Định lượng đồng thời cloramphenicol, dexamethason và trong chế phẩm thuốc nhỏ mắt bằng kỹ thuật đạo hàm phổ tỷ đối và trung bình trung tâm phổ tỷ đối

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ Trường đại học dược hà nội NGUYỄN PHÚ HOÀNG ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI CLORAMPHENICOL, DEXAMETHASON VÀ NAPHAZOLIN TRONG CHẾ PHẨM THUỐC NHỎ MẮT BẰNG KỸ THUẬT Đ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

Trường đại học dược hà nội

NGUYỄN PHÚ HOÀNG

ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI CLORAMPHENICOL, DEXAMETHASON

VÀ NAPHAZOLIN TRONG CHẾ PHẨM THUỐC NHỎ MẮT BẰNG KỸ THUẬT ĐẠO HÀM PHỔ TỶ ĐỐI VÀ TRUNG BèNH

TRUNG TÂM PHỔ TỶ ĐỐI

LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2011

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

Trường đại học dược hà nội

NGUYỄN PHÚ HOÀNG

ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI CLORAMPHENICOL, DEXAMETHASON

VÀ NAPHAZOLIN TRONG CHẾ PHẨM THUỐC NHỎ MẮT BẰNG KỸ THUẬT ĐẠO HÀM PHỔ TỶ ĐỐI VÀ TRUNG BèNH

TRUNG TÂM PHỔ TỶ ĐỐI

LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC

CHUYấN NGÀNH KIỂM NGHIỆM-ĐỘC CHẤT

MÃ SỐ: 60.73.15

Người hướng dẫn khoa học: TS Vũ Đặng Hoàng

HÀ NỘI 2011

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới TS Vũ Đặng Hoàn, người đã trực tiếp hướng dẫn và tận tình giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Em xin chân thành cảm ơn sự quan tâm, giúp đỡ của các Thầy, Cô, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Hóa phân tích – Độc chất trường Đại học Dược

Hà Nội trong quá trình làm thực nghiệm tại bộ môn

Em xin cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, Phòng Đào tạo Sau Đại học đã tạo cho em những điều kiện tốt nhất để hoàn thành quá trình học tập tại trường

Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã luôn giúp đỡ, ủng hộ em trong quá trình học tập

Hà N ội, tháng 11 năm 2011

Học viên

Nguyễn Phú Hoàng

1.1.2.2 Phương pháp đạo hàm phổ tỷ đối giao nhau tại điểm không 14

1.1.2.3 Phương pháp đạo hàm phổ tỷ đối số chia đôi 15

1.1.3 Phương pháp trung bình trung tâm phổ tỷ đối 16

2.2.1 Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời CLO, DEX và NAP

2.2.2 Ứng dụng các phương pháp quang phổ đã nêu định lượng đồng thời

3.1.2 Xây dựng phương pháp 25

3.1.2.3 Đánh giá độ lặp lại của phương pháp 46

3.1.2.4 Đánh giá độ đúng của phương pháp 49

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CLO: Cloramphenicol

DEX: Dexamethason

GNT 0: Giao nhau tại điểm 0

HPLC: High Performance Liquid Chromatography MeOH: Methanol

TBTT : Trung bình trung tâm

TLTK: Tài liệu tham khảo

DANH MỤC CÁC BẢNG

STT Bảng Tên bảng Trang

1 3.1 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của Collydexa 35

2 3.2 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của Pollydoxancol 36

3 3.3 Độ lặp lại của phương pháp (Collydexa) 37

4 3.4 Độ lặp lại của phương pháp (Polydoxancol) 38

5 3.5 Độ đúng của phương pháp (Collydexa) 39

6 3.6 Độ đúng của phương pháp (Polydoxancol) 40

7 3.7 Kết quả định lượng thuốc nhỏ mắt Collydexa 43

3 3.2 Phổ đạo hàm tỷ đối của dãy dung dịch chuẩn DEX

(A), dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp (CLO, DEX, NAP) và Collydexa (B), Polydoxancol (C), với số chia NAP 5

17

4 3.3 Phổ đạo hàm tỷ đối của dãy dung dịch chuẩn NAP

(A), dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp (CLO, DEX, NAP) và Collydexa (B), Polydoxancol (C), với số chia DEX 10

18

5 3.4 Phổ đạo hàm tỷ đối của dãy dung dịch chuẩn CLO

(A); dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp (CLO, DEX, NAP) và Collydexa (B), Polydoxancol (C), với số chia NAP 5

