Nghiên cứu triển khai và so sánh một số phương pháp định lương kháng sinh tobramycin trong chế phẩm thuốc nhỏ mắt

Điện di mao quản Capillary electrophoresis: CE là một kỹ thuật tách các chất dựa trên cơ sở sự di chuyển khác nhau của các tiểu phân chất tan trong một dung dịch điện giải có pH thích h

NGUYỄN THÀNH ĐẠT

ĩ ỉ l ' '

NGHIÊN CỨU TRIỂN KHAI VÀ s o SÁNH MỘT

Số PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG KHÁNG SINH TOBRAMYCIN TRONG CHế PHẨM

THu ố C NHỎ MẮT LUẬN VĂN THẠC s ĩ DƯỢC HỌC• • • •

Hoàn thành luận văn “Nghiên cứu triển khai và so sánh một số

phương pháp định lượng kháng sinh tobramycin trong chế phẩm thuốc

nhỏ m ắt ”, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô tại trường đại học Dược Hà Nội, những người đã truyền đạt những kiến thức làm nền tảng cho tôi thực hiện đề tài này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Trần Tử An -

Nguyên Trưởng Bộ môn Hóa phân tích trường Đại học Dưọc Hà Nội,

người đã giúp đỡ, hướng dẫn và đóng góp cho tôi những ý kiến quý báu không chỉ trong thời gian học tập và nghiên cứu tại trường mà trong thời gian tôi công tác nghiên cứu trong lĩnh vực phân tích kiếm nghiệm

Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Nguyễn Thị Thanh Phu’O’ng, người đã

nhiệt tình hướng dẫn, tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong quá trình học tập và công tác

Tôi xin chân thành cảm ơn bộ môn Phân tích - Độc chất trường Đại học Dược Hà Nội, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, Trung tâm Kiểm nghiệm Viện Dinh dưỡng đã tạo điều kiện, giúp đờ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình, các anh chị bạn bè lớp Cao học 12

và các đồng nghiệp đã luôn động viên, khích lệ, giúp đỡ tôi tận tình trong quá trình học tập, công tác và nghiên cứu khoa học của mình

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 20 tháng 1 năm 2010

Nguyễn Thành Đạt

DANH MỤC BẢNG B IÊ U

DANH MỰC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐÊ • 1

Chương 1: TỒNG QUAN 3

1.1 Cơ SỞ LÝ THUYẾT CỦA ĐIỆN DI MAO QUẢN 3

1.1.1 Nguyên tắc điện di trong mao q u ả n 3

1.1.2 Điện di mao quản vùng 12

1.1.3 Sắc ký điện động Mixen (MEKC) 13

1.1.4 ứ n g dụng của CE 15

1.1.5 Một số ưu điểm của C E 15

12 TỔNG QUAN VỀ KHÁNG SINH TOBRAMYCIN 17

1.2.1 Đặc điểm lý h ó a 17

1.2.2 Đặc điểm dược động học 18

1.2.3 Dạng thuốc và hàm lượng 18

1.2.4 Một số phương pháp định lượng tobramycin 18

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 23

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN c ứ u 23

2.2 THIẾT BỊ VÀ HÓA CHÁT 23

2.2.1 Dung môi và hóa chất 23

2.2.2 Chất chuẩn 24

2.2.3 Thiết bị, dụng c ụ 24

2.3 CÁCH PHA DUNG DỊCH 24

2.3.1 Pha dung dịch đệm 24

2.3.2 Pha các dung dịch mẫu phân tích sử dụng trong điện di mao quản 25 2.3.3 Pha các dung dịch cho định lượng tobramycin theo USP 3 0 25

2.4.1 Nội dung nghiên cứu 27

2.4.2 Phương pháp nghiên c ứ u 27

2.4.3 Phương pháp xử lý sổ liệu thống k ê 29

Chương 3: THựC NGHIỆM VÀ KẾT Q U Ả 31

3.1 XÂY DỤNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG TOBRAMYCIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN 31

3.1.1 Khảo sát, lựa chọn các điều kiện điện d i 31

3.1.2 Thẩm định chương trình điện di đã xây dựng 36

3.2 SO SÁNH CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG TOBRAMYCIN 43

3.2.1 Phương pháp sắc ký lỏng theo USP 30 43

3.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng tạo dẫn xuất sau cột với detector huỳnh q u an g 47

3.2.3 Phương pháp điện di mao quản phân tích phổ u v trực tiế p 50

3.2.4 So sánh các phương pháp 53

Chương 4: BÀN LUẬN 57

4.1 MỘT SÓ CHÚ Ý VỀ ĐIỆN DI MAO QUẢN TRONG PHÂN TÍCH KIÊM NGHIỆM 57

4.2 VỀ QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG TOBRAMYCIN BẰNG CE 59

4.3 SO SÁNH CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG TOBRAMYCIN TRONG CHÉ PHẨM NHỎ M Ắ T 60

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 62

Kết luận: 63

Đe xuất: 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO 64

CZE : Điện di mao quản vùng (Capillary Zone Electrophoresis)

CE : Điện di mao quản (Capillary Electrophoresis)

EOF : dòng điện thẩm (Electro-osmotic Flow)

HPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Perfomance Liquid

Chromatography)

M EKC : Sắc ký điện động Mixen ( Micellar Electrokinetic

Chromatography)

PA :Tinh khiết phân tích (Pure for Analysis)

RSD : Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)

SD : Độ lệch chuẩn (Standard Deviation)

STT : Số thứ tự

ƯSP : Dược điến Mỹ (The United States Pharmacopoeia)

u v : tử ngoại (Ultra violet)

Bảng 2.2: Các dung dịch đệm 24

Bảng 3.3: Bảng tổng họp kết quả phân tích với các hệ đ ệm 36

Bảng 3.4: Dãy dung dịch chuẩn trong đệm B30 37

Bảng 3.5: Kết quả khảo sát độ lặp lại (UV trực tiếp ) 38

Bảng 3.6: Chuẩn bị dãy dung dịch xác định độ đúng (UV trực tiếp) 39

Bảng 3.7: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp (UV trực tiếp) 39

Bảng 3.8: Dãy dung dịch chuẩn trong đệm I I 40

Bảng 3.9: Kết quả khảo sát độ lặp lại (UV gián tiếp) 41

Bảng 3.10: Chuẩn bị dãy dung dịch xác định độ đúng (UV gián tiế p ) 42

Bảng 3.11: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp (UV gián tiếp) 42

Bảng 3.12: Kết quả định lượng tobramycin trong chế phẩm thuốc nhỏ mắt bằng phương pháp theo USP30 45

Bảng 3.13: Kết quả định lượng tobramycin trong chế phẩm thuốc nhỏ mắt bằng phương pháp HPLC tạo dẫn xuất sau cột với detector huỳnh quang 48

