2.1.1. Nguyờn liệu
Nguyờn liệu là phần trờn mặt đất của 10 mẫu thuộc loài G. pentaphyllum thu hỏi tại cỏc vựng trồng ở 3 địa phương khỏc nhau, mỗi mẫu 500g khụ:
- Mẫu thu hỏi tại Tam Đảo: TĐ1, TĐ2, TĐ3 - Mẫu thu hỏi tại Hũa Bỡnh: HB1, HB2, HB3 - Mẫu thu hỏi tại Đà Lạt: ĐL1, ĐL2, ĐL3, ĐL4
Dược liệu sau khi thu hỏi được phơi ở nơi thoỏng mỏt, sấy ở nhiệt độ 600
C (tủ sấy Shellab) và bảo quản trong tỳi nilon kớn ở nơi khụ rỏo, thoỏng mỏt.
2.2.2. Dụng cụ thiết bị
- Tủ sấy SHELLAB.
- Cõn phõn tớch Precisa XT220A. - Mỏy đo hàm ẩm Precisa XM 60 - Mỏy chiết siờu õm Qsonica - Mỹ. - Bộ sinh hàn hồi lưu và bộ chiết soxhlet. - Bể điều nhiệt Sartoriu.
- Sắc ký lớp mỏng sử dụng bản mỏng trỏng sẵn Silicagel GF254 của MERCK (Đức).
- Tủ sấy BINDER – Đức.
- Mỏy cất chõn khụng BĩCHi ROTAVAPOR R-200. - Pipet tự động 100àl.
- Mỏy đo quang Shanghai METASH – Trung Quốc.
- Cỏc dụng cụ thủy tinh khỏc: Bỡnh định mức, pipet, ống nghiệm, ống đong, ống ly tõm, phễu lọc, cốc cú mỏ, đũa thủy tinh...
Nghiờn cứu sử dụng cỏc bộ dụng cụ tại phũng thớ nghiệm của Bộ mụn Dược liệu trường Đại học Dược Hà Nội.
2.1.3. Húa chất
- Dung mụi dựng cho quỏ trỡnh chiết xuất: EtOH, MeOH, ether dầu hỏa, n- butanol, nước cất.
- Chất chuẩn tinh khiết Rb1 chiết xuất từ Panax ginseng C.A.Mey của cụng ty Shanghai TautoBiotech, độ tinh khiết đạt 97%.
- Húa chất tinh khiết: EtOH, Cloroform, Acid acetic băng, vanillin, acid perchloric.
- Nhựa hấp phụ D101 của Anhui sanxing resin Technology Co. Ltd.
2.2. NỘI DUNG NGHIấN CỨU
- Xõy dựng quy trỡnh tối ưu chiết xuất saponin toàn phần từ dược liệu. - Xõy dựng quy trỡnh tinh chế saponin.
- Xõy dựng cỏc điều kiện định lượng Saponin trong Giảo cổ lam bằng kỹ thuật UV-VIS nhằm xỏc định điều kiện tối ưu: Thời gian, nhiệt độ, nồng độ thuốc thử.
- Thẩm định lại phương phỏp vừa xõy dựng: khoảng tuyến tớnh, độ lặp lại, độ đỳng.
- Định lượng saponin toàn phần từ Giảo cổ lam bằng phương phỏp cõn và phương phỏp đo quang. Sử dụng cỏc phộp toỏn thống kờ để xử lớ và so sỏnh kết quả của hai phương phỏp trờn.
- Từ phương phỏp đó xõy dựng được, tiến hành định lượng saponin trong một số mẫu Giảo cổ lam.
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU
2.3.1. Chiết xuất
• Xỏc định độ ẩm của bột dược liệu:
Dược liệu được sấy khụ, cắt nhỏ và nghiền thành bột. Lấy khoảng 1g bột mẫu nghiờn cứu để xỏc định độ ẩm của dược liệu. Bật mỏy đo độ ẩm, điều chỉnh nhiệt độ ở 110oC, rắc bột dược liệu lờn đĩa cõn và trải đều lờn mặt đĩa, đậy đĩa cõn và đợi mỏy tự động hiện kết quả lờn màn hỡnh. Đọc kết quả. Tiến hành 3 lần, lấy kết quả trung bỡnh.
