đã động viên tôi về mọi mặt và giúp đỡ tôi tận tình trong quá trình học tập, nghiên cứu, là động lực không nhỏ để tôi có kết quả ngày hôm nay

Xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 05 năm 2014

Sinh viên

Nguyễn Thị Bích Ngọc

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ DƯỢC LIỆU GIẢO CÔ LAM 3

1.1.1 Vị trí phân loại, phân bố của chi Gynostemma Blume 3

1.1.2 Thành phần hóa học của G pentaphyllum 3

1.1.3 Tác dụng dược lý 5

1.1.4 Một số ứng dụng làm thuốc và thực phẩm chức năng 7

1.2 PHƯƠNG PHÁP HPLC VÀ ỨNG DỤNG TRONG PHÂN TÍCH DƯỢC LIỆU ……… 8

1.2.1 Phương pháp HPLC 8

1.2.2 Ứng dụng của HPLC trong phân tích Dược liệu và các hợp chất tự nhiên 10 1.3 PHƯƠNG PHÁP CHIẾT PHA RẮN TRONG THỰC PHẨM VÀ DƯỢC LIỆU 11

1.4 DẤU VÂN TAY TRONG HPLC VÀ XU HƯỚNG ĐỊNH TÍNH DƯỢC LIỆU VÀ CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC 13

1.4.1 Phương pháp dấu vân tay trong HPLC 13

1.4.2 Xu hướng định tính dược liệu và chế phẩm đông dược. 14

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, HÓA CHẤT 16

2.1.1 Nguyên liệu 16

2.1.2 Dụng cụ thiết bị 16

2.1.3 Hóa chất 16

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 17

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.3.1 Xây dựng quy trình chiết xuất và tinh chế saponin toàn phần từ DL 17

2.3.2 Khảo sát điều kiện sắc ký 20

2.3.3 Thẩm định phương pháp 21

2.3.4 Phân tích định tính saponin toàn phần trong Giảo cổ lam bằng HPLC 22

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ 23

3.1 CHIẾT XUẤT - TINH CHẾ SAPONIN TOÀN PHẦN TỪ DL 23

3.1.1 Chiết xuất 23

3.1.2 Tinh chế 23

3.2 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ 25

3.2.1 Khảo sát bước sóng 25

3.2.2 Khảo sát hệ dung môi 25

3.2.3 Khảo sát thể tích bơm mẫu 26

3.2.4 Khảo sát tốc độ dòng 27

3.2.5 Đánh giá chuẩn nội Rb1 28

3.3 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP 29

3.3.1 Tính phù hợp của hệ thống 29

3.3.2 Độ ổn định 30

3.3.3 Độ lặp lại 31

3.4 ĐỊNH TÍNH CÁC MẪU GCL THU HÁI TẠI ĐÀ LẠT 31

3.5 BÀN LUẬN 33

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 38

PHỤ LỤC 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

5 Hình 3.3 Phổ hấp thụ tử ngoại của dung dịch chuẩn

6 Hình 3.4 Sắc ký đồ của các saponin trong GCL (khảo sát

8 Hình 3.6 Sắc ký đồ của 5 mẫu GCL thu hái tại Đà Lạt 32

9 Hình 3.7 Bốn tiểu vùng saponin trong GCL bằng phương

DANH MỤC CÁC BẢNG

2 Bảng 3.2 Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống sắc ký 29

3 Bảng 3.3 Kết quả khảo sát độ ổn định của quy trình phân

tích

30

4 Bảng 3.4 Kết quả khảo sát độ lặp lại của quy trình phân tích 31

5 Bảng 3.5 Khoảng tin cậy (95%) của 5 mầu GCL thu hái tại

Đà Lạt

33

ĐẶT VẤN ĐỀ

Giảo cổ lam là một dược liệu quý, được phát hiện và sử dụng lần đầu ở Nhật Bản với tên gọi cây trường sinh Năm 1997, GS TS Phạm Thanh Kỳ đã phát hiện ra Giảo cổ lam tại Lào Cai – Việt Nam Thành phần hóa học chính của Giảo cổ lam có saponin, flavonoid và các loại đường [2], [5] Các đặc tính dược lý của Giảo cổ lam hầu hết đều thuộc về saponin, thành phần này đã trở thành mục tiêu nghiên cứu của các nhà nghiên cứu dược học tại Trung Quốc [36] GCL được biết đến với rất nhiều tác dụng quý như tác dụng hạ lipid [20], [39], hạ đường huyết [36], ức chế khối u [21], [36], tác dụng tốt trên tim mạch và hệ thần kinh [12], [36]…Do vậy, GCL hỗ trợ tốt trong các trường hợp mỡ máu cao, huyết áp cao, đái tháo đường tuýp II…