Bảng 3.14: Kết quả định lượng tobramycin trong chế phẩm thuốc nhỏ mắt bằng phương pháp CE đo độ hấp thụ u v trực tiếp 51

Bảng 3.15: Kết quả định lượng tobramycin bằng phương pháp HPLC tạo dẫn xuất trước cột và phương pháp HPLC tạo dẫn xuất sau cột 53

Bảng 3.16: Kết quả định lượng tobramycin bằng phương pháp HPLC tạo dẫn xuất trước cột và phương pháp CE với detector u v trực tiếp 54

Bảng 3.17: Kết quả định lượng tobramycin bằng phương pháp HPLC tạo dẫn xuất sau cột và phương pháp CE với detector UY trực tiếp 55

Hình 1.1: Sự di chuyển của ion và phân tử trong mao quản 3

Hình 1.2: Thứ tự rửa giải trên điện di đ ồ 6

Hình 1.3: Đổi chiều EOF nhờ các chất hoạt động bề mặt cation 7

Hình 1.4: Sơ đồ hệ thống điện d i 11

Hình 1.5: Quá trình tách các chất trong CZE 12

Hình 1.6: cấu trúc của các mixen và dòng EOF trong M EKC 14

Hình 3.7: Điện di đồ Tobramycin với đệm B 15 34

Hình 3.8: Điện di đồ Tobramycin với đệm B 30 34

Hình 3.9: Điện di đồ Tobramycin với đệm 12 - Nồng độ 3mg/mL 35

Hình 3.10: Điện di đồ Tobramycin với đệm II - Nồng độ 0,06mg/mL 35

Hình 3.11: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích pic và nồng độ tobramycin (ƯY trực tiếp ) 37

Hình 3.12: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích pic và nồng độ tobramycin (UY gián tiếp) 41

Hình 3.13: sắc ký đồ của dung dịch chuẩn (theo phương pháp USP 3 0 ) 46

Hình 3.14: sắc ký đồ của dung dịch thử (theo phương pháp ƯSP 30) 46

Hình 3.15: sắc ký đồ của dung dịch chuẩn (phương pháp tạo dẫn xuất sau cột với detector huỳnh q u a n g ) 49

Hình 3.16: sắc ký đồ của dung dịch thử (phương pháp tạo dẫn xuất sau cột với detector huỳnh quang) 49

Hình 3.17: sắc ký đồ của dung dịch chuẩn (phương pháp CE với detector u v trực tiếp) 52

Hình 3.18: sắc ký đồ của dung dịch thử (phương pháp CE với detector u v trực tiếp) 52

Hình 3.19: Cơ chế phổ u v gián tiế p 59

ĐẶT VẤN ĐÈ•

Thuốc kháng sinh là một trong những loại dược phẩm chiếm tỷ trọng cao trên thị trường thế giới Đặc biệt, nước ta nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa kèm theo điều kiện vệ sinh môi trường chưa tốt nên các bệnh nhiễm khuẩn phát triển mạnh Vì vậy có tới 40% các đơn thuốc được kê có kháng sinh Với tỷ lệ sử dụng kháng sinh nhiều như vậy, việc giám sát và kiểm tra chất lượng thuốc kháng sinh là một vấn đề hết sức quan trọng góp phần nâng cao chất lượng khám chữa bệnh, giảm nguy cơ kháng thuốc của các vi khuẩn gây bệnh

Nhóm aminoglycosid trong đó có tobramycin hiện nay được sử dụng rất nhiều và đã được đưa vào danh mục thuốc thiết yếu sử dụng cho các cơ sở khám chữa bệnh và danh mục thuốc kê đơn do Bộ Y tế ban hành Hiện nay trong nhiều dược điển [4][19][30], định lượng các kháng sinh nhóm aminoglycosid chủ yếu là phương pháp vi sinh vật Tuy nhiên phương pháp này có một nhược điểm là không đặc hiệu cho từng kháng sinh Một sổ dược điển nước ngoài và các tài liệu nghiên cứu [12] [20] [21] [31] đã sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao để định lượng các aminoglycosid Các phương pháp này hoặc là sử dụng tạo dẫn xuất trước cột với detector u v hoặc là sử dụng tạo dẫn xuất sau cột với detector huỳnh quang

Điện di mao quản (Capillary electrophoresis: CE ) là một kỹ thuật tách các chất dựa trên cơ sở sự di chuyển khác nhau của các tiểu phân chất tan trong một dung dịch điện giải có pH thích hợp, chứa trong mao quản dưới tác dụng của một điện trường E do một điện áp V đặt tại hai đầu mao quản sinh

ra [13] Cùng với sự phát triển của nhiều thiết bị phân tích hiện đại và chính xác, kỹ thuật tách này đã được phát triển và dần hoàn thiện để có khả năng ứng dụng ngang bằng với kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Kỹ

thuật CE được phát triển và đưa vào ứng dụng trong phân tích, đặc biệt trong lĩnh vực y và sinh học Điện di mao quản bước đầu đã được nghiên cứu như một kỹ thuật tách tiên tiến để kiểm nghiệm dược phẩm, là kỹ thuật rất hữu ích

để thay thế hoặc hỗ trợ kỹ thuật sắc ký lỏng trong nhiều lĩnh vực phân tích bởi

có độ phân giải cao, phát hiện được ở bước sóng u v ngắn nhằm tránh được ảnh hưởng của dung môi hữu cơ Hơn nữa trong kỹ thuật này sử dụng dung môi hữu cơ với tỷ lệ nhỏ nên giá thành phân tích thấp hơn và ít độc hại hơn

kỹ thuật HPLC Trong ngành Dược, kỹ thuật CE đã được dùng để thử tạp chất liên quan trong chuyên luận Levocabastine hydrochlorid, phương pháp CZE

để định tính Erythropoietin trong dung dịch đậm đặc Chuyên luận chung về

CE đã quy định trong Dược điển Mỹ USP [31], Dược điển Anh BP 2001, Dược điển Trung Quốc PRC 2000 và đã được đưa vào Dược điển Việt Nam

IV Kỹ thuật điện di mao quản chưa được nghiên cứu nhiều, kinh nghiệm trong phân tích còn hạn chế, vì vậy nghiên cứu để sử dụng có hiệu quả kỹ thuật này là rất cần thiết

Chúng tôi nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu triển khai và so sánh một

số phương pháp định lượng kháng sinh tobramycin trong chế phẩm thuốc nhỏ mắt” nhằm 2 mục tiêu:

1 Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng tobramycin trong chế phẩm thuốc nhỏ mắt bằng phương pháp điện di mao quản

2 So sánh một số phương pháp định lượng kháng sinh tobramycin trong chế phẩm thuốc nhỏ mắt

CHƯƠNG 1:

TỎNG QUAN

1.1.1 Nguyên tắc điện di trong mao quản: [9] [16] [17] [22] [24]

Điện di mao quản là một kỹ thuật tách phân tích được Việt hoá từ thuật

ngữ Capillary Electrophoresis, thường được gọi tắt là CE.

