Nghiên cứu định tính và định lượng l tetranhydro palmatin trong dược liệu bình vôi và trong chế phẩm viên hoàn balock viên nang cứng heantos 4 bằng phương pháp HPL

Nghiên cứu định tính và định lượng l tetranhydro palmatin trong dược liệu bình vôi và trong chế phẩm viên hoàn balock viên nang cứng heantos 4 bằng phương pháp HPL Nghiên cứu định tính và định lượng l tetranhydro palmatin trong dược liệu bình vôi và trong chế phẩm viên hoàn balock viên nang cứng heantos 4 bằng phương pháp HPL Nghiên cứu định tính và định lượng l tetranhydro palmatin trong dược liệu bình vôi và trong chế phẩm viên hoàn balock viên nang cứng heantos 4 bằng phương pháp HPL Nghiên cứu định tính và định lượng l tetranhydro palmatin trong dược liệu bình vôi và trong chế phẩm viên hoàn balock viên nang cứng heantos 4 bằng phương pháp HPL Nghiên cứu định tính và định lượng l tetranhydro palmatin trong dược liệu bình vôi và trong chế phẩm viên hoàn balock viên nang cứng heantos 4 bằng phương pháp HPL Nghiên cứu định tính và định lượng l tetranhydro palmatin trong dược liệu bình vôi và trong chế phẩm viên hoàn balock viên nang cứng heantos 4 bằng phương pháp HPL Nghiên cứu định tính và định lượng l tetranhydro palmatin trong dược liệu bình vôi và trong chế phẩm viên hoàn balock viên nang cứng heantos 4 bằng phương pháp HPL Nghiên cứu định tính và định lượng l tetranhydro palmatin trong dược liệu bình vôi và trong chế phẩm viên hoàn balock viên nang cứng heantos 4 bằng phương pháp HPL Nghiên cứu định tính và định lượng l tetranhydro palmatin trong dược liệu bình vôi và trong chế phẩm viên hoàn balock viên nang cứng heantos 4 bằng phương pháp HPL Nghiên cứu định tính và định lượng l tetranhydro palmatin trong dược liệu bình vôi và trong chế phẩm viên hoàn balock viên nang cứng heantos 4 bằng phương pháp HPL

Trang 1

BO GIAO DUC VA DAO TAO BO Y TE

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGHIÊN CỨU ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG

L- TETRAHYDROPALMATIN TRONG DƯỢC LIỆU BÌNH

VƠI VÀ TRONG CHẾ PHẨM VIÊN HỒN BALOK, VIÊN

NANG CỨNG HEANTOS 4 BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ

LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc - Độc chất Mã số : 6007513

Luận văn Thạc sĩ dược học

Người hướng dân khoa học: AB

PGS T3: Grinh Odin Liu GS TS Dham Ghanh Ky

Hà Nội-2004

Trang 2

Dé tii nay dave thu tién tut Ctén Kiém ughiétm — BE tế dưới

sa hung dan aia DGS TE Trinh Odin Lita - phd Otten trudug Olin Ktéim aughiim va GS SS: Pham Shank Ry - Chi nhiém bb min Duve

2w, 22⁄4 Pat hee Duve Ha Hee

Dé hoan think dé tắ nay, toé di nhin dave su chi din tin tink eita PGS TS Trinh Oin Liu va GS TE Pham Thanh Ry

Froug thot gian thuclitn dé tit, tol ciug nuthin Muoe nhiing § kéén ding gop qui bia «ia DGS TS Srin Fi An, QGS Dhum Gia Hut, TS Shiti Dhan Quinh Whi, Th8 Phum Phi Ging eng ete thiy, cé_gtiéo khie Ding thot tol cing (tiêm nhdn duve su quan tim gitip dé uhiél tinh «ia ShS Wguyin Fhi Kim Thanh oa cette ban dong ughtitp tai phong Thude chuin, phong Ping dave eta (1⁄4 Kitm “2/2

“¿2 dị nay, l2? x2 ad ld loug bidl dn chin think dé odt 4a

giuip dé guy bia eta ete thiy cb va_cte ban ding ughtép

Trang 3

MUC LUC

DAT VAN DE

Chuong 1: TONG QUAN

1.1 Dược liệu Bình vơi

1.2; L- tetrahydropalmatin (rotundin)

1.3 Các phương pháp đã được áp dụng để chiết xuất L- tetrahydropalmatin từ củ Bình vơi và các chế phẩm đơng

dược cĩ chứa Bình vơi

1.3.1 Phương pháp chiết nĩng

1.3.1.1 Phương pháp chiết nĩng theo DĐ VN IH

1.3.1.2 Phương pháp chiết của Viện nghiên cứu cây thuốc và cây cĩ tinh dầu Liên Xơ cũ (VILAR)

13.2 Phương pháp chiết lạnh `:

14 Các phương pháp đã dùng để định lượng

L- tetrahydropalmatin đơn chất, trong các chế phẩm và trong được liệu Bình vơi

1.4.1 Phương pháp kết tủa với bạc nitrat

1.4.2: Phuong pháp chuẩn độ mơi trường khan

1.4.3 Phương pháp đo quang phổ tử ngoại khả kiến

1.4.4 Phương pháp đo quang kết hợp với phương pháp SKLM 1.5 Vài nét về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Trang 4

2.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Nghiên cứu phương pháp chiết xuất L- tetrahydropalmatin từ

bột mịn Bình vơi và từ bột mịn Balok

2.3.1.1 Khảo sát phương pháp chiết nĩng theo DDYN III và phương

pháp chiết lạnh bằng lắc siêu âm trên 2 mẫu bột mịn Bình vơi

và bột mịn Balok

2.3.1.2 Đề xuất phương pháp chiết L~- tetrahydropalmmatin từ bột mịn Bình vơi và bột mịn Balok

v2.3.2 Xây dựng phương pháp HPLC để định tính và định lượng

L- tetrahydropalmatin trong dược liệu Bình vơi và trong viên hồn Balok

2.3.2.1 Khảo sát điều kiện sắc ký

23.22 Xây dựng phương pháp định tính và định lượng

L- tetrahydropalmatin trong dược liệu Bình vơi và trong viên hồn Balok

2.3.3 Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả 2.3.3.1 Đánh giá hiệu quả chiết

2.3.3.2 Định tính

2.3.3.3 Định lượng

Chương 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

3.1 Xây dựng phương pháp chiết L- tetrahydropalmatin trong

dược liệu Bình vơi và trong viên hồn Balok -

3.1,1, Khảo sát phương pháp chiết lạnh dùng máy lắc siêu âm: 3.1.2 Khảo sát phương pháp chiết nĩng theo DĐ Việt Nam III 3.1.3, Khảo sát điều kiện chiết thích hợp:

3.1.3.1 Khảo sát thể tích dung mơi chiết xuất

3.1.3.2 Khao sát thời gian chiết xuất

3.1.4 Nhận xét

Trang 5

3.2.1 Khảo sát chọn điều kiện sắc ký để định tính và định lượng

L- tetrahydropalmatin trong dược liệu Bình vơi và trong viên

hồn Balok

3.2.1.1 Khảo sát chọn thành phần pha động

3.2.1.2 Khảo sát chọn pH pha động

3.2.1.3 Khảo sát chọn tốc độ dịng

3.2.1.4 Khảo sát chọn bước sĩng

3.2.2 Xây dựng phương pháp định tính và định lượng L- tetrahydropalmatin trong được liệu Bình vơi và trong viên

hồn Balok

3.2.2.1 Kiểm tra độ tinh khiết của pic L- tetrahydropalmatin thu được từ dịch chiết mẫu thir M; va M,

3.2.2.2 Xây dựng phương pháp định tính L- tetrahydropalmatin 3.2.2.3 Xây dựng phương pháp định lượng L- tetrahydropalmatin 3.2.3 Áp dụng phương pháp HPLC đã xây dựng để định lượng

L- tetrahydropalmatin trong 3 lồi Bình vơi ở Việt Nam và trong viên nang cứng Heamtos 4

3.2.3.1 Định lượng L- tetrahydropalmatin trong 3 lồi Bình vơi ở

Việt Nam

3.2.3.2 Định lượng L- tetrahydropalmatin trong viên nang cứng

Heantos 4

Chuong 4: BAN LUAN VE KET QUA KET LUAN VA DE NGHI

TAI LIEU THAM KHAO

Trang 6

Những chữ viết tắt dùng trong luận van dd DĐ HPLC LOD LOQ PP Pil SKLM SKS TNHH TTKHTN va CN UV UV-VIS vd : Dung dịch : Dược điển

: Sắc ký lỏng hiệu năng cao

: Giới hạn phát hiện : Giới hạn định lượng : Phương pháp : Phân tử lượng : Stephania : Sác ký lớp mỏng : Số kiểm sốt

: Trach nhiém hữu hạn

: Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Cơng nghệ

: Tử ngoại

Trang 7

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

L— tetrahydropalmatin hay con gọi là rotundin (øindarin, hyndarin,

caseanin) là một alcaloid chính được chiết xuất từ củ Bình vơi: Stephania glabra (Roxb.) Miers hoặc một số lồi Bình vơi khác họ Tiết đê (Menispermaceae), mọc hoang khá phổ biến ở nước ta và một số nước khác

Trên thị trường nước ta hiện nay đang lưu hành nhiều dạng thuốc cĩ hoạt

chất L- tetrahydropalmatin với các tên gọi khác nhau như: Xiro Rotunda, viên

nén Rotunda, viên nén Roxen, viên Stilux-60, viên bao phim Sen vơng — R, thuốc tiêm Rotundin sulphat, chè an thần Các chế phẩm trên đều dùng làm thuốc trấn kinh, an thần L- tetrahydropalmatin cĩ tác dụng an thần, gây ngủ

tương tu nhu dan xuất của benzodiazepin, hơn nữa lại khơng gây nghiện nên

L~ tetrahydropalmatin ngày càng được ưa dùng và trở nên thơng dụng

Hàm lượng alcaloid tồn phần cũng như L— tetrahydropalmatin trong

dược liệu Bình vơi thay đổi tuỳ theo lồi và theo thời vụ thu hái, do đĩ cần phải xác định được hàm lượng L~— tetrahydropalmatin cĩ trong các lồi Bình vơi để gĩp phần tìm nguồn nguyên liệu cĩ hàm lượng L tetrahydropalmatin cao, giúp cho cơng việc bảo tồn, nhân giống và tiêu chuẩn hố được liệu này