Tuy nhiên, nguồn gốc và thành phần hóa học của GCL khá phức tạp Saponin trong GCL khác nhau giữa các loài và vùng trồng, thay đổi theo điều kiện thời tiết khí hậu [18] Hơn nữa, hiện chưa xác định được saponin có tác dụng dược lý đặc trưng do vậy việc kiểm soát chất lượng của dược liệu gặp nhiều khó khăn

Các loại kỹ thuật dấu vân tay - Fingerprint đã dần dần đi vào thực tế bằng việc xây dựng mô hình sắc ký của các thành phần có hoạt tính dược lý và các đặc tính hóa học của thảo dược Phương pháp này góp phần xác thực loài, đánh giá chất lượng và đảm bảo sự thống nhất và ổn định, giúp kiểm soát chất lượng thảo dược và các thuốc có nguồn gốc từ thảo dược Đây là một xu hướng trong định tính dược liệu và các chế phẩm đông dược Nhằm hoàn thiện tiêu chuẩn dược liệu Giảo cổ lam, giúp lựa chọn nguồn nguyên liệu ổn

định và chất lượng, khóa luận “Định tính saponin trong dược liệu Giảo cổ

lam bằng HPLC” đươc thực hiện với 2 mục tiêu sau:

1 Xây dựng quy trình chiết xuất và tinh chế saponin toàn phần từ dược liệu Giảo cổ lam

2 Định tính thành phần saponin của loài Gynostemma pentaphyllum

(Thunb.) Makino bằng phương pháp dấu vân tay - Fingerprint trong HPLC

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ DƯỢC LIỆU GIẢO CÔ LAM

1.1.1 Vị trí phân loại, phân bố của chi Gynostemma Blume

 Vị trí phân loại của chi Gynostemma

Theo [5], [8] chi Gynostemma được xếp vào họ Bầu bí - Cucurbitaceae

Vị trí của chi Gynostemma trong hệ thống phân loại thực vật dược

Các loài của chi Gynostemma phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Á

và Đông Nam Á từ Himalaya tới Nhật Bản, Malaysia và Tân Guinea Tại Trung Quốc có 14 loài (trong đó có 9 loài đặc thù) [19]

Loài G pentaphyllum là loài phổ biến nhất, phân bố ở Ấn Độ, Nepal,

Bangladesh, Srilanca, Lào, Myanma, Hàn Quốc, Nhật Bản và Việt Nam [19]

 Các loài trong chi Gynostemma tại Việt Nam

Tính đến nay đã có 3 loài thuộc chi Gynostemma được công bố ở Việt Nam là G pentaphyllum (Thunb.) Makino và G laxum (Wall.) Cogn [5], [2],

G longipes C.Y Wu in C.Y WU & S.K Chen [28]

1.1.2 Thành phần hóa học của G pentaphyllum

Theo [5], [2] thành phần hóa học của G pentaphyllum có saponin,

flavonoid và các loại đường

- Saponin

Nhiều nghiên cứu đã phát hiện saponin có mặt trong GCL thuộc nhóm dammaran [29] Dammaran là nhóm saponin triterpenic có cấu trúc 4 vòng (triterpenoid tetracyclic) Trong phân tử có 30C và do 6 nhóm hemiterpen ghép lại theo qui tắc đầu đuôi Các saponin thuộc nhóm này xuất hiện nhiều

trong các cây thuộc chi Panax, họ Araliaceae Đặc biệt saponin trong nhân sâm (Panax ginseng) có nhiều tác dụng quí đã được nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu

1 2

3 4

5

6 7

8 9 10

11

12 13

14

15 16

17

18 19

Hình 1.1 Cấu trúc của các Dammaran thuộc nhóm

saponin triterpenoid tetracyclic

Đã có trên 100 saponin trong thành phần Gynostemma pentaphyllum

(Thunb.) Makino được phân lập và nhận dạng cấu trúc, trong đó có 8 saponin

giống như loại protopanaxadiol trong ginsenosid của Panax ginseng C A

Mayer là Rb1 (Gypenosid III) [27], [35], [14], [29], Rc [32], [29], [14], Rb3 (Gypenosid IV), Rd (Gypenosid VIII), F2 [14], [29], [32], Rg3 [33], [29], [14], malonyl-Rb1 và malonyl-Rd [27], [29], [14] Ngoài ra cũng phát hiện Rf

là 1 protopanaxatriol [33]

- Flavonoid

Flavonoid là 1 trong những nhóm chất chính nhưng ít được nghiên cứu

Đã phát hiện 1 số flavonoid chính: ombuin [30], ombuoside, rutin [34], ngoài

ra còn có quercetin-di-(rhamno)-hexosid, quercetin-rhamno-hexosid, kaempferol-rhamno-hexosid và kaempferol-3-O-rutinosid [25]

- Các thành phần khác

+ Các sterol trong G pentaphyllum chiếm 1 lượng nhỏ (khoảng

0.0001%) bao gồm ergostanol, sitosterol và stigmasterol [16]

+ Nhóm alcaloid được báo cáo là không có trong G pentaphyllum [2],

[9]

+ Bằng phương pháp đo phổ phát xạ tia X đã xác định được trong cây có

15 nguyên tố vô cơ: Al, Si, Mg, P, K, Mn, Na, Fe, Ba, Ti, Cu, Cr, Pb, Ag Trong đó, nguyên tố có hàm lượng cao nhất là Si (10%), thấp nhất là Ag (0.0001%) [6]

+ Một số chất khác cũng được tìm thấy là polysaccharid, các vitamin, chất khoáng và các amino acid [29]

1.1.3 Tác dụng dƣợc lý

Các đặc tính dược lý của G pentaphyllum hầu hết đều thuộc về saponin,

thành phần này đã trở thành mục tiêu nghiên cứu của các nhà nghiên cứu dược học tại Trung Quốc [36]

- Tác dụng trên chuyển hóa lipid

Các nghiên cứu về lâm sàng của G pentaphyllum trên chuyển hóa lipid

đã được thực hiện ở nhiều trường đại học, các viện nghiên cứu và các bệnh viện ở Trung Quốc Một thử nghiệm được thực hiện trên 158 bệnh nhân nhiễm lipid máu, với 106 bệnh nhân được dùng gypenosid dạng nước sắc và

52 bệnh nhân dùng dạng viên nén Cả 2 nhóm đều dùng lượng tương đương với 120 mg/ngày trong 2 tháng Lượng lipid trong máu giảm theo thứ tự là 85% và 69% Thử nghiệm khác với gypenosid viên 120 mg/ngày trên 39 bệnh nhân nhiễm lipid máu Trong số 14 bệnh nhân tăng cholesterol, nồng độ

cholesterol trong huyết tương giảm 35%; trong 25 bệnh nhân tăng triglycerid, nồng độ triglycerid huyết tương giảm 35% [39].

G pentaphyllum cũng được thử nghiệm ở dạng viên nang mềm chứa

dịch chiết saponin toàn phần Trên 300 bệnh nhân từ bệnh viện hữu nghị Sino-Japan, đã cho thấy sự giảm rõ rệt lượng cholesterol, triglycerid, fibrinogen và tăng lượng HDL [20]

- Tác dụng trên đường huyết

Dịch chiết gypenosid (100 và 200 mg/kg) dùng qua đường uống trong 2 tháng đã ngăn chặn được bệnh tăng đường huyết ở chuột cống lão hóa và cải thiện được khả năng dung nạp đường ở chuột lão hóa nuôi bằng glucose (2 g/kg) [36]

- Tác dụng trên tim mạch

Nghiên cứu do Circosta và các cộng sự năm 2005 dịch chiết nước của G

pentaphyllum (2,5; 5 và 10 mg/kg tiêm tĩnh mạch) có thể bảo vệ được lợn với

chứng loạn nhịp tim [12]

- Tác dụng trên hệ thần kinh trung ương

Cao G pentaphyllum (450 mg/kg) có tác động ức chế những hoạt động

tự phát của chuột nhắt khi quan sát tác dụng giảm đau của chuột khi đang ở trên tấm kim loại nóng [36]