• Chiết xuất:
Để chiết được nhúm chất chứa đối tượng nghiờn cứu phải xõy dựng được cỏc qui trỡnh chiết xuất thớch hợp. Tựy theo tớnh chất của mỗi chất mà sử dụng dung mụi cú độ phõn cực khỏc nhau. Khảo sỏt cỏc phương phỏp và dung mụi khỏc nhau nhằm đảm bảo hợp lớ cả hai yờu cầu: chiết được tối đa lượng chất nghiờn cứu và tối thiểu tạp chất để thuận tiện cho quỏ trỡnh tinh chế và định lượng tiếp theo.
Đối với saponin, chỳng tụi tiến hành khảo sỏt quy trỡnh chiết xuất với 3 phương phỏp: chiết soxhlet, chiết hồi lưu, chiết siờu õm, với mỗi phương phỏp sử dụng 4 dung mụi khỏc nhau là MeOH, EtOH 50%, 70%,90%.
Phương phỏp chiết bằng soxhlet
Hỡnh 2.1. Bộ dụng cụ chiết soxhlet
- Làm tỳi bằng giấy lọc: cắt một miếng giấy lọc vuụng, cuộn trũn, gập đỏy, dựng gim để ghim mộp giấy.
- Cõn chớnh xỏc khoảng 50g bột dược liệu thụ cho vào trong tỳi đó chuẩn bị sẵn, gập miệng tỳi và đặt vào dụng cụ chiết.
- Lắp dụng cụ, đặt lờn nồi cỏch thuỷ. éặt phễu lờn miệng ống sinh hàn. Rút 500ml dung mụi qua phễu (lần lượt là MeOH, EtOH 50%,70%,
90%).
- Chiết hồi lưu nhiều lần cho đến khi saponin được chiết kiệt (kiểm tra bằng SKLM với hệ dung mụi CHCl3:MeOH:H2O = 65:35:10)
- Gộp dịch chiết lọc qua giấy lọc rồi cất thu hồi dung mụi dưới ỏp suất giảm đến cắn. Dựng cắn thu được tiến hành cỏc bước như hỡnh 2.4.
Phương phỏp chiết hồi lưu
Hỡnh 2.2. Bộ dụng cụ chiết hồi lưu
- Cõn chớnh xỏc khoảng 50g bột dược liệu thụ cho vào bỡnh cầu sạch dung tớch 500ml, thấm ẩm bột dược liệu bằng lượng dung mụi vừa đủ rồi thờm dung mụi đến ngập hết dược liệu (tổng 250ml dung mụi), lần lượt là MeOH, EtOH 50%,70%, 90%.
- Lắp dụng cụ, đặt lờn nồi cỏch thủy. Đun sụi trong 30 phỳt. Lấy dịch chiết và lọc. Tiếp tục thờm dung mụi đến ngập dược liệu và chiết đến khi dịch chiết trong suốt (3 lần). Gộp dịch chiết thu được đem lọc rồi cất thu hồi dung mụi dưới ỏp suất giảm đến cắn. Dựng cắn thu được tiến hành cỏc bước như hỡnh 2.4.
Phương phỏp chiết siờu õm
Hỡnh 2.3. Mỏy chiết siờu õm
- Cõn chớnh xỏc khoảng 50g bột dược liệu thụ cho vào cốc cỏ mỏ sạch dung tớch 500ml, thấm ẩm bột dược liệu bằng lượng dung mụi vừa đủ rồi thờm dung mụi đến ngập hết dược liệu (tổng 250ml dung mụi) với dung mụi lần lượt là MeOH, EtOH 50%,70%,
90%. - Tiến hành chiết bằng mỏy siờu õm trong thời gian 10 phỳt, cụng suất 40%. Thu lấy dịch chiết. Tiếp tục thờm dung mụi đến ngập dược liệu và chiết đến khi dịch chiết trong suốt (3 lần). Gộp dịch chiết thu được đem lọc rồi cất thu hồi dung mụi dưới ỏp suất giảm đến cắn. Dựng cắn thu được tiến hành cỏc bước như hỡnh 2.4.