Bình vơi khơng những được dùng làm nguyên liệu để chiết xuất lấy

L-= tetrahydropalmatin mà hiện nay Bình vơi cịn là một thành phần quan trong

trong nhiều bài thuốc, nhất là trong chế phẩm hỗ trợ cắt cơn nghiện ma tuý và

phục hồi thể lực như: chế phẩm Balok được Cơng ty TNHH đơng nam dược

Bảo Long nghiên cứu và bào chế dưới dạng viên hồn; chế phẩm Heantos 4 đã được Viện Hố học thuộc TTKHTN và CN Quốc gia bào chế dưới dạng viên nang cứng Vì vậy, việc xác định chính xác hàm lượng L- tetrahydropalmatin

Trang 8

2

Việc định lượng L- tetrahydropalmatin trong dược liệu Bình vơi và trong các chế phẩm cĩ chứa Bình vơi, theo các tài liệu mà chúng tơi đã tham

khảo, hầu như các tác giả đều dùng pp đo quang kết hợp với pp sắc ký lớp

mong (SKLM)

Cho đến nay, chưa thấy tài liệu nào cơng bố cu thé việc định lượng bang pp sac ky long hiéu nang cao (HPLC)

Mặt khác hiện nay ở Viện Kiểm nghiệm Trung ương cũng như nhiều cơ sở sản xuất thuốc, nhiều Trung tâm Kiểm nghiệm Dược phẩm — Mỹ phẩm ở

các tỉnh và thành phố, đã được trang bị máy HPLC Do vậy, xuất phát từ nhu

cầu thực tế, chúng tơi tiến hành đề tài;

“Nghiên cứu định tính và định lượng L- tetrahydropalmafin trong

được liệu Bình vơi và trong chế phẩm viên hồn Balok, viên nang cứng Heantos 4 bang phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao”

* Mục tiêu của đề tài:

Xây dựng pp HPLC để định tính và định lượng L— tetrahydropalmatin trong Bình vơi và trong các chế phẩm đủ tin cậy nhằm gĩp phần vào cơng tác

tiêu chuẩn hố chất lượng dược liệu Bình vơi cũng như chế phẩm Balok và

Heantos 4

* Nội dung nghiên cứu:

I- Khảo sát chọn pp chiết thích hợp để chiết kiệt L- tetrahydropalmatin

từ được liệu Bình vơi, từ chế phẩm Balok và Heantos 4

2- Xây dựng pp HPLC để định tính và định lượng L tetrahydropalmatin

trong các dịch chiết từ các mẫu nghiên cứu

3- Áp dụng pp HPLC đã xây dựng để định lượng L_ tetrahydropalmatin

trong ba lồi Bình vơi ở Việt Nam và trong chế phẩm viên hồn Balok, viên

Trang 9

3

Chuong 1: TONG QUAN

1.1 Được liệu Bình vơi

Bình vơi (Ngải tượng, Củ một, Dây mối trịn, Củ gà ấp; Cà tịm, .) là phần gốc thân phình ra thành củ, đã cạo bỏ vỏ nâu đen ở ngồi hoặc thái thành miếng phơi hay sấy khơ của cây Bình vơi: Stephania glabra (Roxb.) Miers

hoặc một số lồi Bình vơi khác cĩ chtta L- tetrahydropalmatin (rotundin), ho Tiét dé (Menispermaceae) [7] Cay Bình vơi là loại dây leo mọc hoang từ lâu

đời, trên các vùng địa chất khác nhau, thường tập trung ở các vùng núi đá vơi,

núi đất ven biển ở cả ba miền Bắc, Trung, Nam nước ta [11], [23], [25] [27] - Miền Bác: Lào Cai, Yên Bái, Sơn La, Tuyên Quang, Cao Bằng, Lang

Sơn, Thái Nguyên, Vĩnh Phúc, Hồ Bình, Quảng Ninh, Nam Hà, Ninh Bình

- Miền Trung: Thanh Hố, Nghệ An, Quảng Nam, Đà Năng, Thừa

Thiên Huế, Bình Định, Lâm Đồng, Đắc Lắc, Ninh Thuận, Phú Yên

- Miền Nam: An Giang, Đồng Nai, Sơng Bé, Bà Ria-Vũng Tầu

Củ Bình vơi rất đa dạng về hình dáng, kích thước, trọng lượng và màu

sắc bên trong củ Lớp vỏ ngồi cĩ màu nâu đen, hình đáng củ thay đổi tuỳ

theo nơi củ phát triển, cĩ củ rất to nặng tới 40kg, nếu mọc ở đất thì củ nhỏ hơn [5] [5] [25] Trong củ Bình vơi cĩ các aÌcaloid mà thành phân chính là

L— tetrahydropalmatin chiếm tỷ lệ dao động từ 0,2—3,55% [3], [4], [25] Hàm lượng alealoid tồn phần cũng như của L— tetrahydropalmatin trong củ

Bình vơi khơng phụ thuộc vào màu sắc, khối lượng và hình dáng của củ mà

phụ thuộc vào lồi, nơi mọc và tuổi củ khi khai thác Theo ý kiến của một số

tác giả, để Bình vơi cĩ hàm lượng L- tetrahydropalmatin cao, nên bắt đầu thu

hái vào mùa thu sang mùa đơng, khơng nên thu hái vào mùa hè [3] [4], [25] Theo Bài Thị Bằng và cộng sự [3], hàm lượng rotundin đạt tới 3,55% ở

Trang 10

4

lồi S, hainanensis H S J et Y TSoong (Thanh Hod), 0,62%- 0 loai

S cambodiana Gagnep (Lam Péng); 0,29%-6 loai S cepharantha (Hd Son:

Bình cđ); 0,21% ở lồi S peirrel Diels (Tây Nguyên)

Nguyễn Tiến Vững và cộng sự đã xác định hàm lượng L- tetrahydropalmatin trong loai S, kuinanensis H S Lo et M Yang thu hai ở

Lang Son dat 3,06%; loai S glabra (Roxb.) Miers thu hai 6 Ninh Binh 1a

0,59% [27]

Ngồi ra, trong củ Bình vơi cịn cĩ các alcaloid khác như: roemerin,

stepharin, cepharamin, cepharanthin, cycleanin, isocorydin, palmatin [4], [18], [25], [27]

Ngồi các alcaloid, trong củ Bình vơi cịn cĩ tinh bột, đường khử va acid

hữu cơ [4], [8], [18] DĐ Việt Nam II quy định củ Bình vơi được dùng làm thuốc phải cĩ hầm lượng alcaloid tồn phần ít nhất là 25 tính theo dược liệu

khơ [7]

Củ Bình vơi cĩ thể thu hái quanh năm, đem về cạo bỏ vỏ nâu đen, thái lát mỏng phơi hay sấy khơ làm thuốc thang sắc uống hoặc tán bột, ngâm rượu

hoặc làm chè thuốc, mà khơng phải chế biến gì khác Bình vơi chủ yếu được

dùng làm nguyên liệu chiết xuất lấy rotundin hoặc cepharanthin, tuỳ theo lồi

[4], cũng cĩ thể từ củ tươi được xử lý, rửa sạch, xay hoặc giã nhỏ để chiết

rotundin hoặc các alcaloid khác [4] [5] [1S]

Bình vơi cĩ vị đắng hơi ngọt, tính mát vào hai kinh can, tỳ; cĩ tác dụng

an thần, dưỡng huyết, thanh nhiệt, giải độc, giảm đau, tán ứ, hành huyết, hố đàm, tán kết, khu phong hoạt lạc [Š], [7]: dùng để chữa mất ngủ, sốt nĩng,

nhức đầu, đau dạ dày (rhể nhzệr), ho nhiều đờm, hen suyễn khĩ thở hoặc phối

hợp với các thuốc khác để trị ho, sốt rét, kiết ly, ngồi da ngứa lở, mụn nhọt

[5], [7], [8], [9], [18], [25]

Trang 11

5

Trong củ Bình vơi, thành phần hố học được quan tâm nhất là alcaloid,

mà trong đĩ L- tetrahydropalmatin là một trong những hoạt chất được nghiên cứu nhiều hơn cả [10], [11], [23], [29], [36], [37], [39], [40]

Cong thtfc hoa hoc cua L- tetrahydropalmatin (C,,H,,;NO, ; Ptl: 355,43)

[4], [7], [25], [39], [40]

OCH3

L- tetrahydropalmatin la 5, 8, 13, 13a- tetrahydro-2, 3, 9, 10- tetramethoxy-6H-dibenzo [a, g] quinolizine

L_ tetrahydropalmatin cĩ cấu trúc nhân isoquinolin, thuéc phân nhĩm

Tetrahydroprotoberberin Nitơ trong phân tử thuộc cấu trúc khung của nhân, cơng thức phân tử cĩ oxy và theo quy luật chung của hợp chất alcaloid, nĩ là

chất rắn ở nhiệt độ thường, cĩ thể kết tinh được và cĩ điểm chảy rõ ràng [4] Tuy nhiên, trong cấu tạo phân tử của L— tctrahydropalmatin cĩ liên kết đơi

liên hợp và các nhĩm metoxy gắn vào nhân thơm và hợp chất nitơ bậc ba nên

dễ bị oxy hố, quang hố và biến đổi bởi các yếu tố như; nhiệt độ, độ ẩm, ánh

sáng

Từ lâu, DĐ Trung Quốc đã cĩ chuyên luận rotundin base, thuốc tiêm rotundin sulphat, viên nén rotundin Rotundin ở dang tinh thể mầu trắng hay

hơi vàng, khơng mùi, khơng vị Nĩ trở nên vàng khi tiếp xúc với ánh sáng và

nhiệt độ Tan trong cloroform, ít tan trong ethanol hay ether, khơng tan trong

nước, tan hồn tồn trong acid sulphuric lỗng [36], [37]