Với não chuột cống bị tổn thương do thiếu máu gypenosid liều 100 mg/kg hạn chế rõ rệt sự phá hủy AND và ARN [17]

- Tác động trên chức năng miễn dịch

Gypenosid đưa vào dạ dày chuột nhắt liều 300 mg/kg trong 7 ngày gây tăng chức năng thực bào ở đại thực bào, tăng thành phần có hoạt tính trong huyết thanh và giảm lượng kháng thể tiêu huyết Lượng IgG huyết thanh tăng

và tăng thời gian sống sót của chuột được ghép cơ tim [36]

- Tác dụng trên ung thư

Gypenosid toàn phần 50 mg/kg qua dạ dày trong 7 ngày có tác dụng ức chế sarcoma (S180) ở chuột nhắt [18] Khi dùng liều 30 và 300 mg/kg qua dạ dày hoặc 120 mg/kg tiêm phúc mạc theo dõi trong 10 ngày đã cản trở quá trình gây u sarcoma (S180) ở chuột nhắt Gypenosid nồng độ 0,38-0,75% invitro đã trực tiếp gây hại lên các tế bào S180 [36]

G pentaphyllum cũng hỗ trợ cơ thể, giúp cơ thể chống lại và ức chế tế

bào ung thư phổi ở người [21] Gypenosid ức chế sự phát triển dòng tế bào ung thư gan (Hep3B and HA22T) [11]

- Tác dụng trên sự kết tập tiểu cầu

Gypenosid có tác dụng chống huyết khối [83] do gypenosid làm giảm hoạt tính của nhiều yếu tố đông máu và làm tăng tốc độ điện di hồng cầu ở

mẫu máu lấy từ người Một nghiên cứu khác cho thấy G pentaphyllum với

liều 40 mg/kg ức chế quá trình kết tập tiểu cầu ở huyết thanh thỏ bằng cách tăng nồng độ AMP vòng tiểu cầu và làm hạn chế sự phóng thích tiểu cầu [37]

1.1.4 Một số ứng dụng làm thuốc và thực phẩm chức năng

Giảo cổ lam được dùng chủ yếu dưới 2 dạng là trà giảo cổ lam và viên uống giảo cổ lam Các sản phẩm này đều là thực phẩm chức năng, giúp hỗ trợ điều trị bệnh mỡ máu cao, huyết áp cao, tiểu đường tuýp II Ngoài ra sản phẩm còn tăng lưu thông máu, hỗ trợ điều trị đau đầu, hoa mắt, chóng mặt, giúp dễ ngủ, ngủ sâu giấc, tăng khả năng làm việc, giảm căng thẳng, mệt mỏi Các sản phẩm từ GCL được lưu thông rộng rãi trên thị trường như Giảo

cổ lam Tuệ Linh, Giảo cổ lam Thiên Bảo, Giảo cổ lam Ba Tri, Giảo cổ lam Tam Đảo…Các sản phẩm từ GCL cũng xuất hiện trên thị trường Nhật Bản, Trung Quốc và Thái Lan

1.2 PHƯƠNG PHÁP HPLC VÀ ỨNG DỤNG TRONG PHÂN TÍCH DƯỢC LIỆU

1.2.1 Phương pháp HPLC

 Nguyên tắc:

HPLC là 1 kỹ thuật tách trong đó các chất di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng giữa 2 pha tức là liên quan đến ái lực tương đối của các chất này với pha tĩnh

và pha động [1] Pha động đi qua cột sử dụng áp suất cao, kết quả mỗi thành phần trong hỗn hợp ra khỏi cột với thời gian khác nhau và rửa giải được dựa trên độ phân cực Sau khi qua cột, các chất tan tách ra được ghi nhận bằng 1 detector lắp đặt trong hệ thống [7]

Hình 1.2 Sơ đồ máy HPLC [7]

Các nét gạch không liên tục tượng trưng cho các bộ phận tùy chọn không bắt buộc

 Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký

a) Thời gian lưu

Thời gian lưu (tR hay đôi khi còn được ký hiệu là Rt) của 1 chất tan là thời gian từ lúc tiêm mẫu thử đến khi xuất hiện đỉnh của chất tan trên sắc ký

đồ

Thời gian lưu lý tưởng to là thời gian lưu của 1 chất tan không bị giữ lại bởi pha tĩnh Trên thực tế, thời gian lưu lý tưởng là thời gian cần thiết để pha động đi ra khỏi hệ thống tính từ lúc bơm mẫu [7]