19

6 3.5 Phổ đạo hàm tỷ đối của dãy dung dịch chuẩn NAP

(A), dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp (CLO, DEX, NAP) và Collydexa (B), Polydoxancol (C), với số chia CLO 20

20

7 3.6 Phổ đạo hàm tỷ đối của dãy dung dịch chuẩn DEX

(A), dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp (CLO, DEX, NAP) và Collydexa (B), Polydoxancol (C), với số chia CLO 20

21

8 3.7 Phổ đạo hàm tỷ đối của dãy dung dịch chuẩn CLO

(A), dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp (CLO, DEX,

22

STT Hình Tên hình Trang

NAP) và Collydexa (B), Polydoxancol (C), với số chia DEX 10

9 3.8 Phổ đạo hàm tỷ đối của dãy dung dịch chuẩn hỗn

hợp (CLO, DEX, NAP), CLO 40 và Collydexa (A), CLO 50 và Polydoxancol (B), với số chia là hỗn hợp (DEX 5, NAP 5)

23

10 3.9 Phổ đạo hàm tỷ đối của dãy dung dịch chuẩn hỗn

hợp (CLO, DEX, NAP), CLO 40 và Collydexa (A), CLO 50 và Polydoxancol (B), với số chia là hỗn hợp (DEX 10, NAP 5)

24

11 3.10 Phổ đạo hàm tỷ đối của dãy dung dịch chuẩn hỗn

hợp (CLO, DEX, NAP), DEX 10 và Collydexa (A), DEX 10 và Polydoxancol (B), với số chia là hỗn hợp (CLO 5, NAP 5)

25

12 3.11 Phổ đạo hàm tỷ đối của dãy dung dịch chuẩn hỗn

hợp (CLO, DEX, NAP), DEX 10 và Collydexa (A), DEX 10 và Polydoxancol (B), với số chia là hỗn hợp (CLO 40(50), NAP 5)

26

13 3.12 Phổ đạo hàm tỷ đối của dãy dung dịch chuẩn hỗn

hợp (CLO, DEX, NAP), NAP 5 và Collydexa (A), NAP 5 và Polydoxancol (B), với số chia là hỗn hợp (CLO 10, DEX 10)

27

14 3.13 Phổ đạo hàm tỷ đối của dãy dung dịch chuẩn hỗn

hợp (CLO, DEX, NAP), NAP 5 và Collydexa (A), NAP 5 và Polydoxancol (B), với số chia là hỗn hợp (CLO 40(50), DEX 10)

28

15 3.14 Phổ trung bình trung tâm lần 2 của dãy dung dịch

chuẩn hỗn hợp (CLO, DEX, NAP), CLO 40 và Collydexa (A), CLO 50 và Polydoxancol (B), với

29

STT Hình Tên hình Trang

các số chia là NAP 5 và DEX 10

16 3.15 Phổ trung bình trung tâm lần 2 của dãy dung dịch

chuẩn hỗn hợp (CLO, DEX, NAP), CLO 40 và Collydexa (A), CLO 50 và Polydoxancol (B), với các số chia là DEX 10 và NAP 5

30

17 3.16 Phổ trung bình trung tâm lần 2 của dãy dung dịch

chuẩn hỗn hợp (CLO, DEX, NAP), DEX 10 và Collydexa (A), DEX 10 và Polydoxancol (B), với các số chia là CLO 40(50) và NAP 5

31

18 3.17 Phổ trung bình trung tâm lần 2 của dãy dung dịch

chuẩn hỗn hợp (CLO, DEX, NAP), DEX 10 và Collydexa (A), DEX 10 và Polydoxancol (B), với các số chia là NAP 5 và CLO 40 (50)

32

19 3.18 Phổ trung bình trung tâm lần 2 của dãy dung dịch

chuẩn hỗn hợp (CLO, DEX, NAP), NAP 5 và Collydexa (A), NAP 5 và Polydoxancol (B), với các

số chia là CLO 40(50) và DEX 10

33

20 3.19 Phổ trung bình trung tâm lần 2 của dãy dung dịch

chuẩn hỗn hợp (CLO, DEX, NAP), NAP 5 và Collydexa (A), NAP 5 và Polydoxancol (B), với các

số chia là DEX 10 và CLO 40(50)