Trang 12

6

- GĨC quay Cực riéng: tir -290° dén -300° tinh theo chat khan, xac dinh

trén dd ché pham 8mg/ml trong ethanol 95° va do & nhiét dé 25°C

- Độ hấp thụ ánh sáng: Đo độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch (đđ) chứa

30ug rotundin trong Iml dd acid sulphuric 0,5%, ở bước sĩng 281nm, giá trị

A (1%, lcm) phai tir 150 dén 160

DĐ Trung Quốc quy định rotundin cĩ độ ẩm khơng được quá 5,0% và

hàm lượng khơng được thấp hơn 98,0% C,,H.,.NO, tính theo chế phẩm khan

Rotundin là một base yếu, nên nĩ dễ đàng liên kết với một acid, để tạo

thành dẫn chất muối acid tương ứng, dễ tan trong nước hơn Rotundin base

thường kém bền vững trong mơi trường kiềm, ở dạng muối và mơi trường acid chúng bên vững hơn [4]

Rotundin tác dụng với acid hydrocloric tạo thành muối rotundin hydroclorid [4] Rotundin hydroclorid va chế phẩm viền nén của nĩ đã được

đưa vào DĐ Trung Quốc năm 2000 Rotundin hydroclorid (C;¡H;;NO,.HCI; Ptl = 391,89) ở dạng tỉnh thể mầu trắng hay hơi vàng, khơng mùi, vị hơi đắng,

dễ chuyển thành màu vàng khi tiếp xúc với ánh sáng hay nhiệt độ; tan trong cloroform, methanol hay nước nĩng, ít tan trong nước, hơi tan trong cồn tuyệt

đối, thực tế khơng tan trong ether hay aceton [37] - Điểm chảy: 196°C

- Gĩc quay cực riêng: -232° tính theo chất khan, xác định trên dd chế

phẩm 10mg trong 1ml nước và đo ở nhiệt độ 25°C

- Độ hấp thụ ánh sáng: Đo độ hấp thụ ánh sáng của dd chứa 30ug

rotundin hydroclorid trong Iml dd acid hydrocloric 0,01M, ở bước sĩng

28lnm Gid tri A (1%, Iem) phải từ 135 đến 146

DĐ Trung Quốc quy định rotundin hydroclorid cĩ độ ẩm khơng được quá

6,0% và hàm lượng khơng được thấp hơn 98,5% C;/H;.NO,.HCI tính theo chế

Trang 13

7

Rotundin hoa tan trong nước cĩ chứa một lượng acid sulphuric lỗng tạo

thành rotundin sulphat [(C;;H;;NO,);.H;SO,] DĐ Trung Quốc dùng dd này

làm thuốc tiêm [36] [37]

Bộ mơn Dược học Quân sự —- Học viện Quân Y điều chế ra nguyên liệu rotundin sulphat (C,,H,,NO,.H,SO,); Ptl = 453,51 ở dạng tỉnh thể màu trắng hay hơi ánh vàng, khơng mùi, vị hơi đắng chát, rất đễ tan trong nước, tan trong

methanol, ít tan trong cồn cao độ, khơng tan trong ether, cloroform [13]

- Điểm chảy: 217°C - 220°C

- Gĩc quay cực riêng: từ - 225° đến - 230° tính theo chất khan, xác định

trên dd chế phẩm 1,0% trong nước và đo ở nhiệt độ 25°C

- Độ hấp thụ ánh sáng: Đo độ hấp thụ ánh sáng của dd chứa 30kg

rotundin sulphat trong Iml nước, ở bước sĩng 28l[nm Giá trị A (1%, lem)

khoảng 121

Tiêu chuẩn cơ sở quy định rotundin sulphat cĩ độ ẩm khơng được quá

5,0% và hàm lượng khơng được thấp hơn 98,0% C.,H;;NO,.H,SO, tính theo

chế phẩm khan [13]

*® Cơng dụng, dạng dùng: lotundin là một alcaloid rất ít độc: Theo Đỗ >: Tất Lợi [I8], rotundin được dùng làm thuốc trấn kinh, an thần trong các trường hợp mất ngủ, trạng thái căng thẳng thần kinh, một số trường hợp rối

loạn tâm thần chức năng, sốt, nĩng, nhức đầu, đau tim, đau dạ dày, hen Ngày dùng 0,05g - 0,10g dưới dạng thuốc bột, thuốc viên Cĩ thể chế thành dạng tiêm 0,05g rotundin hydroclorid hay sulphat trong ống 5ml Trẻ em từ 1 đến Š tuổi uống với liều từ 0,02g - 0,025g; trẻ em từ 5 đến 10 tuổi uống với liều từ

0,03g - 0,05g Hiện nay Xí nghiệp được phẩm Trung ương | san xuất thuốc tiêm Rotundin sulphat 60mg/2ml

1.3 Các phương pháp đã được áp dụng để chiết xuất L- tetrahydropalmatin từ củ Bình vơi và các chế phẩm đơng dược cĩ

Trang 14

8

Để định lượng được chính xác hàm lượng alcaloid tồn phần cũng như rotundin trong củ Bình vơi và các chế phẩm đơng dược cĩ chứa Bình vơi, điều

quan trọng nhất là phải chọn được pp chiết thích hợp để chiết kiệt được

alcaloid và dịch chiết thu được phải tương đối sạch để khơng làm sai lệch kết

quả phân tích Muốn vậy cần phải cĩ pp xử lý mau và tỉnh chế dịch chiết thích hợp

* Việc xử lý mẫu trước khi chiết thường qua các giai đoạn sau; - Nghiền nhỏ dược liệu để tăng diện tích tiếp xúc với dung mơi

- Loại tạp chất trước khi chiết Ví dụ như loại chất béo bằng ether đầu

hố, loại màu bằng than hoạt [2]

* Việc chiết xuất alcaloid dựa vào tính chất chung sau: alcaloid nĩi chung là

những base yếu, thường tồn tại trong cây dưới đạng muối của acid hữu cơ hoặc vơ cơ, đơi khi ở dạng kết hợp với tanin, nên phải tán nhỏ dược liệu để dễ thấm với dịch chiết và giải phĩng alcaloid ra khỏi muối của nĩ bằng kiểm Hầu hết các alcalotd base khơng tan trong nước, nhưng lai dé tan trong cdc

dung mơi hữu cơ ít phân cực như ether, cloroform, hydrocarbon thơm Trái lại, các muối alcaloid thường tan trong nước, cồn và khơng tan trong các dung

mơi hữu cơ ít phân cực [4]

È Để tinh chế và lầm sạch dịch chiết cĩ một vat pp hay ding [4], {6}

- Dựa vào độ tan trong các dung mơi khác nhau của hoạt chất cần chiết

và tạp chất từ đĩ lựa chọn, thay đổi dung mơi, mơi trường chiết thích hợp để

hồ tan tốt được chất cần phân tích, đồng thời cĩ thể loại bỏ được các tạp chất

- Dùng sắc ký cột hay SKLM điều chế để tách riêng từng alcaloid ra khỏi hơn hợp

Ngồi ra cịn dùng pp trao đổi ion và pp chiết pha rắn [2]

Để xác định hàm lượng alcaloid tồn phần hay L— tetrahydropalmatin

trong củ Bình vơi và các chế phẩm đơng dược cĩ chứa Bình vơi, các tác giả

Trang 15

9

Việc chiết alcaloid tồn phần, L= tctrahydropalmatin trong những tại liệu mà chúng tịi đã tham khảo được cĩ thể phân thành 2 cách chính: pp chiết lạnh và pp chiết nĩng, trong đĩ hầu hết các tác giả đều dùng pp chiết nĩng

trong dung cu Soxhlet

1.3.1 Phuong phap chiét nong

1.3.11 Phuong pháp chiét nong theo DD VN II J7}

Can chính xác khoảng 10g bét duoc liéu Tham 4m bang dd amoniac 6N trong 2 giờ Sau đĩ cho vào bình Soxhlet, chiết bằng eloroform cho đến hết

alcaloid Cất thu hồi cloroform, hồ tan cắn trong dd acid hydrocloric 5% (5 —

7 lần, mỗi lần 5ml) Rửa dịch chiết acid bằng ether dầu hoả (3 lần, mỗi lần 10ml), kiềm hố bằng amoniac 6N đến pH I0 - II Chiết bang cloroform 5 lần, mỗi lần 10ml để lấy hết alcaloid Tập trung dịch chiết, rửa bằng nước cất đến pH trung tính Bốc hơi dịch chiết tới khơ Định lượng alcaloid tồn phần

bằng pp chuẩn độ acid - base

1.3.1.2 Phương pháp chiết của Viện nghiên cứu cây thuốc và cây cĩ tỉnh dâu

Liên xơ cũ (VILAR) [3], [15]

Cân chính xác 5,00g dược liệu Thấm ẩm bằng dd amoniac 6N trong 24 giờ sau đĩ cho vào túi giấy lọc, đặt vào bình Soxhlet chiết nĩng bằng cloroform téi kiét alcaloid (kiểm tra bằng thuốc thử DrugendorfŸ Cất thu hồi cloroform thu được cắn alcaloid, hồ tan cắn trong cồn tuyệt đối Sau đĩ tách riêng các alcaloid băng pp sắc ký lớp mỏng Rồi định lượng rotundin bằng pp