Nguyên tắc của quá trình tách trong điện di mao quản là dựa trên cơ sở tính chất điện di khác nhau của các phần tử chất tan Quá trình này xẩy ra trong mao quản trên nền của dung dịch chất điện ly có pH thích họp, dưới tác dụng của một điện trường E xác định đặt vào hai đầu mao quản

Cơ chế điện di là sự di chuyển của các phần tử chất tan trong mao quản

dưới tác dụng của lực điện trường nhất định {Electric Field Force, được viết

tắt là EFF) và tính chất của dòng điện thẩm (Electro-Osmotic Flow, được

viết tắt là EOF). EOF là dòng chảy khối của chất lỏng trong mao quản Nó

có quan hệ mật thiết với lớp điện tích trên thành mao quản EOF sẽ quyết định thời gian tồn tại của chất tan trong mao quản Nó tồn tại bao trùm lên dòng di chuyển của chất tan, nghĩa là chất tan di chuyển trong dòng này

Hình 1.1 - Sự di chuyển của ion và phân tử trong mao quản

Thế tạo ra điện trường E đặt vào hai đầu mao quản được dùng trong kỹ

thuật CE là rất lớn, thông thường từ 1 0 - 3 0 kv Chính lực điện trường này làm động lực cho các phần tử chất tan di chuyển theo một hướng nhất định và các chất có điện tích và kích thước khác nhau sẽ di chuyển với các tốc độ khác nhau dưới tác dụng của điện trường Do đó tạo nên quá trình tách của các chất phân tích.

Mao quản sử dụng trong CE thường có độ dài từ 25 đến 100 cm, đường kính trong (id) 25 - 100 |xm Loại mao quản có đường kính trong khoảng 50 - 75um là thích họp nhất vì hiệu ứng nhiệt nhỏ, dễ khống chế nhiệt độ mao quản Mao quản được chế tạo từ nhiều vật liệu khác nhau, nhưng phổ biến

nhất là silica nóng chảy {fused silica) Trên thực tế hầu hết các nghiên cứu đã

thực hiện bằng CE cho tới nay đều tiến hành trên loại mao quản này Đây cũng là loại mao quản chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu của mình Do đó trong phần tiếp theo sẽ trình bày kỹ hơn cơ chế của quá trình điện di xảy ra với mao quản silica nóng chảy

1.1.1.1 Dòng điện thẩm:

Dòng điện thẩm (EOF) được Việt hoá từ thuật ngữ Electro-osmotic flow hoặc Electroendosmotic flow Trong CE dòng điện thẩm EOF là một thành phần cơ bản tạo nên sự di chuyển của toàn bộ dung dịch trong mao quản bắt nguồn từ điện tích bề mặt của thành trong mao quản

♦♦♦ Nguồn gốc EOF:

Khi điện di với mao quản silica, các nhóm silanol (SiOH) ở trên thành mao quản sẽ giải phóng ra H+ vào dung dịch và bề mặt thành mao quản sẽ mang điện tích âm Quá trình giải phóng H+ phụ thuộc vào hằng số cân bằng

K Với mao quản silica, khó xác định chính xác trị sổ K, nhưng thực nghiệm chỉ rõ dòng EOF có giá trị đáng kể khi pH dung dịch trên 4 Các vật liệu không ion hoá như Teflon dùng làm mao quản cũng cho dòng EOF vì nó hấp phụ các anion

Vì bề mặt thành trong mao quản mang điện tích âm, nên đối ion (chủ

yếu là cation) do lực hút tĩnh điện sẽ tạo thành một lớp điện kép để cân bằng

điện tích và tạo nên một hiệu điện thế ở vùng sát thành mao quản gọi là thế

Zeta (Q Khi áp thế vào mao quản, các cation trong lớp điện kép khuếch tán

sẽ di chuyển về phía catod Nhưng các cation này bị solvat hoá nên kéo theo

cả khối dung dịch trong mao quản về catod Sự di chuyển của khối dung dịch

trong mao quản silica dưới tác dụng của điện trường gọi là dòng điện thấm

EOF

Thế Zeta C, được xác định chủ yếu bằng điện tích bề mặt của thành mao

quản Điện tích phụ thuộc vào pH, vì vậy trị số EOF thay đổi theo pH Ở pH

càng cao, các nhóm silanol mất proton H+ càng nhiều nên trị số dòng EOF

càng lớn Phụ thuộc vào điều kiện điện di cụ thể, với pH trong khoảng 2-12

dòng EOF có thể thay đổi

Ngoài pH dung dịch điện di, dòng EOF sẽ thay đổi khi:

- Lực ion của dung dịch tăng lên, làm giảm thế Zeta nên dòng EOF

giảm

- Trong một số trường hợp dung dịch đệm nước có thêm một số dung

môi hữu cơ như methanol, acetonitril (để hoà tan chất phân tích), hằng số điện

môi của dung dịch điện di giảm xuống nên làm giảm dòng EOF

♦♦♦ Hai đặc điểm của EOF:

* Đặc điểm đầu tiên của dòng EOF là tạo nên một dòng chuyển khối

phẳng trong mao quản Bởi vì lực tạo ra sự di chuyển của EOF phân bố đồng

nhất dọc theo mao quản, cho nên không có sụt áp trong mao quản: dòng đồng

nhất từ đầu này đến đầu kia của mao quản

Tuy nhiên tính chất tạo dòng chuyển khối phẳng của dung dịch điện di

chỉ xuất hiện khi đường kính trong mao quản (dị) dưới 200 Ịim Neu đường

kính trong của mao quản vượt quá xa 200 |im thì sức căng bề mặt không đủ

tạo ra sự di chuyển đồng nhất giữa phần chất lỏng ở giữa và ở gần thành mao quản.