34

ĐẶT VẤN ĐỀ

Một trong những hậu quả của sự ô nhiễm nguồn nước và không khí là các bệnh về mắt đặc biệt là các bệnh viêm kết mạc, viêm mí mắt, tuyến lệ Để điều trị các bệnh này thường phải có sự phối hợp đồng thời các thuốc kháng khuẩn, kháng viêm, giảm phù nề, giảm xung huyết

Cloramphenicol (CLO) là kháng sinh phổ rộng thường được bào chế dưới dạng dụng dịch nhỏ mắt có nồng độ 0,4 hoặc 0,5% để điều trị các tác nhân gây viêm kết mạc cấp tính (nhiễm khuẩn kết mạc, màng bồ đào, củng mạc, thượng củng mạc ) Trong thành phần một số thuốc nhỏ mắt, CLO có thể được phối hợp với Dexamethason (DEX) là một glucocorticoid có tác dụng chống viêm; và Naphazolin (NAP) là thuốc cường giao cảm có tác dụng co mạch, giảm xung huyết Thuốc nhỏ mắt Collydexa và Polydoxancol có chứa đồng thời CLO, DEX và NAP hiện đang được sử dụng rộng rãi trong điều trị viêm kết mạc cấp tính, nhiễm trùng tuyến lệ, viêm mí mắt

Để định lượng CLO, DEX và NAP trong chế phẩm Collydexa, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) thường đươc sử dụng tại cơ sở sản xuất [5] Tuy nhiên, định lượng đồng thời cả 3 thành phần bằng phương pháp HPLC cũng gặp khó khăn khi định lượng Naphazolin thường phải tiến hành riêng trên cột pha thuận

Với mong muốn đề xuất một phương pháp định lượng đồng thời CLO, DEX và NAP trong chế phẩm thuốc nhỏ mắt bằng phương pháp đo quang có khả năng thay thế HPLC trong công tác kiểm nghiệm thuốc, chúng tôi tiến

hành đề tài: “Định lượng đồng thời Cloramphenicol, Dexamethason và Naphazolin trong chế phẩm thuốc nhỏ mắt bằng kỹ thuật đạo hàm phổ tỷ đối và trung bình trung tâm phổ tỷ đối” với các mục tiêu sau:

- Xây dựng phép định lượng đồng thời hỗn hợp ba thành phần CLO, DEX

và NAP bằng kỹ thuật đạo hàm phổ tỷ đối và trung bình trung tâm phổ tỷ đối

- Ứng dụng các phương pháp này để định lượng CLO, DEX và NAP trong một số chế phẩm thuốc nhỏ mắt

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HẤP THỤ TỬ NGOẠI – KHẢ KIẾN (UV- VIS)

1.1.1 Định luật Lambert – Beer [4]

Nội dung định luật:

Khi cho bức xạ đơn sắc đi qua một môi trường có chứa chất hấp thụ thì độ hấp thụ của bức xạ tỷ lệ với nồng độ của chất hấp thụ và chiều dày của môi trường hấp thụ (dung dịch hấp thụ) Mối quan hệ này tuân theo định luật Lambert – Beer và được biểu diễn bằng phương trình:

I K C l

I T

l: là chiều dày của lớp dung dịch (cm)

C: nồng độ chất tan trong dung dịch

Điều kiện áp dụng định luật Lambert – Beer:

⋅ Chùm tia sáng phải đơn sắc

⋅ Dung dịch phải nằm trong khoảng nồng độ thích hợp

⋅ Dung dịch phải trong suốt

⋅ Chất thử phải bền trong dung dịch và bền dưới tác dụng của tia UV- VIS

1.1.2 Phương pháp quang phổ đạo hàm

1.1.2.1 Phương pháp phổ đạo hàm [4]

Phương pháp phổ đạo hàm là một kỹ thuật chuyển đổi phổ hấp thụ dựa trên phép lấy đạo hàm bậc nhất, bậc hai hoặc bậc cao hơn

Cơ sở của phương pháp phổ đạo hàm:

Theo định luật Lambert – Beer ta có:

Độ hấp thụ A= K.C.l

Có thể lấy đạo hàm bậc 1, bậc 2 hoặc bậc cao hơn của độ hấp thụ A đối với bước sóng λ Ta được:

l C d

dK d

K d d

A d

⋅

⋅

2 2 2

λ

λ (4)

Vì độ dày l của lớp dung dịch luôn không đổi và tại một bước sóng nhất định đạo hàm của K là một hằng số nên giá trị đạo hàm của A chỉ còn phụ thuộc tuyến tính với nồng độ C của dung dịch