đo quang phổ tử ngoại

1.3.2 Phương pháp chiết lạnh

Một số tác giả [24| đã đưa ra pp chiết lạnh như sau: Lấy một lượng bột

mịn chế phẩm đơng dược cĩ chứa củ Bình vơi trộn đều với nhơm oxyd trung

tính với tỷ lệ 1:5, chuyển vào bình nĩn nút mài, thấm ẩm lượng bột trên bằng

amoniac đậm đặc (TT), đậy kín và để yên trong 2 giờ Chiết với cloroform 4

Trang 16

10

cách thủy tới gần cạn rồi để bay hơi tự nhiên thu được cắn Hồ tan cắn trong

dd acid hydrocloric 0,1N (TT) Lọc, kiềm hố dịch lọc bang dd amoniac 10% đến pH khoảng 9, chuyển vào bình gạn Chiết 4 lần bằng cloroform (TT) Gop

các dịch chiết cloroform, cơ trên cách thuỷ tới gần cạn rồi để bay hơi tự nhiên

thu được cắn Hồ tan cắn trong Iml ethanol tuyệt đối Dùng SKLM điều chế

với hệ dung mơi thích hợp để tách riêng rotundin ra khỏi hỗn hợp các alcaloid

Cạo lấy vết rotundin rồi phản hấp phụ bằng cloroform Bốc hơi dung mơi thu được cắn Hồ fan cắn írong mefthanol thu được dd thử Tiến hành chạy HPLC để xác định sự cĩ mặt của rotundin trong hỗn hợp nhiều dược liệu

1.4 Các phương pháp đã dùng để định lượng L- tetrahydropalmatin đơn chất, trong các chế phẩm và trong dược liệu Bình vơi

1.4.1 Phương pháp kết tua voi bac nitrat /36 }, 37}

Cách tiến hành: Trong một bình định mức dung tích 50ml, hồ tan một

lượng chế phẩm chứa khoảng Ø,3g rotundin (mầu cân chính xác) trong 2ml

acid acetic, thêm 15ml nước cất, đun nĩng nhẹ cho tan hết, trộn đều Thêm chính xác 25,0ml dd kali iodid 1,7%, pha lỗng với nước cất đến vạch, trộn

đều Lọc qua giấy lọc khơ, bỏ dịch lọc đầu Lấy chính xác 25,0ml dịch lọc thêm 3 - 5 giọt chi thi natri eosin, chuan do bang dd AgNO, 0,05M_ cho đến

khi xuất hiện tủa mâu hồng đơng von lại Song song tiến hành chuẩn độ một

mẫu trắng

Iml dd AgNO; 0.05M tương ứng với I7,77mg C.,H;;NO,

Phương pháp này được DĐ Trung Quốc năm 2000 áp dụng để định lượng

rotundin nguyên liệu Một số cơ sở sản xuất trước đây cũng dùng để định

lượng rotundin trong các chế phẩm

1.4.2 Phương pháp chuún độ mơi trường khan /37J

Chuẩn độ mơi trường khan là pp chuẩn độ các acid và base yếu hoặc

Trang 17

11

một base yếu, nên DĐ Trung Quốc năm 2000 đã áp dung pp nay dé dinh

lượng rotundin hydroclorid nguyên liệu

Cách tiến hành: Cân chính xác khoảng 0,35g chế phẩm, thêm 25ml acid acetic khan, 2ml anhydrid acetic va 5ml dd thuỷ ngân (II) acetat, lắc cho

tan hết, thêm I giọt dd tim tinh thể làm chỉ thị và chuẩn độ bằng dd acid

percloric 0,1M cho đến khi dd chuyển sang mầu xanh lục Song song tiến

hành chuẩn độ một mẫu trắng

Iml dd acid percloric 0,1M tương đương với 39,19mg C;,H;,NO;.HCI 1.4.3 Phương pháp ảo quang phổ tử ngoại khả kiến /1 }, f6 j, [14], /36 j, /37 }

Phương pháp này dựa trên định luat Lambert — Beer: D6 hap thu (D) cua dd một chất ở một bước sĩng xác định tỷ lệ thuận với nồng độ (C) và bề đày (I) của lớp dd đem đo Sự phụ thuộc này được biểu thị bằng phương trình:

D=k.l1.C (1)

Trong dé: k 1a hé so hap thu

C là nồng đệ của dd chất khảo sát

I là bề day cua lớp dd đem do

Nếu C tính theo nồng độ phần trăm kl/tt, l tính bằng cm, thì hệ số hấp thụ k được gọi là độ hấp thụ riêng của một chất tan, ký hiệu là A (1%, lcm) Nĩ

cĩ thể được coi là độ hấp thụ của dd chất tan ở nồng độ 1% (Kl/tt) hay 10g/1 trong một cốc cĩ chiều dày lcm và do ở một bước sĩng xác định Khi đĩ:

D=^A (1%, lcm): C (2)

Trị số A (1%, Icm) ở một bước sĩng riêng, trong một dung mơi xác định

là một đặc tính của chất đĩ Như vậy, từ giá trị A (1%, 1cm) đã biết, với giá trị

(D) đo được ta cĩ thể tính được nồng độ (C) của dd cần định lượng

D

4

Trang 18

12

Cách tiến hành: Hồ tan một lượng chế phẩm chứa rotundin với nồng độ

khoảng 0,003% trong dd acid sulphuric 0,5% Rồi đo độ hấp thụ của dd thu

được ở bước sĩng À = 28lnm, mẫu trắng là dd acid sulphuric 0,5% Tính hàm lượng rotundin trong chế phẩm theo trị số A (1%, lcm) ở bước sĩng cực đại

X„„=281nm là 155 [10] [H1] [36] [371

DĐ Trung Quốc áp dụng pp này để định lượng rotundin trong các chế

phẩm viên nén và thuốc tiêm

1.4.4 Phương pháp đo quang kết hợp với pp sắc ký lớp mỏng /3jÿ, [15], [16]

* Nguyên tắc: Dựa trên nguyên tắc của pp đo quang phổ tử ngoại - khả

kiến và kỹ thuật SKLM

Theo pp của Viện nghiên cứu cây thuốc và cây cĩ tinh dau Liên xơ cũ:

Chuyển hồn tồn alcaloid từ đạng muối trong dược liệu sang dang base bang

cách thấm ẩm dược liệu đã tấn nhỏ băng dd NH,OH 6N trong 24 giờ Sau dé cho vào túi làm bằng giấy lọc, chiết alcaloid trong bình Soxhlet bằng dung

moi hitu co (cloroform) cho téi kiệt alcaloid (kim tra bằng thuốc thử

Dragendorƒf) Cất thu hồi dung mơi, thu được căn là alcaloid đạng base, hồ

tan cắn trong cồn tuyệt đối

Tiến hành tach rotundin ra khỏi các alcaloid khác bằng pp SKLM với hệ

dung mơi thích hợp Triển khai trên càng một bản mỏng dd chuẩn rotundin và dd thử Phun thuốc thử hiện màu hay soi đưới ánh sáng đèn tử ngoại ở bước sĩng 254nm để xác định vết rotundin trong dd thử tương ứng với vết rotundin của dd chuẩn Xác định hàm lượng rotundin theo một trong 2 cách:

® Phương pháp đo quang phổ UV-VIS sử dụng chương trình máy tinh Adobe photoshop: Sau khi phụn hiện mau alcaloid bang thuốc thử

Dragendorff, thu được cấc vết gọn, đồng đều về màu sáe và tách rời nhau

Trong đĩ đồng đều về màu sắc là rất quan trọng, vì nĩ sẽ ảnh hưởng đến quan

hệ mật độ vết và diện tích vết Đưa bản mỏng lẽn máy quét ảnh với chế độ

Trang 19

13

bằng máy để xác định diện tích vết Dựa vào đồ thị tương quan giữa điện tích

vết và nồng độ của dd rotundin chuẩn, suy ra nồng độ rotundin trong dd thử

Từ đĩ tính được hàm lượng rotundm cĩ trong được liệu [16]

¢ Cao lấy vết chứa rotundin ở cả dd thử và dd chuẩn để riêng ra hai cốc Dùng cồn tuyệt đối để phản hấp phụ alcaloid Lọc, bỏ dịch lọc đầu Do d6 hap

thụ của dịch lọc thu được ở bước sĩng À = 282nm

Dựa vào đồ thị tương quan giữa độ hấp thụ (D) và nơng độ (C) của

rotundin suy ra nồng độ rotundin trong dd thử Từ đĩ tính được hàm lượng

rotundin cĩ trong dược liệu [3] [15]

* Nhận vét: Phương pháp đo quang kết hợp với SKULM yêu cầu lượng

mẫu thử khá lớn (5g củ Bình vơi), do đĩ lượng chế phẩm cĩ chứa củ Bình vơi tương ứng sẽ rất lớn Việc áp dụng pp này để định lượng

L- tetrahydropalmatin trong dược liệu Bình vơi và trong các chế phẩm chứa

Bình vơi sẽ khơng tránh khỏi sai số nhất định, vì yẽu cầu cao về độ đồng đều về màu sắc khi phun thuốc thử hiện màu Hơn nữa, trong Bình vơi cĩ nhiều

alcaloid khác, cĩ cấu trúc hố học và tính chất quang học tương tự rotundin như: roemerin, stepharin, cepharanthin, palmatin và trong thành phần của

các chế phẩm cịn cĩ nhiều được liệu khác và tá dược cũng phần nào gây ảnh

hưởng đến kết quả

1.5 Vài nét về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [6], [1L4], [19], [20], [21], [28], [31], [32], [38], [41]

Phương pháp HPLC là một kỹ thuật phân tích hố lý, dùng để tách và định

lượng các thành phần trong hỗn hợp dựa trến ái lực khác nhau giữa các chất

với hai pha luơn tiếp xúc, nhựng khơng hồ lấn vào nhau: pha tnh (được nhồi

trong cột sắc ký) và pha động (dung mơi rửa giải) Pha động cùng với mẫu thử được bơm qua cột dưới áp suất cao vä các chất cần phân tích di chuyển theo