* Đặc điểm th ứ hai của dòng EOF là đưa tất cả các tiểu phân có mặt

trong dung dịch điện di (bất kể có điện tích hay không) di chuyển theo cùng một hướng Với điều kiện thông thường (thành mao quản tích điện âm), dòng này di chuyển về catod Các anion cũng sẽ di chuyển về phía catod vì tốc độ EOF lớn hơn nhiều so với tốc độ điện di

Cation di chuyển nhanh nhất do lực điện di và EOF cùng hướng, tiếp theo là các chất không mang điện tích di chuyển theo EOF nhưng không tách khỏi nhau được Cuối cùng là anion Trên điện di đồ thứ tự rửa giải theo thời gian như sau: cation có điện tích lớn kích thước nhỏ ra trước nhất, anion có điện tích lớn và kích thước nhỏ ra cuối cùng

+ +

Hình 1.2 - Thứ tự rửa giải trên điện di đồ

♦♦♦ Kiểm soát EOF:

EOF là một trong các thông số cơ bản quyết định quá trình điện di, vì vậy cần phải được kiểm soát Ở pH cao, EOF có thể quá lớn làm cho quá trình rửa giải các chất khỏi mao quản xẩy ra quá nhanh khi chưa kịp tách khỏi nhau Ngược lại ở pH thấp, thành mao quản mang điện tích âm có thể hấp phụ cation nhờ lực hút tĩnh điện

Đe kiểm soát dòng điện thẩm người ta thường tìm cách thay đổi điện tích bề mặt mao quản hoặc độ nhớt của dung dịch điện di Có thể thống kê một số yếu tố làm tăng EOF:

- Tăng thế áp vào hai đầu mao quản

- Tăng pH của dung dịch điện di (trong khoảng 2-12)

- Tăng nhiệt độ điện di.

- Giảm nồng độ các chất trong dung dịch (giảm lực ion)

Ngoài ra thay đổi thành mao quản có thể gây ra giảm, loại trừ hoặc đổi chiều của EOF Trên hình 1.2 mô tả rửa giải theo thử tự: cation, các chất trung hoà, cuối cùng anion Nếu bây giờ cần phân tích anion, thời gian rửa giải có thể giảm xuống bằng cách đổi chiều EOF hoặc đổi cực của thế áp mao quản Thứ tự rửa giải sẽ là: anion, các chất trung hoà, rồi đến cation

Để làm đổi chiều EOF, người ta thường thêm vào dung dịch một muối alkyl amoni bậc 4 như cetyl trimetyl amoni bromid (CTAB) hoặc clorid (CTAC), tetradecyl trimetyl amoni bromid (TTAB) Ngoài ra có thể dùng dietylen triamin (DETA) [22] Đầu mang điện tích dương của muối này sẽ hút các anion của dung dịch Các anion hydrat hoá này sẽ di chuyển về phía anod kéo toàn bộ khối dung dịch trong mao quản đi theo, tạo ra EOF di chuyển về phía anod

m 'O O O Ọ < JO Ọ Q O Q O :Q Ọ O O O O O O ^

Hình 1.3 - Đỏi chiều EOF nhờ các chất hoạt động bề mặt cation

1.1.1.2 Các thông số phân tích của CE:

❖ Thời gian di chuyến immigration times):

Thời gian cần thiết để một chất tan di chuyển từ khi đưa vào mao quản

đến thời điểm được phát hiện bởi detector được gọi là thời gian di chuyển tM.

Quãng đường di chuyển là chiều dài hiệu dụng của mao quản Đó là độ dài từ điểm tiêm mẫu đến điểm phát hiện Tốc độ di chuyển gồm hai thành phần:

- Tốc độ điện di của ion:

J T - L

Vep = Mep-E = M ep- J

- Tốc độ điện thẩm, tốc độ EOF:

r - v

Veo =Meo-E =Meo-1ỵ

Thời gian di chuyển của ion chất tan sẽ là:

M ~ % + Veo ~ (Mep + Meo)-E ~ ÌMep +Meo)-V

trong đó: /: chiều dài hiệu dụng của mao quản (cm)

V : thế áp vào 2 đầu mao quản có chiều dài là / (cm).

I^ep+ M-eo= Ha: linh độ biểu kiến

❖ Tốc độ di chuyển:

Tốc độ di chuyển của một ion Vi được xác định bằng:

V, =Mep-E

fiep : linh độ điện di của ion chất tan (cm2/(V.s))

E : cường độ điện trường (V/cm)

Linh độ Ịiep là cơ sở tách bằng điện di, phụ thuộc vào nhiều yếu tố của môi trường điện di, thế hiện ở:

- Lực điện Fe gây ra sự chuyển động của các ion:

Fe= q.E

- Lực ma sát của môi trường điện di cho ion dạng hình cầu:

F f = - 6 71 r\ ĩị Vị

trong đó: T|: độ nhớt của dung dịch trong mao quản.

ĩj và Vji bán kính và tốc độ di chuyển của ion

dấu (-) thể hiện lực Ff ngược chiều với Fe (qui ước lấy dấu +) Quá trình điện di đạt trạng thái ổn định khi hai lực trên (Fevà Ff) bằng

Theo cơ chế, bản chất và đặc điểm của quá trình tách trong mao quản

mà người ta thường phân chia thành các loại hay các kiểu khác nhau như trong bảng 1.1:

Bảng 1.1 - M ột số kiểu điện di và cơ chế tách

1 Điện di mao quản vùng CZE (capillary

4 Điện săc ký mao quản CEC (capillary

❖ Nhiêt đô:

Ảnh hưởng chính của nhiệt độ là làm thay đổi vận tốc và độ dẫn điện của đệm Trong một số trường hợp nếu nhiệt độ trong mao quản tăng là nguyên nhân làm thay đổi cấu tạo của protein, làm thay đổi thời gian điện di

và hiệu quả phân tích

❖ Côt mao quản:

Kích thước của cột mao quản (chiều dài và đường kính) ảnh hưởng đến thời gian tách và hiệu quả phân tích Nếu tăng cả hai yếu tố là chiều dài hiệu dụng và chiều dài cột mao quản có thể làm giảm điện trường và tăng thời gian phân tích

❖ Dung dịch đệm:

• Loại đệm và nồng độ: Đệm thích họp cho CE là đệm có tác dụng tốt

nhất trong dẫy đệm đã chọn và giảm thấp nhất sự sinh nhiệt trong đệm

• pH: pH của đệm có thể tác dụng lên khả năng phân tích và làm thay đổi EOF Tăng pH của đệm thường làm tăng EOF

• Dung môi hữu cơ: Dung môi hữu cơ có thể làm tăng khả năng tan của một số chất tan trong đệm Khi thêm dung môi hữu cơ vào trong đệm thường

làm giảm EOF.