Thời gian lưu là thông tin về mặt định tính trên sắc ký đồ của 1 chất tan (giống như giá trị Rf của vết trong sắc ký lớp mỏng) Trong những điều kiện sắc ký nhất định (cột, pha động, nhiệt độ, tốc độ dòng ) thì thời gian lưu là 1 hằng số với 1 chất tan

b) Độ chọn lọc

Độ chọn lọc là một biểu hiện về mức độ tách giữa 2 đỉnh Độ chọn lọc là

tỷ số giữa các thể tích hoặc thời gian lưu của các đỉnh trên sắc ký đồ

VR1, VR2: thể tích lưu của chất tan 1, 2 V0: Thể tích lưu lý tưởng

tR1, tR2: Thời gian lưu của chất tan 1, 2 to: Thời gian lưu lý tưởng k’1, k’2: Hệ số dung lượng của chất tan 1, 2

Để tách riêng 2 chất thường chọn 1,05 ≤ α ≤ 2,0 [7]

c) Độ phân giải

Hệ số phân giải thể hiện mối liên quan giữa hiệu lực của cột và của dung môi trên sắc ký Độ nhọn của đỉnh tùy thuộc vào hiệu lực cột, khoảng cách giữa hai đỉnh tùy thuộc vào hiệu lực dung môi

'

'

1 2

0 1

0 2

0 1

0 2

k

k t t

t t V V

V V

R R R

1.2.2 Ứng dụng của HPLC trong phân tích Dƣợc liệu và các hợp chất tự nhiên

 Vai trò, tầm quan trọng

HPLC là công cụ đáng tin cậy cho việc tách các hỗn hợp phức tạp, cho hiệu quả tách và độ nhạy cao, thường xuyên đổi mới về mức độ thuận tiện, tốc độ phân tích, sự lựa chọn của cột HPLC đang đóng vai trò quan trọng trong nhiều lĩnh vực Với khả năng phân tích nhanh, hiệu quả, áp dụng rộng rãi với nhiều mẫu phức tạp, HPLC đang trở thành công cụ không thể thiếu trong các ngành khoa học và công nghệ

Vai trò:

- Giúp xác thực loài, đánh giá chất lượng và đảm bảo sự thống nhất và ổn định, kiểm soát chất lượng thảo dược và các thuốc có nguồn gốc từ thảo dược [18]

- Cho phép xác định nồng độ chưa biết của 1 chất trong một dung dịch biết trước, phân tích các thành phần có hàm lượng thấp, thậm chí các thành phần dưới dạng vết trong các hỗn hợp phức tạp [7]

 Ứng dụng HPLC trong kiểm nghiệm dƣợc liệu và hợp chất tự nhiên

 Định tính dược liệu và các hợp chất tự nhiên

+ Xác định độ tinh khiết: Khi chất chỉ có 1 đỉnh đối xứng, tách riêng biệt không bị chồng phủ với các đỉnh kế cận thì có khả năng là 1 chất tinh khiết + Định tính

- Phương pháp “dấu vân tay”: Thường áp dụng cho DL có thành phần hóa học chưa được biết rõ dựa trên nguyên tắc so sánh sự phù hợp của các đỉnh, dữ liệu sắc ký của dược liệu hoặc phân đoạn phân tích với mẫu đối chiếu

- Phương pháp định tính với chất đánh dấu và chất chuẩn

Dựa vào thời gian lưu của mẫu thử và mẫu đối chiếu Để khẳng định kết quả có thể khảo sát trên 2 điều kiện thực nghiệm khác nhau hoặc khi hệ thống

có trang bị các detector cung cấp dữ liệu liên quan như phổ IR, UV, MS…Do dược liệu có nhiều thành phần khác nhau nên có thể định tính dựa vào các hoạt chất chính của DL hoặc các chất đánh dấu

 Định lượng dược liệu và các hợp chất tự nhiên

+ Khi không có chất chuẩn: Dựa vào nguyên tắc quy về 100% diện tích pic + Có chất chuẩn:

- Phương pháp chuẩn nội: đưa chất chuẩn nội vào mẫu thử và tiến hành sắc

ký Áp dụng khi không có chất chuẩn đối chiếu do kém bền hoặc quá đắt…

- Phương pháp chuẩn ngoại: là phương pháp phổ biến để định lượng các thành phần trong dược liệu và các hợp chất tự nhiên Nguyên tắc là so sánh trực tiếp chiều cao hoặc diện tích pic của dung dịch thử với dung dịch chuẩn tương ứng có nồng độ đã biết [7]

1.3 PHƯƠNG PHÁP CHIẾT PHA RẮN TRONG THỰC PHẨM VÀ DƯỢC LIỆU

Chiết pha rắn ( SPE ) là một kỹ thuật chiết xuất sử dụng một pha rắn và một pha lỏng để tách một, hoặc một loại chất phân tích từ một dung dịch SPE thường được sử dụng để làm sạch mẫu trước khi sử dụng một phương pháp phân tích sắc ký hoặc 1 phương pháp khác để định lượng chất phân tích trong mẫu

SPE chia thành 4 loại chính như sau:

 Pha đảo

Pha động phân cực hoặc phân cực trung bình Pha tĩnh không phân cực Chất phân tích có độ phân cực trung bình đến không phân cực Sự lưu giữ của

chất phân tích phụ thuộc vào cấu trúc của chất phân tích, chứ không phải là tương tác của các nhóm chức trên chất phân tích với bề mặt chất hấp thụ Pha tĩnh là các silica liên kết với các gốc -alkyl, -aryl như octadecyl, octyl, xyclohexyl, butyl, phenyl…[13], [40]

 Pha thuận

Chất phân tích phân cực, DM pha động có độ phận cực từ trung bình đến không phân cực như hexan, aceton…và pha tĩnh phân cực Sự lưu giữ của một chất phân tích trong pha thuận chủ yếu do sự tương tác giữa các nhóm chức phân cực của chất phân tích và nhóm phân cực trên bề mặt chất hấp thụ, bao gồm liên kết hydro, tương tác л-л, và 1 số tương tác khác

Pha tĩnh: silicagel liên kết với các nhóm cyano, amin hoặc diol… [13], [40]

 Trao đổi ion

Cơ chế chủ yếu dựa vào lực hút tĩnh điện của nhóm chức mang điện tích trong các hợp chất với nhóm mang điện tích được liên kết với bề mặt silica Pha tĩnh là các silica liên kết với các nhóm mang điện tích như – SO3

, -N+(CH3)3 [13], [40]

 Hấp phụ

Chất hấp thụ phổ biến và thường được sử dụng là: Florisil (1 loại Magnesi Silicat), Alumina (Al2O3) Florisil và Alumina thích hợp cho việc làm sạch các dịch chiết thực phẩm chứa chất béo, thuốc trừ sâu…[13], [40] Ngoài ra còn có nhựa hấp phụ lỗ lớn là các polyme ưa nước, bền, có khả năng hấp phụ cao, chi phí tương đối thấp, và dễ dàng tái tạo [31] Nguyên tắc của nhựa hấp phụ dựa trên sự khác biệt về trọng lượng phân tử, mức độ phân cực, hoặc hình dạng phân tử, dẫn đến sự khác biệt ái lực với chất hấp phụ [10] Trong những năm gần đây, nhựa lỗ lớn đã được áp dụng rộng rãi để tách

và làm sạch các thành phần hoạt tính sinh học của các loại thảo dược

Các loại nhựa được sử dụng nhiều hiện nay: D101, DA201, Diaion, chuỗi SIP, X5, AB8, GDX104, LD605, LD601, CAD40, DM130, RA, CHA111, WLD (loại hỗn hợp), H107, NKA9, …[23]

Chúng tôi xin trình bày sâu hơn về nhựa Diaion - loại nhựa được sử dụng trong khóa luận:

- Diaion là tên gọi chung của nhiều nhựa (resin) polyme tổng hợp được điều chế nhờ quá trình đồng trùng hợp giữa styren và divinyl benzen Hoạt động theo cơ chế chủ yếu là phân bố pha đảo dưới tên gọi chung là Diaion

1.4 DẤU VÂN TAY TRONG HPLC VÀ XU HƯỚNG ĐỊNH TÍNH DƯỢC LIỆU VÀ CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC

1.4.1 Phương pháp dấu vân tay trong HPLC

 Định nghĩa: Dấu vân tay sắc ký của thảo dược và các loại thuốc thảo dược

là mô hình sắc ký của các thành phần có hoạt tính dược lý và các đặc tính hóa học trong chiết xuất [24]