Trang 20

14

bố, hấp phụ hoặc trao đổi ion của các chất tan khác nhau vệ cấu trúc hố

học và tính chất

Các chất sau khi được rửa giải ra khỏi cột, được nhận biết bởi bộ phận

phát hiện goi 1a detector Tuy theo ban chất của các chất cần phân tích, mà sử

dung detector thich hợp Detector hay được sử dụng nhất là detector UV (phát hiện được lượng chất cần phân tích cĩ trong dịch rửa giải sau khi qua cột dựa vào khả năng hấp thụ ánh sáng tử ngoại của chất cần phân tích ở một bước sĩng xác định) Sau một quá trình sắc ký, ta thu được sắc ký đồ Sắc ký đồ

phản ánh quá trình tách sắc ký ở trong cột tốt hay khơng Trong quá trình sắc

ký, chất nào bị lưu giữ mạnh nhất trong pha tinh sé được pha động rửa giải ra khỏi cột sau cùng, chất nào bị lưu giữ kém nhất sẽ được rửa giải ra trước tiên Thời gian chất tan bị pha tĩnh lưu giữ phụ thuộc vào bản chất sắc ký của pha

tĩnh cũng như cấu trúc hố học và tính chất của chất tan Sắc ký đồ thường cĩ dạng như hình l:

Hình 1: Sắc ký đồ hai chất | va 2

Trên sắc ký đồ thể hiện một số thơng số quan trọng:

Trang 21

15

- ta (thoi gian liai): Thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào hệ thống sắc ký đến khi xuất hiện đỉnh của pic Thời gian lưu đặc trung cho mot chất Trên

cùng một điêu kiện HPLC đã chọn: t, của mỗi chất là hằng định, các chất

khác nhau thì t„ khác nhau, vì vậy t,„ là đại lượng để phát hiện định tính các chất So sánh thời gian lưu của mẫu thử và mẫu chuẩn làm trong cùng điều

kiện ta sẽ định tính được chất đĩ Nếu t¿ nhỏ quá, sự tách kém, pic xuất hiện quá sớm, đề lần pic tạp Nếu t¿ lớn quá pic bị dộng, độ lặp lại kém, thời gian

phân tích kéo dài

-t(thời gian lưu thực) = ty-,

- ư(độ lệch chuẩn): Độ rong nwa pic tại các điểm uốn tương ứng

- 0g s(độ rộng pic ở nửa chiều cao) = 2,354 ð;: - ,(d6 rong day pic)

-k (hệ số dưng lượng): Hệ số dụng lượng của một chất cho biết khả năng phân bố của chất đĩ trong 2 pha cộng với sức chứa của cột, tức là tỷ số giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động ở tại thời điểm

cân bằng Hệ số k phụ thuộc vào bản chất chất phân tích, đặc tính của pha

tĩnh và pha động

Nếu k nhỏ thì ty cũng nhỏ và sự tách kém, k lớn thì pic bị dỗng; độ nhạy kém và thời gian phân tích kéo đài Trong thực tế k từ 1 đến 5 là tốt nhất

- œ (độ chọn lọc): Tốc độ di chuyển tỷ đối của hai chất, cho biết hiệu quả

tách của hệ thống sắc ký, hai chất chỉ được tách ra khi các giá trị k` khác nhau

ks lg sty :

Qo <= (Ko> Kj) (5)

&, tụ, —Í

Để tách riêng hai chất cần cĩ a > I, thường dùng œ trong khoảng 1,05 đến

2,0 œ càng lớn hai chất càng tách ra khỏi nhau, nhưng khi œ quá lớn thời gian ' phân tích sẽ kéo dài

Trang 22

16

weltel ord te] = |= ( 54 afm 6

l2, | La, | 4 `)

- R (độ phân giải): Đại lượng đặc trưng cho mức độ tách của hai chất cạnh

:

nhau trên một điều kiện sắc ký Độ phan giai gitta hai pic s6 1 va s6 2 được tính theo cơng thức sau:

2Œ, —! }_ LIS 2:

le R, R, It, ER

@, ;—O4 5 Mo 5.1 + Oo 3 (7)

Trong thực tế nếu các pie cân đối, thì độ phân giải tối thiểu để hai pic tách

ra khỏi nhau trong phép thử định lượng R = 1,5 là phù hợp

Độ phân giải phụ thuộc vào hệ số dung lượng của cấu tử ra sau (Èk;), độ chọn lọc œ và số đĩa lý thuyết N của cột

Re 3W 4 &- a 14 k,

Do vậy, để tang dé phan giai R cua hai pic ta c6 thé tang s6 dia ly thuyét

N (dàng cột dài hơn, cột cĩ kích thước hạt nhỏ hơn hay giảm tốc độ dịng pha

dong); tang k (bdng cach thay đổi thành phần của pha động: thay đổi độ

phán cực của pha động nếu là RP -HPLC, thay đối cường độ ion nếu là IE- HPLC); tăng độ chọn lọc œ (bảng cách chọn cột khác phù hợp hơn với qúa

trình tách, hoặc thay đổi thành phan pha động)

Nếu R quá lớn thì thời gian phân tích sẽ lâu, tốn nhiều pha động, độ nhạy

sẽ kém Giảm R bằng cách thay đổi thành phần pha động, tăng tốc độ dịng

hay ứng dụng quá trình rửa giải gradient dé cho chất thứ hai ra nhanh hơn

-T (hệ số bất đối xứng): cho biết mức độ đối xúng của pic trên sắc ký đồ

2ƒ

f là khoảng cách từ đường vuơng gĩc hạ từ cực đại của pic đến mép đường

T= (9)

 x “ 1é

cong phia trifée ở tại I/20 chiêu cao pic Khi T quia lớn, điểm cuối eủa pic rit khĩ xác định, pIc bi kéo đuơi đài, nên khi tính diện tích pic sẽ mắc nhiều sai

SỐ

Trang 23

j

I

1T ag ae }

" 'tùị1 ⁄

Muốn làm cho pïc cân xứng hơn, ta cĩ thê làm giảm thể ich chết;-ẳe-là

a

đoạn nối từ cột đến đetector; thay đổi thành phần pha động sao cho kha năng

rửa giải tăng lên; giảm bớt lượng mẫu đưa vào cột, bằng cách pha lỗng mẫu phân tích hoặc giảm thể tích tiêm

- Diện tích và chiều cao của pic: thể hiện nồng độ và thể tích chất tan được tiêm vào cột Khi so sánh diện tích hay chiều cao của pic trong sắc ký đồ của

dd mẫu thử và mẫu chuẩn làm trọng cùng điều kiện, ta sẽ xác định được hàm lượng hoạt chất trong mâu thử

Phương pháp HPLC đã được ứng dụng ngày càng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt trong kiểm nghiệm thuốc tân dược Gần đây, người ta cũng đã áp dung pp HPLC trong kiếm nghiệm thuốc đơng dược Phương pháp này cĩ độ chính xác và độ nhạy cao, tốn ít mâu, cĩ tính đặc hiệu, thực hiện tương đối

nhanh và thuận tiện, cĩ thể thực hiện được ở những cơ sở kiểm nghiệm đã duoc trang bi may HPLC

Tuy nhién pp HPLC con it duoc nghién cttu ap dung trong viéc phan tich định lượng L- tetrahydropalmatin Trong các tài liệu mà chúng tơi đã tham

khảo ở tạp chí và trên Internet các tác giả đã nêu lên một số chương trình sắc ký sau đây để phân tích L- tetrahydropalmatin cũng nhự các alcaloid khác

trong củ Bình vội,

* Yuan YE, Liu 2L, Li XL [42] đã sử dụng chương trình sắc ký sau đây

để tách và xác định DL.- tetrahvdropalmatin và các alcaloid khác trong cây

Corydalis Yanhusuo W T Wang: - Cét silica gel

- Pha dong la: Hon hop methanol - đệm phosphat 2 mmol/l (75:25) * Huang J, Guo J, Duan G [33] xac dinh 7 alcaloid cé hoat tinh sinh hoc

trong các cây thuộc ch¡ Stephania bảng pp sắc ký long pha dao:

- Cét ODS

- “ z re * grr h

- Pha động : methanol —- nước ~ triethylamin - hư"

ie eK 2 / “2

Trang 24

- Detector::::.UV 282 n

hệ dung mơi là pha động

* Chương trình sắc ký của các tác gia [24] xác nhận được sự cĩ mặt của

rotundin trong hơn hợp nhiều dược liệu:

-Cot =: Lichrosorb C18 (Sum, 4,6 x 250mm)

- Pha động: Hơn hợp dung mơi đệm phosphat 0,05M pH 4,6 — acetonitril (1:1) Dung dịch KH;PO, 005M chỉnh pH ve 4,6 bang dd acid hydrocloric

0,1N hoặc dd NaOH 0.IN

- Tốc độ dịng: 1,5ml/phut

- Detector: UV 28Inm

- Thể tích tiêm: 20L

* Một chương trình HPLC với detector diode array để phát hiện L~ tetrahydropalmatin trong dịch sinh học [34]: Sau khi chiết hoạt chất bằng

kỹ thuật chiết pha rắn các tác giả đã dùng:

- Cột Hypersil C- 18 (5/ưn; 4,6 x 50m)

- Pha dong: Dung dich A (dcetonitri! 5%) va dd B (ácetonitril 50%) trong đệm phosphat 50mM pH 3 cĩ chứa 0,3% triethylamin va 375mg/I natri octyl

sulphat

- Chương trinh gradient dung moi: Tu 0 dén 25 phút 12 - 100% B trọng A,

giữ trong 3 phút, sau đĩ quay lạt 12% B trong A trong 3 phút, - Tốc độ dịng Iml/phút

- Phát hiện: Detector diode array

Ngồi các pp đã nêu ở trên, một số tác giả cịn dùng pp điện đi mao quản để

xác định tetrahydropalmatin trong thuốc đơng dược [30]

Trang 25

19

Chuong 2: ĐỐI TƯƠNG, THIẾT BI, NỘI DUNG VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu _

* Mẫu M, là mãu bột mịn củ Bình vơi (Stephania viridiflavens H.S.Lo et

M.Yane) thu hái ở Sơn La tháng I1/2001 Dược liệu khơ được tán nhỏ va ray qua rây cỡ 0,4inm,