1.1.1.5 Thiết bị CE:

Sơ đồ một hệ thống điện di mao quản như trong hình 1.5, thường gồm các bộ phận sau:

- Bộ phận buồng điện cực, các điện cực và bình điện cực

- Nguồn cấp thế cao một chiều (10-30 kV) biến thiên được

5 Detector (DAD).

1.1.2 Điện di mao quản vừng :

1,1.2.1 Cơ sở điện di mao quản vùng:

Điện di mao quản vùng (Capillary Zone Electrophoresis - CZE) là

phương pháp phân tích cơ bản nhất của kỹ thuật CE, do tính đơn giản của cơ chế tách và tính linh hoạt của nó Phương pháp này có phạm vi ứng dụng rộng trong việc tách và phân tích nhiều loại hợp chất khác nhau có khả năng ion hoá Đây là phương pháp tách dựa trên sự di chuyển của chất tan có điện tích trong điện trường với tốc độ khác nhau tuỳ thuộc vào linh độ điện di của chúng Linh độ điện di là đại lượng phụ thuộc vào điện tích ion, chính xác hơn là tỷ lệ giữa điện tích và khối lượng của ion, bán kính của ion, trạng thái của ion như mức độ ion hoá, trạng thái liên kết với các đổi ion Do đó linh độ điện di phụ thuộc vào hằng sổ điện môi, pH, độ nhớt của dung dịch Khi ta đặt một điện áp cao vào hai đầu của mao quản, các tiểu phân tích điện sẽ bắt đầu di chuyển, tất nhiên là về phía điện cực trái dấu Các ion có độ linh động điện di cao hom sẽ di chuyển nhanh hơn, hình thành các vùng có các ion với độ linh động điện di tương tự nhau Mặt khác khi đặt một điện áp cao vào hai đầu của mao quản, ở một vùng pH đủ lớn, sẽ hình thành một dòng điện thẩm

Hình 1.5 - Quá trình tách các chất trong CZE

Trong mao quản silica dòng này hướng về phía cực âm (catod) Do các ion dương có cùng hướng với dòng này cho nên tốc độ được tăng thêm, các ion âm do không cùng hướng với dòng điện thẩm cho nên di chuyển chậm lại

và nếu không vượt được nó thì cũng bị cuốn đi về phía cực âm Các phân tử không tích điện sẽ di chuyển cùng tốc độ với dòng điện thẩm.

CZE là mô hình phân tích đơn giản nhất của CE Hệ thống phân tích CZE cũng chính là cơ sở xuất phát cho các kỹ thuật CE khác Từ xuất phát điểm là một mao quản với một dung dịch đệm nhất định (hay còn gọi là dung

dịch điện ly nền - Background Electrolyte Solution), người sử dụng chỉ cần thêm vào một hay nhiều chất phụ gia (modifier) thích hợp là có thể chuyển

sang các kỹ thuật điện di khác Tùy thuộc vào chất phụ thêm vào có nhiều kỹ thuật CE khác nhau

1.1.2.2 ửng dụng của C Z E :

Hiện nay CZE đã được ứng dụng tương đối nhiều trong lĩnh vực sinh-y học, đặc biệt là lĩnh vực tách và phân tích các chất peptid, protein, các amino acid và glycoprotein

1.1.3 Sắc ký điện động mixen (MEKC): [9] [13] [17] [24]

1.1.3.1 Cơ sở sắc kỷ điện động mixen:

Bản chất và trung tâm của sự tách ở đây là sự hình thành các phần tử mixen trong mao quản và các tiểu phân này sẽ dẫn dắt đóng góp thêm khả năng của quá trình tách các chất trên nền của dung dịch chất đệm và chất điện

ly của quá trình điện di Sự tách của các phân tử chất tan trung hoà bằng kỹ thuật MEKC là được điều chỉnh bởi các chất hoạt động bề mặt trong dung dịch đệm điện di Khi nồng độ chất hoạt động bề mặt cao hơn nồng độ ngưỡng của mixen (chuẩn giới hạn hình thành mixen, CMC: Critial Micellarary Concentration) Ví dụ CMC = 9 mM đối với SDS (Natri Dodecyl Sulfat), các phân tử chất diện hoạt sẽ sắp xếp lại thành các tập hợp được gọi là tiểu phân mixen, trong đó phần thân nước của phân tử chất diện hoạt sẽ hướng ra ngoài dung dịch điện ly nền tạo ra phần ngoài ưa nước của mixen, phần thân dầu của phân tử chất diện hoạt hướng vào trong tạo ra phần lõi kỵ

nước của mixen.

Nếu ái lực giữa chất phân tích và lõi kỵ nước của mixen đủ lớn, chất phân tích sẽ được phân bổ giữa dung dịch điện ly nền và mixen với một hằng

số phân bổ Ki xác định Quá trình tách trong MEKC là kết quả tổng hợp của 2 quá trình: quá trình điện di và quá trình phân bố của chất phân tích giữa dung dịch điện ly nền và mixen chất diện hoạt

Hình 1 6 - Cấu trúc của các mixen và dòng EOF trong MEKC

Sự có mặt của quá trình thứ 2 là yếu tố chủ yếu làm tăng khả năng phân tách của MEKC so với CZE Hai phân tử có cùng linh độ điện di sẽ không tách được bằng CZE, nhưng nếu ái lực của chúng với mixen chất diện hoạt khác nhau đáng kể, chúng có thể được tách riêng bằng MEKC Độ chọn lọc của hệ pha MEKC có thể thay đổi được thông qua việc thay đổi nồng độ mixen, thay đổi pH của dung dịch đệm, việc thêm các chất phụ gia, thêm dung môi hữu cơ thích họp vào trong hệ pha của MEKC

Các chất hoạt động bề mặt có thể dùng ở đây như các chất loại cation (DTAB), loại anion (SDS), các chất ion kép (CHAPS, CHAPSO), loại không ion hoá (Octyglucoside, n-Dodecyl-P-D-maltoside ) hay là dùng hỗn hợp của chúng với nhau

1.1.3.2 ửng dụng của MEKC:

Phương pháp MEKC được sử dụng để tách cả các chất mang điện tích

và các chất không mang điện tích Phương pháp này cũng được sử dụng tốt

để tách và phân tích các chất amino acid, các chất họ nucleotid, các loại vitamin, các chất loại hydrocarbon thơm, các dược phẩm và hợp chất sinh học

1.1.4 ứ ng dụng của CE.

Điện di mao quản có khả năng ứng dụng rộng rãi trong phân tích, có thể phân tích các chất vô cơ và hữu cơ Nó được dùng trong kiểm nghiệm dược phẩm, môi trường, hóa nước, phân tích các acid amin

Trong lĩnh vực phân tích dược phẩm, CE được dùng để phân tích những mẫu phức tạp nhiều thành phần, khó tách (tạp liên quan, chất phân hủy), tách đồng phân đối quang, dịch sinh học và dược liệu [22]

1.1.4.1.Định tính: [9][22][31]

Dựa vào thời gian dịch chuyển của chất phân tích trong quá trình điện

di của mẫu đối chiếu và mẫu thử trong cùng một điều kiện Thời gian di chuyển (tM) của mẫu thử phải trùng với thời gian di chuyển của chất đó trong mẫu chuẩn Khả năng định tính được nâng cao nếu dùng detector DAD hoặc kết nối với MS

1.1.4.2.Xác định tạp chất

Tạp chất trong nguyên liệu thuốc và chế phẩm thuốc trong dạng bào chế khác nhau (tạp liên quan, chất phân hủy), thường có cấu trúc, tính chất tương tự chất phân tích và ở nồng độ rất thấp [22] Trước đây, các phương pháp phân tích hay được sử dụng để xác định tạp chất là: TLC, HPLC