 Đặc điểm:

- Phương pháp phổ biến nhất trong nhiều phòng thí nghiệm là HPLC-UV

và HPLC-DAD (70%), HPLC-MS chiếm khoảng 20%, HPLC-ECD

học đặc trưng không tương tự như nhau trong các mẫu khác nhau [18]

- Đánh giá dấu vân tay sẽ dựa trên những điểm tương đồng và / hoặc sự khác biệt của các hình dạng sắc ký, hoặc mức độ tách và phân phối tập trung mỗi thành phần hóa học từ sắc ký thu được giữa các thảo dược

“ dấu vân tay” như mất đi hoặc xuất hiện các đỉnh mới, giảm cường độ các đỉnh chủ yếu…thì mẫu thuốc đã có sự biến đổi thành phần [7]

- Tiêu chuẩn hóa nguyên liệu, kiểm nghiệm bán thành phẩm từ dược liệu… Phương pháp này có thể ứng dụng vào định tính kiểm tra trong

quá trình sản xuất (In Process Control-IPC) hay định tính kiểm tra thành phẩm viên nang OPZEN…[7]

- Hiện nay còn có khái niệm “Dấu vân tay sinh học Bio-Fingerprint” trong nghiên cứu dược liệu Theo khái niệm này, các phân đoạn hay hợp chất chiết tách từ dược liệu chỉ được xem là phù hợp với mẫu đối chiếu tương ứng khi thể hiện các tác dụng tương ứng trên các mô hình sàng lọc, đánh giá sinh học [7]

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, HÓA CHẤT

2.1.1 Nguyên liệu

Dược liệu sau khi thu hái được phơi ở nơi thoáng mát, sấy ở nhiệt độ

600C (tủ sấy Shellab) và bảo quản trong túi nilon kín ở nơi khô ráo, thoáng

mát của loài G pentaphyllum thu hái tại Đà Lạt (5 mẫu)

2.1.2 Dụng cụ thiết bị

- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent Technologies 1200 Series

- Cột sắc ký: StableBond Analaytical ZORBAX SB-C18 4,6 x 250mm, 5µm, AgilenTechnologies - Mỹ

- Tiền cột: SB-C18

- Màng lọc 0,45 µm

- Cân phân tích Precisa XT220A

- Máy chiết siêu âm Qsonica - Mỹ.X

- Tủ sấy SHELLAB

- Sắc ký lớp mỏng sử dụng bản mỏng tráng sẵn Silicagel GF254 của MERCK (Đức)

- Tủ sấy BINDER – Đức

- Máy cất chân không BÜCHi ROTAVAPOR R-200

- Các dụng cụ thủy tinh khác: Bình định mức, pipet, ống nghiệm, ống đong, ống ly tâm, phễu lọc, cốc có mỏ, đũa thủy tinh

Nghiên cứu sử dụng các bộ dụng cụ tại phòng thí nghiệm của bộ môn Dược liệu và bộ môn Vật lý - Hóa lý trường Đại học Dược Hà Nội

2.1.3 Hóa chất

- Dung môi dùng cho quá trình chiết xuất: EtOH, MeOH, nước cất

- Chất chuẩn tinh khiết Rb1 chiết xuất từ Panax ginseng C.A.Mey của

công ty Shanghai TautoBiotech, độ tinh khiết đạt 97%

- Hóa chất tinh khiết dùng cho chạy máy HPLC: Acetonnitril, Methanol, Nước…

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Xây dựng quy trình chiết xuất và tinh chế phân đoạn saponin toàn phần

từ dược liệu Giảo cổ lam

- Khảo sát các điều kiện để định tính saponin trong Giảo cổ lam bằng phương pháp HPLC: Bước sóng, hệ dung môi, tốc độ dòng, thể tích tiêm mẫu