* Mẫu M;¿ là mẫu bột mịn Balok: Lấy 2 vỉ viên hồn Balok cĩ SKS: 03/03

(do Cơng ty TNHH đơng nam dược Bảo Long cung cấp) gồm 24 nang cĩ chứa 72 viên hồn nhỏ, đem sấy các viên hồn ở nhiệt độ 50°C trong 4 giờ, để

nguội trong bình hút ẩm Nghiên mịn viên đã sấy và rây qua rây cỡ 0,4mm Mẫu M; cĩ các dược liệu sau [I2]:

Xuyên khung 8g Cam thao 58

Duong quy l2g Trầm hương 6g

Thục địa 15g Củ Bình vơi 6g,

Bạch thược 12g Đơng trùng hạ thảo 6g, Lưỡng diện châm 10g Mộc nhĩ 10g, Nhan sam 6g Hác táo nhân 8g,

Bạch linh 12g Viên chí 8g

Bạch truật l2§

Mẫu M; được dùng để khảo sát ảnh hưởng của các thành phần khác trong

viên hồn Balok đến quá trình chiết tách và quá trình sắc ký định tính và định

lượng L_ tetrahydropalmatin bằng pp HPLC

Trong quá trình nghiên cứu, hai mẫu M, và M;¿ được tiến hành song song

* Hai mẫu được liệu Bình vơi ở Việt Nam cĩ tên khoa học là: - Stephania dielsiana Y.C.Wu thu hái ở Hà Tây tháng 10/2002

- Stephania sp mua ở trên thị trường là nguyên liệu sản xuất viên hồn Balok

* Một mẫu bột mịn Heantos 4: Lấy 20 viên nang cứng Heantos 4 cĩ số lơ:

Trang 26

định khối lượng trung bình, rồi đem sấy bột thuốc ở nhiệt độ 50°C trong 4 giờ, để nguội trong bình hút ẩm, nghiền mịn và rây qua rây cỡ 0.4mm Mẫu bột

20

mịn Heanmtos 4 cĩ các thành phần sau [26]: Phong dang sam 600g

A giao 80g Mach mén 200g Hoang ky 200g Cam thảo 200g Xuyên quy 150g Sinh dia 150g Bình vơi Can khương Quế chỉ Đại táo Táo nhân Viễn chí

Cơng thức này pha chế cho 100g thành phẩm

Tiến hành định tính và xác định hàm lượng L- tetrahydropalmatin trong

các mẫu nghiên cứu bằng pp HPLC đã xây dựng

2.2 Thiết bị và hố chất 2.2.1 Thiết bị

- May lac siéu 4m Ultrasonic LC 60H

- May HPLC Hewlett — Parkard 1100 với detector UV

- May HPLC Hitachi vdi detector diode array

- Can phan tích Mettler AE 200 với độ chính xác 0,1mg - Máy quang phổ UV - VIS Hewlett Parkard

- Máy đo pH: 691 pH Meter Metrohm

- Máy khuấy từ điều nhiệt Ikamag RH - Nồi cách thuỷ

- Dung cu chiét Soxhlet cd 100ml

- Các dụng cụ thuỷ tính chính xác các loại

Tất cả các thiết bị và dụng cụ trên đều đã được hiệu chuẩn và kiểm định

theo đúng tiêu chuẩn ISO/IEC 17025

Trang 27

21

= Acid sulphuric P A - Amoniac dac

- Ban mong silica gel GF,., cua Merck

- Chuẩn làm viéc rotundin của Viện Kiểm nghiệm

- Cloroform P A - Cồn 90°

- Kali dihydrophosphat P A - Nước cất

- Triethylamin P A

- Thuốc thử Dragendorff pha theo DĐ Việt Nam III 2.3 Nĩi dung và phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Nghiên cứu phương pháp chiết xuất L— tetrahydropalmatin từ bột mịn

Binh voi va tit bot min Balok

2.3.1.1 Khdo sdt pp chiét néng theo DPVN III va-pp chiết lạnh bằng lắc siêu âm trên mâu bội mịn Bình vơi (mâu M,) và bột mịn Balok (mâu M,)

2.3.1.2 Đề xuất pp chiết L— tetrahydropalmatin từ bột mịn Bình vơi (mẫu M,) và

bột mịn Balok (mâu M,)

a) Đối với bột được liệu Bình vơi (w„ẩu M,) : :'

Cân chính xác khoảng 0,4g bột mịn dược liệu Bình vơi chuyển vào một túi giấy lọc Làm ẩm khối bột mịn bằng 0,5ml dd amoniac 6N, để yên trong 30 phút Chuyển túi giấy lọc này vào trong dụng cụ Soxhlet cỡ 100ml Dùng 30ml cloroform để chiết alcaloid trong thời gian khoảng 4giờ đến kiệt alcaloid Dịch

chiết cloroform được cơ trên cách thuỷ đến cạn Hồ tan cắn thu được trong dd acid sulphuric 0,1N (5 lan, mỗi lần khoảng 10ml) Lọc dd qua giấy lọc vào một

bình gan Kiềm hố dịch lọc bằng dd amoniac đặc đến pH I0 Chiết 4 lần, mỗi

lần với IƯml cloroform Tập trung dịch chiết cloroform, bốc hơi trên cách thuỷ

tối khơ Cắn được hồ tan trong pha động và chuyển vào bình định mức dung tích 50,0ml; thêm pha động đến vạch, lắc đều Lọc sơ bộ qua giấy lọc thường, bỏ

[0ml dịch lọc đầu Dịch lọc sau đĩ được lọc qua giấy lọc mm cỡ 0,45m: thu

Trang 28

22

b), Đối với mâu bột min Balok (mau M;) _

Cân chính xác khoảng 1,00g bột mịn Balok chuyển vào một túi giấy lọc rồi tiến hành chiết giống như đối với mẫu bột mịn dược liệu Bình vơi ở trên

Sơ đồ chiết xuất L— tetrahydropalmatin từ bột mịn được liệu Bình vơi và

bột min vién hoan Balok:

Mau M;: 0,4g bot min

dược liệu Bình vơi

Mau M,: 1,00øg bột min

vién hoan Balok

Cho vào túi giấy lọc, làm ẩm bằng 0,5ml dd

amoniac 6N/30 phút Chiết trong dụng cụ

Soxhlet bằng 30ml cloroform/4 giờ

v Bã dược liệu ! Bỏ v

Dich chiét alcaloid base

{Bay hơi trên cách thuỷ tới khơ

Cắn alcaloid base

Hồ tan cắn trong dd H,SO, 0,1N

(5 lần, mỗi lần 10ml) Lọc vào bình

gạn

Alcaloid dạng muối

Kiêm hố bằng dd amoniac đặc

i = 10 Chiết nang cloroform

Dich chiét alcaloid base

| Bay hơi trên cách thuỷ tới khơ

Can alcaloid base

Hồ tan cắn trong pha động vở

50,0ml Lọc qua giấy lọc Lọc qua

giấy lọc mịn 0,45um

Dung dịch thử

Trang 29

23

2.3.2 Xdy dung pp HPLC dé dinh tinh và định lượng

L- tetrahydropánatin trong dược liệu Bình vơi và trong vién hoan Balok

2.3.2.1 Khảo sát điểu kiện sắc ký

Trên cơ sở cĩ săn cột RP 18 (250 x:4mm; 5um), chúng tơi tiến hành khảo sát các điều kiện khác để chọn chương trình sắc ký thích hợp

a) Khảo sát chọn thành phần pha động, pH pha động và tốc độ dịng

thích hợp cho phép tách L_ tetrahydropalmatin ra khỏi hỗn hợp phân tích

b) Khảo sát chọn bước sống xác định L- tetrahydropaÌmatin

c) Xây dựng chương trình sắc ký

Sau khi khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách

L- tetrahydropalmatin trong dịch chiết từ mẫu được liệu Bình vơi và mâu bột

mịn Balok như: thành phần pha động, pH pha động, tốc độ dịng và bước sĩng phát hiện, chúng tơi đã chọn một chương trình sắc ký với các điều kiện sau

đây cho phép tách được L- tetrahydropalmatin ra khỏi hơn hợp các chất khác * Cột RP 1§: Chiều dài 25cm, đường kính trong 4mm, chất nhồi cột là octadecylsilyl silicagel dùng cho sắc ký cĩ cỡ hạt 5um (250 x 4mm; Sưm)

* Pha động: Hỗn hợp dd KH,PO, 0,05M 62,5ml poe |

Acetonitril 37,5ml Tool

Triethylamin 0,5ml uốn]

Điều chỉnh pH pha động đến 4,0 bằng dd acid phosphoric đặc Lọc qua màng lọc 0,45m, lắc siêu âm để loại hết bọt khí

* Detector UV voi bude song phat hién 283nm

* Tốc độ dịng: Iml/phút * Thể tích tiêm: 20H]

* Nhiệt độ phân tích: Nhiệt độ phịng (27 + 3°C)

2.3.2.2 Xây dựng pp- định tính và định lượng L— tetrahydropalmatin trong được liệu Bình vơi và trong vién hoan Balok

a) Kiểm tra độ tinh khiết của pic L- tetrahydropalmatin thu được trên sắc ký đồ của dịch chiết mẫu thử bằng máy HPLC với detector diode array

Trang 30

24

Sti dung may HPLC Hitachi v6i detector diode array dé dinh tinh

L~ tetrahydropalmatin dựa vào việc so sánh các thơng số: thời gian lưu (tạ) va

phổ UV của mẫu thử và mẫu chuẩn thơng qua hệ số match

c) Xây dựng phương pháp định lượng L- tetrahydropalmatin

Để định lượng L— tetrahydropalmatin trong dược liệu Bình vơi và trong viên hồn Balok bằng phương pháp HPLC, chúng tơi tiến hành:

- Khảo sát độ ổn định của hệ thống sắc ký

- Khảo sát khoảng tuyến tính giữa nồng độ L_ tetrahydropalmatin và

diện tích pic

- Xác định giới hạn phát hiện (LOD) va gidi hạn định lượng (LOQ) của L tetrahydropalmatin

- Khảo sát đệ lặp lại của phương pháp - Khảo sát độ đúng của phương pháp

Trên cơ sở đĩ, chọn nồng độ định lượng của mẫu chuẩn và mẫu thử

năm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát Tiến hành sắc ký theo chương trình

đã chọn trên các mẫu thử, song song với mẫu chuẩn L— tetrahydropalmatin

Tính hàm lượng L- tetrahydropalmatin dựa trên diện tích pic

L= tetrahydropalmatin thu được từ sắc ký đồ của dd thử, dd chuẩn và hàm

lượng của chất chuẩn L- tetrahydropalmatin Cơng thức tính:

; ,.m, C 100

xX% = SMe C_.100 (10)

Sem, (1+ 5)

- Đối với viên hoan Balok (mg/vién):

y= SMa Co my (11)

Sư,

Trong đĩ: S¿, S¿ là diện tích pic L— tetrahydropalmatin thu được trên

sắc ký đồ của dd thử và dd chuẩn

mc: Lượng cân mẫu chuẩn (mg) tip: Lượng cãn mẫu thử (mg)

Œc: Hàm lượng L~— tetrahydropalmatin chuẩn (%)

Trang 31

25

b: Độ ẩm dược liệu Bình vơi (g/1g bột mịn dược liệu) 2.3.3 Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả

2.3.3.1 Đánh giá hiệu quả chiết

Để đánh giá hiệu quả chiết, chúng tơi dùng phản ứng tạo tủa với thuốc thử Dragendorff, dùng phương pháp SKLM và HPLC

2.3.3.2 Định tính

- Thời gian lưu và hình dạng pic L- tetrahydropalmatin trên sắc ký đồ của mẫu thử và mẫu chuẩn phải như nhau

- Phổ hấp thụ tử ngoại của pic L- tetrahydropalmatin thu được từ mẫu thử phải trùng với phổ hấp thụ của pic L- tetrahydropalmatin chuẩn tương ứng

dua trên hệ số match Hệ số match là hệ số tốn học nĩi lên mức độ tương tự

của hai phổ được đem so sánh Hệ số match được biểu thị bằng cơng thức tốn

po)

pee fer)

Trong đĩ: Ala hé sé match

hoc sau:

A= (12)

x, y tuong ứng là các độ hấp thụ đo được trong các phổ của mẫu

thử và mẫu chuẩn ở cùng bước sĩng

n là số điểm so sánh

+ Khi hé sé match = 1,000 cĩ nghĩa là hai phổ giống nhau hồn tồn + Khi hề số match > 0,990 thì hai phổ tương tự nhau

+ Khi hệ số match từ 0,900 đến 0,990 thì hai phổ cĩ những điểm tương tự

nhau, nhưng khi kết luận cần cân nhắc cẩn thận

+ Khi hệ số match < 0,900 nghĩa là hai phổ khác nhau [31], [35] 3.3.3.3 Định lượng

Trang 32

26

* Giá trị trung bình: x= 2% (13)

* Độ lệch chuẩn: (14)

Trang 33

27

Chương 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUA

3.1 Xây dựng phương pháp chiết L- tetrahydropalmatin trong dược liệu Bình vơi và trong viên hồn Balok

3.1.1 Khảo sát phương pháp chiết lạnh dùng máy lắc siêu âm

Cân chính xác khoảng 0,4g bột mịn củ Bình vơi (mâu Mí,) vào một bình

nĩn nút mài dung tích IOOml Cân chính xác một lượng mẫu M; cĩ chứa khoảng lg bột mịn Balok vào một bình nĩn nút mài dung tích 100ml khác,

thấm ẩm lượng bột trên bằng dd amoniac 6N, đậy kín và để yên trong 2 giờ

Song song tiến hành chiết trên 2 mẫu này bằng cách lắc siêu âm 4 lần, mỗi lần dùng I5ml eloroform và lắc trong 30 phút Tập trung dịch chiết cloroform, lọc rồi cơ trên cách thuỷ đến khơ, thụ được cắn

Để kiểm tra xem pp chiết lạnh dùng siêu âm như trên đã chiết kiệt

alcaloid trong 2 mẫu M; và M; chưa, chúng tơi tiến hành như sau: Ba cịn lại

chiết thêm lần thứ 5, cũng bằng cách lắc siêu âm với 15ml cloroform trong 30

phút Dịch chiết cloroform cho bốc hơi trên cách thuỷ đến cạn Hồ tan cắn

trong 2ml dd acid sulphuric 10%, thêm 2-3 giọt thuốc thử Dragendorff Quan

sát thấy cả hai mẫu M; và M; đều xuất hiện tủa mau do cam,

Như vậy pp chiết lạnh dùng máy lắc siêu âm nêu trên, chưa chiết kiệt

alcaloid trong mẫu dược liệu Bình vơi và mẫu viên hồn Balok

3.1.2 Khảo sát phương pháp chiết nĩng theo DĐ Việt Nam III

Cân chính xác khoảng 10g bột mịn mẫu M, cho vào một túi giấy lọc

Cân chính xác một lượng bột mịn mẫu M; cĩ chứa khoảng 10g Bình vơi, cho

vào một túi giấy lọc khác, thấm ầm khối bột mịn bằng dd amoniac 6N trong 2

gid Sau đĩ cho vào bình Soxhlet, chiết bằng cloroform cho đến hết alcaloid Dịch chiết cloroform được cơ trên cách thuỷ tới khơ Hồ tan cắn trong dd

acid hydrocloric 5% ($ — 7 lần, mơi lân Sml) Rửa dịch chiết acid bằng ether

Trang 34

28

Chiết bằng cloroform (Š lần, mỗi lần 10ml) để lấy hết alcaloid Tập trung dịch chiết, rửa bằng nước cất đến pH trung tính Bốc hơi dịch chiết đến khơ

Để kiểm tra xem đã chiết kiệt alcaloid chưa, chúng tơi dùng bã dược

liệu được chiết tiếp trong dung cu Soxhlet véi cloroform trong | giờ Dich chiết cloroform này được bốc hơi trên cách thuỷ tới khơ Hồ tan cắn trong 2ml dd acid sulphuric 10%, thêm 2-3 giọt thuốc thử Dragendorff Quan sát

thay ca hai mau M; va M, déu khơng thấy xuất hiện tủa mau đỏ cam

Nhu vay, thuc nghiém da chitng to pp chiét nong theo DD Viét Nam III

đã chiết kiệt alcaloid trong mẫu dược liệu Bình vơi và trong chế phẩm Balok Tuy nhiên chúng tơi nhận thấy rằng: với cả 2 mẫu M; và M;, ở giai đoạn tỉnh chế để chuyển alcaloid từ dạng base sang dạng muối acid, DĐ Việt

Nam III dùng acid hydrocloric 5%, nhưng theo các tài liệu mà chúng tơi đã than khảo, cộng với thục tế thực nghiệm, chúng tơi thấy

L— tetrahydropalmatin dé tan trong acid sulphuric lỗng và tạo thành dạng muối sulphat dễ tan trong nước hơn Do vậy cĩ thể thay acid hydrocloric 5%

bằng acid sulphuric 0,1N

3.1.3 Khảo sát điều kiện chiết thích họp

Qua tham khảo các tài liệu, chúng tơi chọn cloroform, một dung mơi

quen thuộc mà hầu hết các tác giả Sử dụng để chiết xuất L- tetrahydropalmatin trong dược liệu Bình vơi Cloroform là một dung mơi khơng phân cuc c6 kha nang hoa tan chon loc alcaloid dang base

3.1.3.1 Khảo sát thể tích dùng mơi chiết xuất

Chúng tơi đã khảo sát dùng dung mơi chiết xuất là cloroform với thể

tích là: 30ml, 40ml và 50ml Tiến hành chiết nĩng bằng Soxhlet trong thời gian 4 giờ Quá trình khảo sát được tiến hành trên 2 mâu M; và M; theo quy

trình sau: Cân chính xác 3 mẫu thử M;, mỗi mẫu khoảng 0,4g cho vào 3 túi

Trang 35

đã nêu ở mue 2.3.1.2.a, nhưng thay lượng dung mơi chiết bang các thể tích

dung mơi sau:

29

Bình Soxhlet số I: 30ml cloroform Binh Soxhlet s6 2: 40m! cloroform Binh Soxhlet s6 3: 50m! cloroform

Tương tự như vậy, dùng 3 lượng thể tích cloroform trên để chiết 3 mẫu

thử M, theo pp đã nêu ở mục 2.3 Ì.2.b

Tiến hành chạy sac ký lỏng hiệu năng cao các dd thử với chương trình sac ky như đã nêu ở mục 2.3.2.1.c, so sánh với dđ chuẩn chứa khoảng 0,05mg

L- tetrahydropalmatin khan trong Iml pha động Kết quả cho thấy: sử dụng 3 lượng dung mơi trên để chiết alcaloid đều thu được sắc ký đồ trong đĩ cĩ 1 pic

cĩ thời gian lưu và hình dạng giống với pic L- tetrahydropalmatin chuẩn (Hình

2a) Tuy nhiên, thơng qua kết quả các diện tích pic thu được cĩ thể thấy rằng trong cùng điều kiện chiết, với 3 thể tích dung mơi khác nhau thì lượng hoạt

chất chiết được là như nhau

Từ đĩ chúng tơi chọn lượng 30ml eloroform là thể tích dung mơi chiết

L— tetrahydropalmatin trong được liệu Bình vơi và trong chế phẩm Balok BảngI: Khảo sát chọn thể tích dung mơi chiết