1.1.43 Tách đồng phân đổi quang.

Cho thuốc thử chọn lọc đối quang vào dung dịch điện di, thuốc thử này sẽ kết họp với đồng phân tạo thành phức chất và khi tách bằng điện di thì

hai đồng phân tách ra khỏi nhau [22] Việc tách đồng phân đối quang rất quan trọng trong trường hợp một trong hai đối quang không có tác dụng sinh học hoặc có thể gây độc

1.1.4.4.Định lượng [22][25][31J

Nguyên tắc: Nồng độ c của chất phân tích tỷ lệ với diện tích A (hoặc chiều cao h) pic của nó Có 4 phương pháp:

- Phương pháp chuẩn ngoại

- Phương pháp chuẩn nội

- Phương pháp thêm chuẩn

- Phương pháp chuẩn hóa điện tích

1.1.5 Môt số ưu điểm của CE:

Điện di mao quản có một số ưu điểm sau:

- Có hiệu lực tách các chất rất cao trong mao quản chế tạo bằng silica nung chảy hay ống Teflon (có đường kính trong 25-lOO^im) sổ đĩa lý thuyết N của cột tách rất lớn, thông thường N từ 105 đến 106 nên cho kết quả tách tốt những hợp chất phức tạp

- Thời gian tách ngắn hơn so với các loại sắc ký HPLC trên cùng loại đối tượng mẫu

- Lượng (thể tích) mẫu cần là rất nhỏ, thường là từ 5-50r|L cho một lần bơm mẫu vào cột tách

- Có nhiều kiểu tách theo CE, nên khả năng ứng dụng thực tế rất rộng rãi và đa dạng

- Quá trình tách được thực hiện chủ yểu trong môi trường nước với sự

có mặt của chất điện ly nên không tốn nhiều dung môi hữu cơ và rất kinh tế

- Quá trình phân tích không phức tạp (tương tự như trong HPLC)

- Có khả năng tự động hóa trong tách và phân tích hàng loạt

Tuy nhiên do đặt một điện thế cao vào hai đầu mao quản do đó sinh ra hiệu ứng nhiệt Joule dẫn đến sự giãn rộng pic Vì vậy phải khổng chế nhiệt độ của mao quản để đảm bảo thu được kết quả phân tích tốt nhất.

Tobramycin là kháng sinh thuộc nhóm aminoglycosid được điều chế

từ môi trường nuôi cấy Streptomyces tenebrarius hoặc có thể bán tổng họp từ

kanamycin

1.2.1 Đặc điểm lý hóa

1.2.1.1 Công thức phân tử: C18H37N5O9

1.2.1.2 Khối lượng phân tử: 467,5

OH

1.2.1.4 Tên khoa học: 4-0-(3-Amino-3-deoxy-a-D-glucopyranosyl)-2-

deoxy-6-0-(2,6-diamino-2,3,6-trideoxy-a-D-ribo-hexopyranosyl'>-L5- »

- Thân nước do phần đường; tính base do có các nhóm amin

- Tạo muối với acid, trong đó dạng muối sulfat dễ tan trong nước nhất

- Dạng muối sulfat dễ tan trong nước, rất khó tan trong ethanol 96%, thực tế không tan trong chloroform và ether

streptamine

I.2.I.5 Một số tính chất lý hóa:

- Bột trắng hoặc trắng ngà

- Dạng base tan cả trong nước và trong dung môi hữu cơ ở mức độ khác nhau.

- Góc quay cực riêng [ar]ổ° từ +138° đến + 148°

- Ben ở pH gần trung tính, ngay cả khi đun sôi; bị thủy phân chậm trong

pH acid, kèm giảm hiệu lực kháng khuấn

- Tạo phức màu tím với ninhydrin (như acid amin) Phản ứng này được dùng để định tính sơ bộ các aminosid

1.2.2 Đặc điểm dược động học:

Tobramycin gần như không qua được màng nhầy niêm mạc ruột nên không hấp thu ở đường tiêu hóa Như vậy khi điều trị nhiễm khuẩn toàn thân thì phải tiêm; còn nếu chống nhiễm khuẩn một thì thuận lợi Sau khi tiêm thuốc khuyếch tán nhanh tới các mô; bài xuất chủ yếu qua đường thận-nước tiểu

1.2.3 Dạng thuốc và hàm lượng:

Thuốc không hấp thu qua đường uống, thường được dùng dưới cácdạng:

- Thuốc nhỏ mắt: dung dịch tobramycin 0,3 %

- Thuốc mỡ tra mắt: hàm lượng 0,3 %

- Thuốc tiêm: lọ 20 mg/2 mL; 60 mg/6 mL; 80 mg/8 mL; 1,2 g/30 mL

1.2.4 M ôt số phư ơng pháp đinh lương tobram ycin:

Việc định lượng các chế phẩm tobramycin chủ yếu là xác định hoạt lực tổng hợp bằng phương pháp vi sinh Định lượng bằng phương pháp hoá học và hoá lý gặp nhiều khó khăn Phương pháp HPLC cần phải dẫn xuất hoá trước cột Có thể định lượng giới hạn sulfat bằng phương pháp complexon, qua dung dịch BaCỈ2 chuẩn quá thừa tạo kết tủa BaSƠ4 Tuy nhiên đây là phương pháp định lượng không đặc hiệu:

B a2+ + SO42' -> i B aS04

Trong các chế phẩm đa thành phần (kết hợp với các dược chất khác: thuốc tra mắt, kem bôi ngoài da ) tobramycin được định lượng bằng phương pháp vi sinh vật và HPLC.

Phương pháp CE chưa được nghiên cứu nhiều để định lượng các kháng sinh aminoglycosid trong các chế phẩm và trong dịch sinh học Trên thể giới hiện đã có một số công trình nghiên cứu định lượng kháng sinh aminoglycosid bằng CE [23] Ở Việt Nam hiện nay chưa có công trình nghiên cứu nào sử dụng phương pháp CE để định lượng kháng sinh tobramycin

1.2.4.1 Phương pháp vi sinh vật [30]

- Nguyên tắc: tobramycin khuyếch tán vào môi trường dung dịch đặc đã

cấy vi sinh vật chỉ thị, tạo ra các vòng ức chế vi sinh vật có đường kính tỷ lệ thuận với logarit nồng độ tương ứng Hoạt lực của chất thử được so sánh với chất chuẩn theo phương pháp thống kê

- Một số tài liệu sử dụng phương pháp này để định lượng tobramycin:

o Môi trường định lượng:

10 IU/mL; 20 IU/mL; 40 IU/mL

o Dung dịch thử: hút chính xác 5,0 mL chế phẩm (tương ứng với khoảng l,5mg tobramycin) pha loãng bằng dung dịch đệm phosphat pH 8,0 để được các dung dịch thử tobramycin có nồng

độ khoảng 10 IƯ/mL; 20 IU/mL; 40 IU/mL

o Tiến hành thử nghiệm và tính toán kết quả theo phương pháp xác định hoạt lực thuốc kháng sinh bằng phương pháp thử vi sinh vật (Dược điển Việt Nam III - phụ lục 10.10)

1.2.4.2 Phương pháp sắc kỷ lỏng hiệu năng cao

a Sử dụng detector u v tạo dẫn xuất hóa trước cột - chương trình 1 [21]

- Cột: Puropher® STAR RP-18e (150 X 4 mm; 3 ịim)

- Pha động: acetonitril : nước (50 : 50)

- Detector ƯV-VIS: bước sóng 340 nm.