- Thẩm định lại phương pháp vừa xây dựng: Độ phù hợp của hệ thống,

độ lặp lại, độ ổn định

- Từ phương pháp đã xây dựng được, tiến hành định tính saponin trong

một số mẫu Giảo cổ lam của loài G pentaphyllum

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Xây dựng quy trình chiết xuất và tinh chế saponin toàn phần từ dược liệu

a) Chiết xuất

Trịnh Thị Diệp Thanh, khóa luận tốt nghiệp dược sỹ năm 2013 đã tiến hành khảo sát quy trình chiết xuất dược liệu chứa saponin trong GCL với 3 phương pháp: chiết soxhlet, chiết hồi lưu, chiết siêu âm, với mỗi phương pháp

sử dụng 4 dung môi khác nhau là MeOH 4:1, EtOH 50%, 70%, 90%

Khảo sát các phương pháp và dung môi khác nhau nhằm đảm bảo hợp lí

cả hai yêu cầu: chiết được tối đa lượng chất nghiên cứu và tối thiểu tạp chất

để thuận tiện cho quá trình tinh chế và định tính tiếp theo

Kết quả thu được cho thấy chiết siêu âm với EtOH 70% là phương pháp chiết đơn giản, nhanh chóng, dung môi rẻ tiền, an toàn và hàm lượng saponin

thu được gần như tương đương với phương pháp chiết Soxhlet Vì vậy phương pháp này sẽ được lựa chọn sử dụng

Phương pháp chiết siêu âm

- Cân chính xác khoảng 1 g dược liệu đã cắt và nghiền mịn vào một cốc

Chú ý: Luôn đảm bảo nhựa ướt trong quá trình chuẩn bị và sử dụng sau này

- Dịch chiết: chiết siêu âm và chuẩn bị theo quy trình đã trình bày ở trên

(dd A)

- Chuẩn bị cột: Cột thủy tinh có khóa và nút mài, đường kính 2,5cm; chiều dài 25cm; rửa sạch, sấy khô, cố định trên giá theo chiều thẳng đứng, lót một lớp bông thủy tinh ở đáy cột

- Chất nhồi cột: 10 g nhựa Diaion HP-20 đã chuẩn bị ở trên ngâm trong dd

A, khuấy trộn nhẹ nhàng khoảng 1 giờ để đảm bảo sự hấp phụ xảy ra hoàn toàn

- Nhồi cột: Đưa nhựa hấp phụ ngâm trong dd A vào cột từ từ, vừa rót vừa gõ nhẹ để đuổi hết bọt khí

 Lựa chọn dung môi rửa giải

Dựa vào quá trình thực nghiệm, hướng dẫn sử dụng nhựa Diaion HP-20 của nhà sản xuất, kết hợp với các nghiên cứu về sâm Việt Nam theo DĐVN

IV và [26] tiến hành chọn dung môi rửa giải là MeOH

 Khảo sát nồng độ rửa giải

- Ban đầu rửa giải bằng nước cất đến hết màu (khoảng 150ml) để loại các thành phần không hấp thụ được xác định không phải là saponin như 1 số loại đường

- Lần lượt rửa giải với dung môi MeOH ở các nồng độ khác nhau: 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% Chuyển dung môi mới khi đã rửa kiệt saponin bằng dung môi cũ Dịch rửa của mỗi nồng

độ được hứng vào các cốc có mỏ sạch và làm khô đến cắn

- Định tính saponin trong các cắn thu được bằng thí nghiệm tạo bọt và SKLM hệ CHCl3-MeOH-H20 (7:3:0,4)  Căn cứ vào kết quả thu được

để lựa chọn nồng độ rửa giải thích hợp để thu được saponin toàn phần

- Dịch rửa giải được gộp vào cốc có mỏ 500ml Cất quay thu hồi dung môi đến cắn (B)

2.3.2 Khảo sát điều kiện sắc ký

 Tìm bước sóng

Tham khảo tài liệu [3], [15], [29], nhận thấy các saponin trong GCL thích hợp để phát hiện ở bước sóng 203 nm Tiến hành quét phổ, đánh giá bước sóng của dung dịch chuẩn phù hợp với dung dịch thử

 Khảo sát hệ dung môi

Tham khảo 1 số tài liệu nghiên cứu về GCL và nhân sâm (Nhiều saponin

trong GCL giống như loại protopanaxadiol trong ginsenosid của Panax

ginseng, tiến hành lựa chọn 3 hệ sau đây để khảo sát:

 Khảo sát thể tích bơm mẫu

Thể tích bơm mẫu được khảo sát bằng cách tiến hành sắc ký với bước sóng và hệ dung môi đã chọn ở các thể tích bơm mẫu khác nhau (5, 10, 15, 20 µL)