Lượng Mẫu M, Mau M,

cloroform Bột mịn Bình | Diện tích pic Bột mịn Diện tích pic

voi (g) mAU*s Balok (g) mAU*s

30ml 0.4008 942,38 1,0039 862,29

40ml 0.4023 958,93 1,0007 850,98

50ml (0.4002 939,16 1,0053 874,55

3.1.3.2 Khảo sát thời gian chiết xuất

Để xác định thời gian chiết xuất thích hợp, vừa cĩ thể chiết kiệt alcaloid

Trang 36

30

M, theo quy trinh sau: Can chinh xác 5 mẫu thử M; mỗi mau khoang 0,4g cho vào túi giấy lọc, thấm ẩm bang 0,5mi dd amoniac 6N, dé yén trong 30 phit,

rồi cho vào trong bình Soxhlet đã được đánh số từ 1 đến 5 Tiến hành chiết

nĩng với 30ml] cloroform, nhưng thời gian chiết theo thứ tự sẽ là: I giờ, 2 giờ,

3 gid, 4 gid va 5 gid

Tương tự như vay, can chính xác 5 mẩu M; mỗi mẫu khoảng 1g, dùng 5 bình Soxhlet để chiết alcaloid theo pp đã nêu ở mục 2.3.2.1.c

Sắc ký các dd thử MỊ và M; song song với dd chuẩn chứa khoảng

0.05mg L- tetrahydropalmatin khan trong Iml pha động Kết quả thu được

cho thấy rằng, sử dụng thời gian trên để chiết đều thu được sắc ký đồ trong đĩ

cĩ l pic cĩ thời gian lưu và hình dạng giống với pic L- tetrahydropalmatin chuẩn (Hình 2a, 2b và 2c)

Injection Date : 9/1/03 11:34:35 AM

Sample Name : Rotundi0,05mg/m]l Vial

Acq Operator : Duyen

Acq Method : C:\HPCHEM\1\METHODS\CLOBEPRO.M

Last changed : 9/1/03 11:43:02 AM by Duyen

(modified after loading)

Analysis Method : C:\HPCHEM\1L\METHODS\CLOBEPRO.M

Last changed : 9/1/03 12:19:02 PM by Duyen (modified after loading) Dinh luwowng Rotundin trong vien hoan Balok

| VW01 A, Wavelength=283 nm (ROTUN\ROTUND10.D) mAU | 70 5 4307 i | = 50 ~ 40 - 30 - 20 - 10 - 75 10 min

Hình 2a: Sắc ký đồ mẫu chuẩn L- tetrahydropalmatin

Trang 37

Injection Date : 8/28/03 3:16:10 PM

Sample Name : Bvoi:Chiet 4h Vial : C

Acq Operator : Duyen

Acq Method : C:\HPCHEM\1\METHODS\ROTUND.M

Last changed : 8/28/03 3:02:48 PM by Duyen (modified after loading)

Analysis Method : C:\HPCHEM\1\METHODS\SALICY M

Last changed : 9/3/03 12:33:45 PM by Hoang

(modified after loading) _

Dinh luong Rotundin trong Binh voi S viridiflavens

VW01 A, Wavelength=283 nm (ROTUNDIN\RORUND17.D) mAU j 166 = 80 - 60 - _= ] s 4 od 40 ~ § 1 8 20 - = ; a 0 +—— — 7 T TT T 0 5 10 min Injection Date : 11/29/02 2:36:28 PM

Sample Name : Balox 8 Vial : 0

Acq Operator : Duyen

Met hod : C:\HPCHEM\1\METHODS \DUYEN.M

Last changed : 11/29/02 11:00:29 AM by Duyen

(modified after loading) Dinh luong Rotundin trong vien Balox

VWDI A, Wavelength=283 nm (DUYEN\ROTUNO26 D)

1 2 | 1 | 1 + | 70 = , 50 + Rotundin > 6.057 11 566 — ——— ' [ 9 2.5 5 75 10 min

SSS S SSS SSS SSS SHS SS HSS SSS SS SS SSS SS SS SSS SS SS SSSSSESS STH SSSSeSSE SSE 5SSSS==z= ====

Trang 38

32

Từ kết quả diện tích pic thu được trên sắc ký đồ cĩ thể thấy rằng, trong

cùng điều kiện chiết: bình Soxhlet số 4 và 5 với thời gian chiết là 4 giờ và 5 giờ đã thu được lượng hoạt chất nhiều nhất Kết quả được trình bày ở bảng 2: Bảng 2: Khảo sát thời gian chiết

STT | Thời gian Mẫu thử M, Mẫu thử M;

chiết | Lượng cân | Diện tích pic| Lượng cân | Diện tích pic

(ø) mAU*s (ø) mAU*s I 1 gid 0,4017 628,83 1,0042 429,74 2 2 gid 0,402ĩ 674,40 1,021 498 37 3 3 gid 0,4006 753,63 1,009 665,28 4 4 gid 0,4032 960,78 1,0017 850,36 5 5 gid 0,4002 933,99 1,0038 857,12

Tuy nhiên, với thời gian chiết 5 giờ thì lượng hoạt chất chiết được cũng

khơng tăng so với thời gian chiết 4 giờ Từ đĩ chúng tơi chọn thời gian chiết là 4 giờ để chiết L_ tetrahydropalmatin trong được liệu Bình vơi và trong viên “—=— “mm 7 ewes

hoan Balok

Để kiểm tra xem đã chiết kiệt alcaloid trong các mẫu nghiên cứu chưa, chúng tơi tiến hành như sau: bã dược liệu sau khi chiết trong l giờ, 2 giờ, 3 giờ, 4 giờ và 5 giờ, chúng tơi lại chiết tiếp trong bình Soxhlet: với 30ml

cloroform trong I giờ Bốc hơi dịch chiết trên cách thuỷ tới khơ Hồ tan cắn

trong 2ml dd acid sulphuric 10%, chuyển sang ống nghiệm Cho vào mỗi ống

nghiệm đựng dịch chiết đã được xử lý như trến 2-3 giọt thuốc thử Dragendorff Kết quả cho thấy: Các dịch chiết sau 1 giờ, 2 giờ và 3 giờ đều

xuất hiện tủa mầu đỏ cam, nhưng với dịch chiết sau 4 giờ và 5 giờ khơng cịn thấy xuất hiện tủa nữa

Lấy những dịch chiết bã dược liệu ở trên, cơ cạn trên cách thuỷ, rồi hồ

tan cắn trong Iml ethanol 90% Tiến hành kiểm tra bằng SKLM với hệ dung

mơi là: Toluen : acetone : ethanol : amoniac (45:45:7:3) Chấm riêng biệt lên

ban mong silica gel G, 20Hl mơi dd thir va dd đối chiếu chứa Img và 0,lmg

Trang 39

45

ký, lấy bản mỏng ra, để khơ ở nhiệt độ phịng rồi phun hiện mầu bằng thuốc thử

Dragendorff Kết quả trên sác ký đỏ cho thấy, các địch chiết mẫu thử sau l giờ, 2 giờ, 3 giờ đều thấy xuất hiện vết cĩ màu sắc và giá trị R; giống vết của

L— tctrahydropalmatin trên sắc ký đồ của dd đối chiếu, nhưng với dịch chiết sau

4 giờ và 5 giờ khơng cịn thấy xuất hiện vết L tetrahydropalmatin (Hình 3a, 3b):

Ghi chú:

C: DD chuẩn rotundin (1mg/ml) 1: Dịch chiết bã dược liệu sau I giờ 2: Dịch chiết bã dược liệu sau 2 giờ 3: Dịch chiết bã dược liệu sau 3 giờ 4: Dịch chiết bã dược liệu sau 4 giờ 5: Dịch chiết bã dược liệu sau 5 giờ

-> *~

/10: DD chuẩn pha lỗng 10 lẳn

Hình 3a: Sắc ký đồ khảo sát thời gian chiết trên mẫu Mj

Ghỉ chú:

C: DD chuẩn rotundin (1mg/ml) 1: Dịch chiết bã dược liệu sau l gid 2: Dịch chiết bã dược liệu sau 2 giờ 3: Dịch chiết bã dược liệu sau 3 giờ 4: Dịch chiết bã dược liệu sau 4 giờ 5: Dịch chiết bã dược liệu sau 5 giờ C/10: DD chuẩn pha lỗng 10 lần

Trang 40

34

Bã dược liệu, sau khi chiết 4 giờ trọng dụng cụ Soxhlet, được chiết tiếp

với 30ml cloroform trong 1 giờ Bốc hơi dịch chiết trên cách thuỷ tới khơ, hồ tan cắn thu được trong 2ml pha động, loc qua giấy lọc mịn 0,45m Tiến hành chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao dd thử này với chương trình sắc như đã nêu trong mục 2.3.2.1.c Kết quả cho thấy sắc ký đồ thu được (Hình 3c, 3đ) từ các dd thử này khơng thấy xuất hiện píc cĩ thời gian lưu gần hoặc trùng với thời gian lựu của L tetrahydropalmatin chuẩn,

VWDI A, Wavelength=283 nm (DUYENROTUN VW01 A, Wavelength=283 nm (BINHVONROTU

eg Hình 3c: Sắc ký đồ dịch chiết bã Bình Hình 3d: Sắc ký đồ dịch chiết bã viên

vội sau khi chiết 4 giờ hồn Balok sau khi chiết 4 giờ

Như vậy, từ các kết quả khảo sát trên, chúng tơi chọn thời gian chiết

nĩng trong dụng cụ Soxhtet với 30ml clsroform trong 4 giờ là phù hợp nhất Nếu thời gian chiết xuất kéo đài, sẽ mất nhiều thời gian phân tích một mẫu, tốn nhiệt lượng và cĩ thể sẽ xuất hiện nhiều tạp chất gây ảnh hưởng đến kết quả định tính và định lượng L- tetrahydropalmatin, đặc biệt trong viên hồn Balok, một chế phẩm đơng dược chứa nhiều loại được liệu khác nhau

3.1.4 Nhán xét

Qua kết quả khảo sát các pp chiết L— tetrahydropalmatin trong dược liệu Bình vơi và trong viên hồn Balok, chúng tơi cĩ thể rút ra một số nhận xét