- Thể tích tiêm: 20 I^L

- Dung dịch chuẩn và dung dịch thử: các dung dịch có nồng độ khoảng 0,02 mg/mL trong đêm phosphat pH 7,4

c Sử dụng detector điện hỏa tạo dẫn xuất sau cột [19]

- Cột styren-divinylbenzen copolymer (250 mm X 4,6 mm; 8 |Lim)

d Sử dụng detector huỳnh quang tạo dẫn xuất sau cột[12]

- Cột RP 18 Brava ODS (150 X 4,6 mm; 5 |Lim)

- Pha động: hòa tan 17,75 g natri sulfat; 3,05 g natri pentansulfonat và1,0 mL acid acetic băng trong 1000 mL nước

- Tốc độ dòng: 1 mL/phút

- Dung dịch tạo dẫn xuất sau cột: hòa tan 0,5 g o-phthalaldehyd trong

140 mL methanol, thêm 1,0 mL 2-mercaptoethanol, lắc trong 3 phút Thêm 1,5 mL dung dịch polyoxyethylen lauryl ether 12% và 350 mL dung dịch đệm borat pH 10,4

- Dung dịch đệm borat pH 10,4: hòa tan 24,64 g acid boric trong 900

mL nước Điều chỉnh tới pH 10,4 bằng dung dịch natrỉ hydroxyd 40%, thêm nước vừa đủ 1000 mL, lắc đều

- Detector: detector huỳnh quang Ex/Em = 338 nm/455 nm

- Thể tích tiêm: 20 I^L

- Dung dịch chuẩn và dung dịch thử: pha các dung dịch có nồng độ khoảng 12 |ag/mL trong pha động

Một số tạp chí khoa học nước ngoài đã công bố các nghiên cứu định lượng tobramycin bằng phương pháp điện di mao quản tạo dẫn xuất trước cột

và phát hiện bằng detector u v [25]; dung dịch điện ly nền là hỗn họp natritetraborat 30 mM (pH 10,2): acetonitril (75:25)

CHƯƠNG 2:

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN c ứ u

- Thuốc nhỏ mắt Tobramycin 0,3 % của công ty cổ phần Traphaco số

2.2.1 Dung môi và hóa chất

- Methanol tinh khiết HPLC (MERCK)

- Natri pentansulfonat tinh khiết HPLC (MERCK)

- Natri tetraborat tinh khiết HPLC (MERCK)

- Imidazol tinh khiết phân tích (MERCK)

- Acid boric tinh khiết phân tích (MERCK)

- Natri hydroxyd tinh khiết phân tích (MERCK)

- O-phthalaldehyd (OPA) tinh khiết phân tích

- Mercaptoethanol tinh khiết phân tích

- Polyoxyethylen lauryl ether tinh khiết phân tích

- Natri sulfat khan tinh khiết phân tích (MERCK)

- Acid acetic tinh khiết HPLC (MERCK)

- Tris(hydroxymethyl)aminomethan tinh khiết HPLC (SIGMA)

- 2,4-dinitrofluorobenzen tinh khiết (SIGMA)

- Acetonitril tinh khiết HPLC (MERCK)

: 15,0 mg : 0,5 mg : 45,0 mg : vđ 5,0 mL

- Nước siêu tinh khiết (được lọc qua máy tạo nước siêu sạch Sartorius)

2.2.2 Chất chuẩn:

Chất chuẩn tobramycin (Ci8H37N50 9) ; SKS: 0103167 , được sản xuất tại Viện Kiểm nghiệm Thuốc trung ương (Hàm lượng nguyên trạng : 949,64jxg/mg)

2.2.3 Thiết b ị , dụng cụ

- Máy điện di mao quản Agilent CE system

- Máy HPLC với detector huỳnh quang và bộ phản ứng tạo dẫn xuất sau cột

- Máy HPLC Shimadzu lOAVvp detector UV-VIS

- Máy lắc siêu âm Branson 1210

- Máy đo pH Metrohm 682

- Bộ lọc dung môi, lọc mẫu với màng lọc 0,45 Ịj,m

- Cân phân tích Mettler Toledo AB-204S có độ chính xác ±0,1 mg

- Các dụng cụ thủy tinh chính xác : bình định mức; pipet chính xác; ống đong

2.3.1 Pha dung dịch đệm

Bảng 2.2: Các dung dịch đệm

1 Borat 15 mM B15 Cân 0,572 g natri tetraborat, hoà tan

hoàn toàn trong nước Thêm nước vừa

đủ 100 mL Lọc qua màng lọc 0,2 Ịim

2 Borat 30 mM B30 Cân 0,572 g natri tetraborat, hoà tan

hoàn toàn trong nước Thêm nước vừa

đủ 50 mL Lọc qua màng lọc 0,2 |j,m

3 Dung dịch imidazol

0,02 M

12 Cân 0,68 g imidazol, hoà tan hoàn

toàn trong nước Thêm nước vừa đủ

100 mL Hút chính xác 20 mL dung dịch trên, thêm nước vừa đủ 100 mL Lọc qua màng lọc 0,2 |im

4 Dung dịch imidazol

0,01 M

11 Cân 0,68 g imidazol, hoà tan hoàn

toàn trong nước Thêm nước vừa đủ

100 mL Hút chính xác 10 mL dung dịch trên, thêm nước vừa đủ 100 mL Lọc qua màng lọc 0,2 |Lim.