Phổ đạo hàm của hỗn hợp nhiều chất:

Phổ đạo hàm của hỗn hợp nhiều chất có tính chất cộng tính

λ

dA d

dA d

dA d

+ + +

(6)2

2 2

2 2 2 1 2 2

2

λλ

λ

A d d

A d d

A d d

A

+ + +

=

(7)Trong đó: 1,2, ,n là chất 1, chất 2,…, chất n

Hình 1 (A-B) Phổ hấp thụ (a), phổ đạo hàm bậc 1(b) của CLO và DEX;

Ph ổ hấp thụ (c), phổ đạo hàm bậc 2 của CLO và NAP

Theo ý nghĩa toán học của đạo hàm:

⋅ Tại các điểm cực trị, đạo hàm bậc 1 bằng 0

⋅ Tại các điểm uốn, đạo hàm bậc 2 bằng 0

Trên phổ đạo hàm bậc 1 của chất thứ nhất, tại những điểm có giá trị bằng 0 có thể tìm được giá trị khác 0 trên phổ đạo hàm bậc 1 của chất thứ hai Vậy tại bước sóng đó có thể xác định được chất thứ hai một cách độc lập, không bị chất thứ nhất ảnh hưởng

Tương tự với phổ đạo hàm bậc 2: hai chất có cực đại hấp thụ gần nhau nhưng các điểm uốn có thể xa nhau Tại bước sóng ứng với điểm uốn trên phổ hấp thụ (điểm 0 trên đường đạo hàm bậc 2) của chất này sẽ tìm được giá trị khác 0 trên đường phổ đạo hàm bậc 2 của chất kia

1.1.2.2 Phương pháp đạo hàm phổ tỷ đối giao nhau tại điểm không [15]

Xét một hỗn hợp gồm 3 chất cần phân tích là X, Y, Z, và giả sử giá trị độ hấp thụ của hỗn hợp tại bước sóng λi là Am, λi thì:

A m,λi = αX, λi C X + βY, λi C Y + γZ, λi C Z ( 8 )

Trong đó αX, λi , βY, λi và γZ, λi là độ hấp thụ riêng của X, Y, Z C X , C Y và C Z là nồng độ của các thành phần tương ứng

Ta chia (8) cho phổ của dung dịch chuẩn X có nồng độ C 0

X sẽ được:

0 , ,

, 0 , ,

, 0 , ,

, 0 , ,

,

X i X

Z i Z X i X

Y i Y X i X

X i X X i X

i m

C

C C

C C

C C

A

λ λ λ

λ λ

λ λ

λ

α

γα

βα

α

) 9 (

Lấy đạo hàm bậc 1 hai vế phương trình (9) ta được:

, 0

, ,

, 0

, , ,

X i X

Z i Z X

i X

Y i Y X

i X

i m

C

C d

C

C d

C

A d

λ λ λ

λ λ

λ

α

γ α

β α

[ , / , ]. 0 [ , / , ]. 0

X

Z i X i Z X

Y i X i Y

C

C d

d C

C d

d

λ

αγλ

Y

C

C d

, ,

,

] / [

X

Z i X i Z X

i X

i m

C

C d

d C

A d

λ

α γ α

λ λ λ

Công thức (11) cho thấy rằng, tại bước sóng λi ,

1.1.2.3 Phương pháp đạo hàm phổ tỷ đối số chia đôi [16], [17]

Giả sử độ hấp thụ của dung dịch hỗn hợp chuẩn của 2 chất X, Y là Bm,λi, thì:

B m,λi = αX, λi C 0 X + βY, λi C 0 Y ( 12 )

Chia (8) cho (12) ta sẽ được:

0 ,

0 , ,

, 0

,

0 , ,

, ,

0 ,

0 ,

,

,

Y i Y X i X

Z i Z Y

i Y X i X

Y i Y X i X Y i Y X i

X

i m

C C

C C

C

C C

C C

A

λ λ

λ λ

λ

λ λ

λ λ

λ

βα

γβ

α

βα

β

+

= +

) 13 (

Nếu tổng tỷ lệ 0

,

0 , ,

, ,

Y i Y X i X

Y i Y X i X

C C

C C

λ λ

λ λ

βα

βα

0 , ,

, 0

,

0 ,

,

Y i Y X i X

Z i Z Y

i Y X i

X

i m

C C

C t

cons k C C

A

λ λ

λ λ

λ

λ

β α

γ β

) 14 (

Tuy nhiên, nếu C 0

X = C 0 Y hoặc C 0

X ≈ C 0 Y thì ta có thể viết:

[ X i Y i]

X Y i Y X

i

Xλ C β λC C α λ β λ

Khi đó (14) có thể viết:

Z i Z i

Y i X X

i m

C

C k

C

A

λ λ λ λ

λ

λ

β α

γ β

, ,

, 0 ,

+ +

= +

) 15 (

Lấy đạo hàm bậc nhất hai vế của (15), ta sẽ có:

, ,

, ,

, 0 , ,

, 0

,

.