Trong đú S: hàm lượng saponin (%)
a: khối lượng saponin toàn phần (g) M: khối lượng dược liệu (g)
x: Hàm ẩm dược liệu
Hỡnh 2.4. Sơ đồ định lượng saponin toàn phần theo phương phỏp cõn bằng cỏc phương phỏp chiết và dung mụi khỏc nhau.
Cụng thức: Hàm lượng saponin toàn phần
Cõn cắn và tớnh hàm lượng cỏc cắn theo cụng thức: S = ) 1 ( x M a − ì ì100% s
2.3.2. Tinh chế
Căn cứ vào tài liệu tham khảo và quy trỡnh thực nghiệm, chỳng tụi xõy dựng quy trỡnh tinh chế mẫu bằng phương phỏp chiết lỏng-rắn như sau:
• Chuẩn bị
- Nhựa sử dụng: D101, được làm sạch bằng nước cất.
- Cõn khoảng 5g dược liệu, chiết bằng phương phỏp đó lựa chọn, lấy dịch chiết bốc hơi dung mụi đến cắn rồi hũa tan bằng 5ml nước thu được dung dịch (1).
- Chuẩn bị cột: Cột thủy tinh cú khúa và nỳt mài, đường kớnh 2,5cm; chiều dài 25cm; rửa sạch, sấy khụ, cố định trờn giỏ theo chiều thẳng đứng, lút một lớp bụng thủy tinh ở đỏy cột.
- Chất nhồi cột: 20g nhựa hấp phụ (đó làm sạch) ngõm trong dung dịch (1) trong 60 phỳt, vừa ngõm vừa lắc nhẹ để quỏ trỡnh hấp phụ xảy ra hoàn toàn.
• Khảo sỏt dung mụi rửa giải
Để lựa chọn dung mụi rửa giải thớch hợp, chỳng tụi tiến hành khảo sỏt dung mụi rửa giải từ nước cất, EtOH 10% đến EtOH 90%, MeOH
- Nhồi cột: Đưa nhựa hấp phụ ngõm trong dung dịch (1) vào cột từ từ, vừa rút vừa gừ nhẹ để đuổi hết bọt khớ.
- Rửa giải:
Ban đầu rửa giải bằng nước đến hết màu.
Lần lượt rửa giải với cỏc dung mụi EtOH 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% và MeOH. Chuyển dung mụi mới khi đó rửa kiệt saponin bằng dung mụi cũ (kiểm tra bằng phản ứng tạo bọt và SKLM với hệ CHCl3:MeOH:H2O = 65:35:10). Từng dịch rửa được hứng vào cỏc cốc cú mỏ sạch và làm khụ đến cắn.
Định tớnh saponin trong cỏc cắn thu được bằng phản ứng tạo bọt Căn cứ vào kết quả thu được lựa chọn dung mụi rửa giải thớch hợp để thu được saponin toàn phần.
2.3.3. Định lượng bằng phương phỏp đo quang
Căn cứ vào cỏc tài liệu tham khảo [18], [23], [38] và quy trỡnh thực nghiệm, chỳng tụi tiến hành xõy dựng phương phỏp định lượng như sau:
• Chuẩn bị thuốc thử, dung dịch chuẩn, dung dịch thử và mụi trường
- Chuẩn bị thuốc thử vanillin trong acid acetic băng 50mg/ml: Cõn 0,5g vanillin tinh thể pha trong acid acetic băng vừa đủ 10ml thu được thuốc thử cú nồng độ 50mg/ml.