2.3.2 Pha các dung dịch mẫu phân tích sử dụng trong điện di mao quản

Dung dịch mẹ: cân chính xác khoảng 0,3 g tobramycin, hòa tan trong nước vừa đủ lOOmL thu được dung dịch có nồng độ khoảng 3 mg/mL

Các dung dịch phân tích: Pha loãng dung dịch mẹ bằng các dung dịch đệm, thu được các dung dịch phân tích có nồng độ tương ứng khoảng 0,03 mg/mL; 0,06 mg/mL; 0,15 mg/mL

2.3.3 Pha các dung dịch cho định lượng tobramycin theo USP 30

- Pha động :Hòa tan 2,0 g tris(hydroxymethyl)aminomethan trong khoảng 800 mL nước.Thêm vào dung dịch này 20 mL dung dịch acid sulfuric 1 N ,sau đó pha loãng bằng acetonitril tới 2000 mL , lắc đều

Để nguội rồi lọc qua màng lọc 0,2 ịim

- Thuốc thử 2,4-dinitrofluorobezen: Dung dịch 2,4-dinitrofluorobenzen 1% trong ethanol 96%

- Thuốc thử tris(hydroxymethyl)aminomethan :Pha dung dịch gốc tris(hydroxymethyl)aminomethan 1,5% trong nước Chuyến 40 mL dung dịch thử gốc này vào bình định mức 200 mL Bo sung dimethyl

sulfoxid đến vạch bằng cách thêm từ từ dimethyl sulfoxid, vừa thêm vừa lắc đều.

- Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 33,0 mg tobramycin chuẩn cho vào bình định mức 50 mL, thêm 20 mL nước và 1 mL dung dịch acid sulfuric 1 N (TT), lắc đều Thêm nước đủ thể tích, trộn đều Hút10,0 mL dung dịch trên cho vào bình định mức 50 mL, thêm nước cho

đủ thể tích, trộn đều thu được dung dịch chuẩn có nồng độ khoảng 0,132 mg/mL

- Dung dịch thử: Hút chính xác một lượng chế phẩm chứa khoảng 6 mg tobramycin cho vào bình định mức 50 mL, thêm nước cho đủ thể tích, trộn đều

2.3.4 Pha các dung dịch cho định lượng tobramycin bằng phưoìig pháp

HPLC tao dẫn chất hóa sau côt • •

- Pha động: Hòa tan 17,75 g natri sulfat khan; 3,05 g natri pentansulfonat và 1,0 mL acid acetic băng trong 1000 mL nước, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 |0,m

- Thuốc thử tạo dẫn xuất sau c ộ t: Hòa tan 0,5 g o-phthalaldehyd trong

150 mL methanol, thêm 1,0 mL 2-mercaptoethanol, lắc 3 phút Thêm 1,5 mL dung dịch polyoxyethylen laruyl ether 12% và 350 mL dung dịch đệm borat pH 10,4; lắc đều

- Dung dịch đệm borat pH 10,4 : Hòa tan 24,64 g acid boric trong 900

mL nước Điều chỉnh pH đến 10,4 bằng dung dịch natri hydroxyd 40%, thêm nước tới vừa đủ 1000 mL, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45

um [19]

- Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 25,0 mg chất chuẩn tobramycin, hòa tan và pha loãng trong pha động đến vừa đủ 25,0 mL Hút chính xác 3,0 mL dung dịch này cho vào bình định mức 25 mL,

thêm pha động vừa đủ đến vạch, lắc đều Hút chính xác 2,0 mL dung dịch thu được, pha loãng với pha động đến vừa đủ 20,0 mL, lắc đều Lọc qua màng lọc 0,45 Ịim.

- Dung dịch thử : Hút chính xác 1,0 mL chế phẩm ( tương đương với3,0 mg tobramycin ) cho vào bình định mức 25 mL, thêm pha động vừa đủ đến vạch, lắc đều Hút chính xác 2,0 mL dung dịch trên, pha loãng với pha động đến vừa đủ 20,0 mL, lắc đều Lọc qua màng lọc 0,45 |im

2.4.1 Nội dung nghiên cứu:

- Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng tobramcin trong chế phẩm thuốc nhỏ mắt bằng phương pháp CE Lựa chọn các điều kiện điện di

và thẩm định phương pháp đã xây dựng

- So sánh phương pháp đã xây dựng với các phương pháp đã được công nhận như phương pháp HPLC tạo dẫn xuất trước cột [31], phương pháp HPLC tạo dẫn xuất sau cột [12]

2.4.2 Phương pháp nghiên cứu:

nhỏ mắt bằng CE

- Chọn hệ đệm: Rất quan trọng, nó quyết định sự thành công của phân

tích bằng CE Dòng EOF rất nhạy với pH nên đệm phải duy trì ổn định ở một pH nhất định Các hệ đệm thường có hiệu lực trong thang

pH chênh lệch trong khoảng 2 đơn vị so với giá trị pKa Hệ đệm cần

có những đặc điểm sau:

o Dung lượng đệm lớn trong thang pH đã chọn,

o Hấp thụ ánh sáng thấp tại bước sóng phát hiện

o Linh độ thấp (ion có kích thước lớn, điện tích nhỏ).

- Xử lý cột: Để tăng thời gian dịch chuyển và độ phân giải, cần có quy

trình rửa cột, luyện cột phải rất cụ thể đối với từng chất phân tích, loại mẫu thử và phương pháp phân tích (máu, hoạt chất, dạng bào chế) Thông thường, trước khi phân tích cột mao quản phải được rửa với 5 lần thể tích mao quản bằng đệm dùng trong phân tích [3] Cột silica không bao, mới sử dụng thì phải rửa bằng dung dịch NaOH IN nhằm hoạt hóa nhóm silanol trên bề mặt mao quản

- Phân tích mẫu: Nghiên cứu xây dựng một chương trình điện di mao

quản có kết quả phân tích tố với độ phân giải và độ nhạy cao, điện di

đồ tách pic sắc nét, dễ xác định

- Thẩm định phương pháp

o Xác định tính đặc hiệu

o Xác định khoảng tuyến tính

o Xác định độ đúng bằng kỹ thuật thêm chuấn

o Xác định độ lặp lại (thời gian di chuyển, diện tích pic): Bằng cách làm nhiều lần (thường 6 lần) Tính độ lệch chuẩn, độ lệch tương đối Yêu cầu RSD < 3,0%

2.4.2.2 So sánh các phương pháp định lượng tobramycin trong chế phẩm

- B ằng thực nghiệm thu được các kết quả định lượng từ các phương

pháp khác nhau: phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector

u v tạo dẫn xuất trước cột; phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector huỳnh quang tạo dẫn xuất sau cột; phương pháp điện di mao quản

+ So sánh các giá trị trung bình của các phương pháp

+ So sánh phương sai của các phương pháp

- Đưa ra đánh giá, nhận xét về các phương pháp định lượng

2.4.3 Phương pháp xử lý số liệu thống kê :

• Fit tra bảng ở mức tin cậy 95% khi bậc tự do K= n-1

+ Test t để so sánh giá trị trung bình kết quả định lượng của hai phương pháp khác nhau :

X x- X 1

( X l >Xỉ ) với s p= j (n' ỉ)s'

tn n ~ r r + 1 , v 1 ' f V ]Ị n, +n2 I - 2o

V n, n.