X Z i Y i X

i Z i

Y i X X

Z i Z i

Y i X

X

i m

C

C d

C

C d

C

A d

λ λ λ

λ

λ

βα

γβ

α

γβ

α

) 16 (

Công thức (16) là thuật toán được thiết lập cho việc xác định hàm lượng các chất trong hỗn hợp 3 thành phần

1.1.3 Phương pháp trung bình trung tâm phổ tỷ đối [14]

3 3 3

3 1

5 )

(y y y

MC

) 17 (

Nếu vector y được nhân lên n lần thì vector trung bình trung tâm cũng tăng lên n lần và nếu cộng vào vector y một hằng số thì trị số trung bình trung tâm

của vector này cũng không thay đổi

Xét một hỗn hợp gồm 3 thành phần X, Y và Z Nếu không có tương tác giữa các thành phần này và độ hấp thụ của dung dịch hỗn hợp có tính chất cộng tính, ta có thể viết:

A m,λi = αX, λi C X + βY, λi C Y + γZ, λi C Z (18)

Trong đó A m,λi là vector độ hấp thụ của hỗn hợp, αX, λi, βY, λi và γZ, λi là vector

hấp thụ mol riêng phần của X, Y và Z C X , C Y , và C Z là các nồng độ tương ứng của X, Y và Z

Nếu chia công thức (18) cho γZ, λi tương ứng với phổ của dung dịch chuẩn Z, phổ tỷ đối thứ nhất sẽ là:

Z i Z

Y i Y i Z

X i X i Z

i m

C C C

A

λ λ λ

λ λ

λ

γ

βγ

α

, ,

, ,

,

) 19 (

Thực hiện phép lấy trị số trung bình trung tâm (MC) của (11), khi đó trị số

trung bình trung tâm của hằng số (C Z) bằng 0 và công thức (19) sẽ là:

Y i Y i

Z

X i

MC

C MC B MC

C

λ λ λ

λ

γ

β γ

α

,

, ,

,

) 20 (

i Y

MC

λ

λ γ

β

, , , tương ứng với trị số trung bình trung tâm của phổ

tỷ đối của dung dịch chuẩn Y và Z, thu được:

i Z

i Y

i Z

X i X

i Z

i Y

C MC

C MC

MC

B MC C

λ

λ

γ β γ α

γ

β

, , , ,

, ,

] [

) 21 (

Thực hiện phép lấy trị số trung bình trung tâm (MC) của (21) ta sẽ có:

i Y

i Z

X i X

MC

C MC

MC D

MC

λ λ λ λ

γ β γ α

, , , ,

) 22 (

Công thức (22) được thiết lập cho thấy mối quan hệ tuyến tính giữa MC[D] và nồng độ của X trong dung dịch Công thức này cho phép xác định nồng độ của X mà không gặp trở ngại nào của Y và Z trong hỗn hợp 3 thành phần

1.2 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

1.2.1 Cloramphenicol [1], [2], [12], [13]:

- Công thức phân tử: C11H12Cl2N2O5

- Công thức cấu tạo:

- Tên khoa học: (4- nitrophen-yl)ethyl] acetamid

2,2-dicloro-N-[(1R,2R)-2-hydroxy-1-(hydroxymethyl)-2 Khối lượng phân tử: 323,1

- Tính chất: Bột kết tinh màu trắng, trắng xám hoặc trắng vàng hay tinh thể hình kim hoặc phiến dài Khó tan trong nước, dễ tan trong ethanol 96% và trong propylen glycol Dung dịch trong nước có hấp thụ quang học ở bước sóng cực đại 278 nm, với E 1cm1% = 279

- Định lượng:

+ Phương pháp UV: Hòa tan chế phẩm trong nước và pha loãng để thu được dung dịch chứa khoảng 0,02mg/ml CLO Đo độ hấp thụ của dung dịch này tại bước sóng cực đại 278 nm ( 1 %

1.2.2 Dexamethason natri phosphat [1], [2], [12], [13]:

- Công thức phân tử: C22H28FNa2O8P

- Tên khoa học: 9-fluoro-11β,17-dihydroxy-16α-methyl-3, 1,4-dien-21 -yl natri phosphate

20-dioxopregna Khối lượng phân tử: 516,4

- Tính chất: Bột trắng hoặc gần như trắng, đa hình, rất dễ hút ẩm Dễ tan trong nước, khó tan trong ethanol 96%, thực tế không tan trong ether và methylen clorid Dung dịch trong nước có hấp thụ quang học ở bước sóng cực đại 241,5nm, với E 1cm1%= 303

Pha động: sử dụng hỗn hợp thay đổi gồm dung dịch A và dung dịch B; Cột: C8 (4,6 mm x 25 cm, 5µm), Nhiệt độ cột: 40oC;

Tốc độ dòng: 1,0 mL/phút;

Detector: 254 nm

1.2.3 Naphazolin nitrat [1], [2], [12], [13]:

- Công thức phân tử: C14H14N2.HNO3

- Công thức cấu tạo:

- Tên khoa học: 2-(1-naphthylmethyl)-2-imidazolin nitrat

- Khối lượng phân tử: 273,3

- Tính chất: Bột kết tinh trắng hay gần như trắng Hơi tan trong nước, tan trong ethanol 96% Dung dịch trong nước có hấp thụ quang học ở bước sóng cực đại 280nm

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG – NGUYÊN LIỆU VÀ THIẾT BỊ

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Thuốc nhỏ mắt Collydexa của Công Ty Cổ Phần Dược phẩm Hà Nội:

+ CLO: Chuẩn QG, UV: 99,1 % (khan); độ ẩm: 0,04 %

+ DEX: Chuẩn QG, UV: 99,6 % (khan); độ ẩm: 0,13 %

+ NAP: Chuẩn QG, 100,47 % (khan); độ ẩm: 0,02 %

- Nước cất hai lần được xử lý loại bỏ ion

- Methanol HPLC

- Kali dihydrophosphat loại tinh khiết phân tích

- Amoni nitrat loại tinh khiết phân tích

Thiết bị:

- Máy quang phổ hai chùm tia UNICAM UV300 (ThermoSpectronic, USA) được kết nối với máy tính (chạy hệ điều hành Window XP) với phần mềm chuyên dụng Vision 32 Chế độ đo:

+ Start Lamda: 200nm + Stop Lamda: 325nm

+ Data Mode: Absorbance + Band width: 1,5nm

+ Scan Speed: Intelliscan nm/min + Data Interval: Very High Res

- Cuvet thạch anh bề dày 1cm – Hellma

- Máy HPLC Agilent 1200 Series được kết nối với máy tính (hệ điều hành Win XP), và được điều khiển bằng phần mềm chuyên dụng ChemStation

- Cột sắc ký C18 (5µm; 4,6 x 150 mm) – Agilent

- Cột sắc ký Silica (5µm; 4,6 x 150 mm) – Agilent

- Máy lọc chân không NGK

- Máy đo pH S47 - Mettler

- Máy lọc nước: Aurium 611 (SARTORIUS)

- Máy siêu âm: Ultrasonic LC 60H

- Cân phân tích 4 số Sartorius, Mettler

- Các dụng cụ khác: bình định mức (loại 25, 50 và 100 ml), pipet tự động loại 100-1000 µl và 1000-5000 µl, cốc có mỏ, đũa thủy tinh, ống đong, giấy lọc

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời CLO, DEX và NAP bằng các phương pháp quang phổ UV

- Chọn bước sóng định lượng thích hợp

- Chọn khoảng nồng độ có sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và các giá trị đạo hàm phổ tỷ đối, trung bình trung tâm phổ tỷ đối

- Kiểm tra độ đúng, độ lặp lại của phương pháp

2.2.2 Ứng dụng các phương pháp quang phổ đã nêu định lượng đồng thời CLO, DEX và NAP trong chế phẩm

Tiến hành định lượng đồng thời CLO, DEX và NAP trong cùng một mẫu bằng các phương pháp:

- Sắc ký lỏng hiệu năng cao: Theo TCCS của nhà sản xuất

- Quang phổ UV: đạo hàm phổ tỷ đối, trung bình trung tâm phổ tỷ đối

- So sánh kết quả của các phương pháp quang phổ với phương pháp HPLC

để rút ra kết luận

2.2.3 Xử lý kết quả thực nghiệm [7]

Sự phụ thuộc tuyến tính của nồng độ với tín hiệu đo trong các phương pháp đo quang được thiết lập bằng phương pháp bình phương tối thiểu với hệ

số R2 của đường chuẩn ≥ 0,990

So sánh độ chính xác của các phương pháp bằng test F và so sánh các giá trị trung bình bằng test t với khoảng tin cậy 95%

- Giá trị trung bình:

n

X X

n

i i

n

i i

- Phương sai:

1

) (

1

2 2

n

i i

- Độ lệch chuẩn tương đối: = ⋅ 100

X S RSD

Chương 3 KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 3.1 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

3.1.1 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu

3.1.1.1 Dung dịch chuẩn

- CLO: Cân chính xác khoảng 0,100 g CLO chuẩn, hòa tan với nước cất vừa

đủ trong bình định mức 100 ml, lắc đều được dung dịch gốc có nồng độ CLO khoảng 1,0 mg/ml

- DEX: Cân chính xác khoảng 0,100 g DEX chuẩn, hòa tan với nước cất vừa

đủ trong bình định mức 100 ml, lắc đều được dung dịch gốc có nồng độ DEX khoảng 1,0 mg/ml

- NAP: Cân chính xác khoảng 0,100 g NAP chuẩn, hòa tan với nước cất vừa

đủ trong bình định mức 100 ml, lắc đều được dung dịch gốc có nồng độ NAP khoảng 1,0 mg/ml

Từ các dung dịch gốc trên pha thành các dãy dung dịch chuẩn làm việc:

- Dãy dung dịch đơn chất:

+ CLO: gồm 06 dung dịch có nồng độ thay đổi 20 – 70 µg/ml

+ DEX: gồm 06 dung dịch có nồng độ thay đổi 5 – 17,5 µg/ml và 06 dung dịch có nồng độ thay đổi 4 – 14 µg/ml

+ NAP: gồm 06 dung dịch có nồng độ thay đổi 2,5 – 8,75 µg/ml và 06 dung dịch có nồng độ thay đổi 2 – 7 µg/ml

- Dãy dung dịch hỗn hợp 3 thành phần (CLO, DEX, NAP), gồm:

+ 06 dung dịch có nồng độ CLO thay đối 20 – 70 µg/ml, DEX 4 – 14 µg/ml, NAP 2 – 7 µg/ml; tỷ lệ của các thành phần trong mỗi dung dịch tương ứng với tỷ lệ các thành phần trong công thức của chế phẩm Polydoxancol + 06 dung dịch có nồng độ CLO thay đối 20 – 70 µg/ml, DEX 5 – 17,5 µg/ml, NAP 2,5 – 8,75 µg/ml; tỷ lệ của các thành phần trong mỗi dung dịch tương ứng với tỷ lệ các thành phần trong công thức của chế phẩm Collydexa

- Các dung dịch hỗn hợp 2 thành phần, gồm:

+ Dung dịch hỗn hợp chứa DEX 10 µg/ml và NAP 5 µg/ml

+ Dung dịch hỗn hợp chứa DEX 5 µg/ml và NAP 5 µg/ml

+ Dung dịch hỗn hợp chứa CLO 40(50) µg/ml và NAP 5 µg/ml

+ Dung dịch hỗn hợp chứa CLO 5 µg/ml và NAP 5 µg/ml

+ Dung dịch hỗn hợp chứa CLO 40(50) µg/ml và DEX 10 µg/ml

+ Dung dịch hỗn hợp chứa CLO 10 µg/ml và DEX 10 µg/ml

3.1.1.2 Dung dịch thử

Trộn đều 5 ống thuốc nhỏ mắt Hút chính xác 1,0 ml dung dịch chế phẩm, pha loãng bằng nước cất vừa đủ trong bình định mức 100 ml, lắc đều; hút chính xác 10,0 ml dung dịch này cho vào bình định mức 50 ml, thêm nước vừa đủ và lắc đều được dung dịch thử, có nồng độ (theo hàm lượng ghi trên nhãn) các thành phần tương ứng: CLO 40 (50) µg/ml, DEX 10 µg/ml, NAP 5