- Thuốc thử: acid perchloric - Mụi trường: acid acetic băng
- Dung dịch chuẩn: Lấy chớnh xỏc 10,0 mg chất chuẩn Rb1 pha trong EtOH tuyệt đối vừa đủ 100ml thu được dung dịch chuẩn cú nồng độ 0,1mg/ml.
- Dung dịch thử: Cõn chớnh xỏc 10,8 mg cắn toàn phần (thu được sau quỏ trỡnh chiết xuất và tinh chế) pha trong EtOH tuyệt đối vừa đủ 100ml thu được dung dịch thử cú nồng độ 1,08mg/ml.
• Khảo sỏt và tỡm điều kiện đo quang
Khảo sỏt cực đại hấp thụ quang
Do cỏc saponin ớt cú cỏc nối đụi, nhất là nối đụi liờn hợp nờn chỉ hấp thụ tử ngoại ở vựng súng ngắn 195-210 nm. Vỡ vậy để định lượng được saponin bằng phương phỏp đo quang, chỳng tụi tiến hành phản ứng Rosenthalercủa saponin với thuốc thử acid perchloric và vanillin trong acid acetic băng cho sản phẩm màu tớm hoa cà. Sau đú quột phổ trờn mỏy đo quang phổ trong khoảng bước súng từ 300 – 800nm. Cuvet thạch anh l=1cm.
Dung dịch so sỏnh là mẫu trắng được làm song song với mẫu thử, chỉ khụng chứa chất nghiờn cứu.
Khảo sỏt ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng
Nhiệt độ của phản ứng được khảo sỏt bằng cỏch tiến hành phản ứng ở cỏc nhiệt độ khỏc nhau (điều chỉnh nhiệt độ bằng bể điều nhiệt).
Khảo sỏt ảnh hưởng của thời gian phản ứng
Thời gian của phản ứng được được khảo sỏt bằng cỏch tiến hành phản ứng trong cỏc khoảng thời gian khỏc nhau tại nhiệt độ đó xỏc định. Phản ứng tạo màu được cho là ổn định khi giỏ trị độ hấp thụ của nú ớt dao động.
Khảo sỏt ảnh hưởng của nồng độ thuốc thử vanillin
Nồng độ thuốc thử vanillin được khảo sỏt bằng cỏch tiến hành phản ứng với những lượng thuốc thử vanillin khỏc nhau trong cựng điều kiện phản ứng đó chọn.
Khảo sỏt ảnh hưởng của nồng độ acid perchloric
Nồng độ thuốc thử acid perchloric được khảo sỏt bằng cỏch tiến hành phản ứng với những lượng thuốc thử acid perchloric khỏc nhau trong cựng điều kiện phản ứng đó chọn.
2.3.4. Thẩm định và đỏnh giỏ phương phỏp
• Xỏc định khoảng nồng độ tuyến tớnh
Độ tuyến tớnh của một phương phỏp phõn tớch là sự phụ thuộc tuyến tớnh giữa đại lượng đo được (y) và nồng độ chất cần phõn tớch (x) trong khoảng xỏc định, được biểu thị bằng phương trỡnh y = ax + b và hệ thống tương quan tuyến tớnh R.
Cỏch xỏc định: khảo sỏt trờn 1 dóy chất chuẩn cú nồng độ biến thiờn.
Xỏc định sự phụ thuộc tuyến tớnh giữa nồng độ và mật độ quang bằng phương trỡnh hồi quy tuyến tớnh.
Yờu cầu đường hồi quy phải cú dạng đường thẳng và giỏ trị hệ số tương quan r ≥ 0,99 [16]
• Độ lặp lại của phương phỏp
Độ lặp lại của một phương phỏp phỏp phõn tớch là mức độ thống nhất giữa cỏc kết quả riờng biệt khi quy trỡnh phõn tớch được ỏp dụng lặp đi lặp lại nhiều lần trờn cựng một mẫu đồng nhất [16].