µg/ml

3.1.2 Xây dựng phương pháp

3.1.2.1 Chọn bước sóng định lượng

a Khảo sát phổ hấp thụ

Hình 3.1(A- B) Phổ hấp thụ của dung dịch CLO, DEX, NAP, hỗn hợp

(CLO, DEX, NAP), ch ế phẩm và phổ cộng (CLO + DEX + NAP)

Đồ thị biểu diễn phổ hấp thụ của các dung dịch chuẩn và chế phẩm có nồng độ tương ứng (hình 3.1) cho thấy trong khoảng bước sóng khảo sát:

- CLO (40-50 µg/ml) có khả năng hấp thụ ánh sáng mạnh nhất với cực đại hấp thụ tại 278,8 nm, dẫn đến sự chồng phổ đối với DEX (cực đại hấp thụ 242,2 nm) và NAP (cực đại hấp thụ 280 nm) trong vùng bước sóng 200 – 325

có nồng độ tương đương (CLO 50, DEX 10, NAP 5) (Hình 3.1-A)

b Phương pháp đạo hàm phổ tỷ đối giao nhau tại điểm không

Định lượng CLO:

- Với số chia là phổ hấp thụ của dung dịch chuẩn NAP 5:

+ Lấy phổ hấp thụ của dung dịch chuẩn DEX có nồng độ thay đổi chia cho phổ hấp thụ của NAP 5 được phổ tỷ đối Bằng cách chia tương tự ta thu được phổ tỷ đối của dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp (CLO, DEX, NAP), chế phẩm Collydexa và Polydoxancol

+ Làm trơn các phổ tỷ đối trên bằng chức năng smooth (Order: 3; No of coefficients: 125), sau đó lấy đạo hàm bậc nhất (Order: 5; No of coefficients: 9) được phổ đạo hàm tỷ đối (hình 3.2)

Hình 3.2 Phổ đạo hàm tỷ đối của dãy dung dịch chuẩn DEX (A), dãy dung

d ịch chuẩn hỗn hợp (CLO, DEX, NAP) và Collydexa (B), Polydoxancol (C),

v ới số chia NAP 5

- Với số chia là phổ hấp thụ của dung dịch chuẩn DEX 10 cũng tiến hành tương tự, thu được kết quả (hình 3.3):

Hình 3.3 Phổ đạo hàm tỷ đối của dãy dung dịch chuẩn NAP (A), dãy dung

d ịch chuẩn hỗn hợp (CLO, DEX, NAP) và Collydexa (B), Polydoxancol (C),

v ới số chia DEX 10

Phổ đạo hàm tỷ đối bậc nhất của dãy dung dịch chuẩn DEX có giá trị bằng

0 tại bước sóng 247,3 nm (Hình 3.2-A), và phổ đạo hàm tỷ đối bậc nhất của dãy dung dịch chuẩn NAP có giá trị bằng 0 tại hai bước sóng 247,0 nm (Hình 3.3-A) Do đó, có thể sử dụng bước sóng 247,0 nm hoặc 247,3 nm để định lượng CLO

Định lượng DEX:

- Với số chia là phổ hấp thụ của dung dịch chuẩn NAP 5:

+ Lấy phổ hấp thụ của dung dịch chuẩn CLO có nồng độ thay đổi, phổ hấp thụ của dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp (CLO, DEX, NAP), chế phẩm Collydexa và Polydoxancol chia cho phổ hấp thụ của NAP 5 được phổ tỷ đối + Làm trơn các phổ tỷ đối, lấy đạo hàm với các thông số (3-125) và (5-9) được phổ đạo hàm tỷ đối (hình 3.4)

Hình 3.4 Phổ đạo hàm tỷ đối của dãy dung dịch chuẩn CLO (A); dãy dung

d ịch chuẩn hỗn hợp (CLO, DEX, NAP) và Collydexa (B), Polydoxancol (C),

v ới số chia NAP 5

- Với số chia là phổ hấp thụ của dung dịch chuẩn CLO 20: Tiến hành chia

và xử lý phổ tương tự như trên ta thu được phổ đạo hàm tỷ đối của dãy dung dịch chuẩn NAP, dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp (CLO, DEX, NAP) và chế phẩm

Hình 3.5 Phổ đạo hàm tỷ đối của dãy dung dịch chuẩn NAP (A), dãy dung

d ịch chuẩn hỗn hợp (CLO, DEX, NAP) và Collydexa (B), Polydoxancol (C),

v ới số chia CLO 20