Độ lặp lại được biểu thị bằng RSD. Tiến hành:
- Phõn tớch 1 mẫu 6 lần song song
- Xỏc định kết quả định lượng theo phương trỡnh đường thờm chuẩn, tiến hành trong cựng điều kiện.
- Tớnh độ lặp lại bằng cỏch tớnh độ lệch chuẩn tương đối giữa giỏ trị của cỏc lần định lượng.
• Độ đỳng
- Là mức độ sỏt gần cỏc giỏ trị tỡm thấy trong phõn tớch so với giỏ trị thực. - Cỏc xỏc định: Tiến hành pha 1 dung dịch chuẩn, 6 dung dịch thử riờng biệt theo quy trỡnh chuẩn bị dung dịch chuẩn và dung dịch thử. Thờm vào một mẫu thử một lượng chất chuẩn sao cho tổng nồng độ của chỳng vẫn nằm trong khoảng tuyến tớnh đó khảo sỏt. Độ đỳng sẽ được tớnh bằng tỷ lệ phần trăm giữa lượng chất chuẩn tỡm được so với lượng chất chuẩn thờm vào [16]. Phương phỏp thờm chuẩn vào mẫu được chuẩn bị như sau:
+ Mẫu thử: là cắn dược liệu thu được sau quỏ trỡnh tinh chế được hũa tan trong EtOH tuyệt đối cú nồng độ nằm trong khoảng tuyến tớnh.
+Mẫu thử thờm chuẩn: được tiến hành song song cựng mẫu thử khi thờm 1 lượng chất chuẩn nhất định.
+Tớnh độ thu hồi: Dựa vào phương trỡnh thờm chuẩn tớnh toỏn được nồng độ của từng mẫu thử (Cmẫu thử) và nồng độ của từng mẫu thử thờm chuẩn (Cmẫu thờm chuẩn)
Cthu hồi = Cmẫu thử thờm chuẩn – C mẫu thử Tỷ lệ phần trăm thu hồi (%) =
• Đỏnh giỏ phương phỏp
Để đỏnh giỏ phương phỏp xõy dựng được, chỳng tụi tiến hành so sỏnh với phương phỏp cõn. Định lượng song song cựng 1 mẫu dược liệu 6 lần bằng phương phỏp cõn theo mục 1.3.3 và 6 lần bằng phương phỏp đo quang như trờn. Tiến hành so sỏnh về quy trỡnh, độ lặp lại, hàm lượng saponin thu được và tạp chất.
2.3.5. Phương phỏp xử lý số liệu
+ Sử dụng cỏc phương phỏp xử lý thống kờ trong phõn tớch với cỏc đại lượng đặc trưng kết hợp với sự hỗ trợ tớnh toỏn của Microsoft Office Excel.
Tiến hành thớ nghiệm n lần, thu được cỏc kết quả xi là x1, x2.x3…xn. Khi đú: - Trung bỡnh cỏc kết quả :
- Độ lệch chuẩn : - Độ lệch chuẩn tương đối:
RSD(%) = x 100\ - Sai số chuẩn:
- Sai số tương đối:
- Khoảng tin cậy:
+
Trong đú là kết quả xỏc định lần thứ i; n là số lần xỏc định
+ Tiờu chuẩn Fischer để đỏnh giỏ độ chớnh xỏc hay độ lặp lại của 2 phương phỏp thớ nghiệm khỏc nhau: (S1 > S2)
Ftn > Flt: Độ chớnh xỏc hay độ lặp lại của hai phương phỏp khỏc nhau cú ý nghĩa thống kờ.
Ftn < Flt: Độ chớnh xỏc hay độ lặp lại của hai phương phỏp khỏc nhau khụng cú ý nghĩa thống kờ.
Flt: Tra ở mức tin cậy 95% khi bậc tự do K = n-1.
+ Test T để so sỏnh giỏ trị trung bỡnh kết quả định lượng của 2 phương phỏp khỏc nhau:
= ( với Sp =
Ttn < Tlt: Giỏ trị trung bỡnh kết quả định lượng của 2 phương phỏp khỏc nhau khụng cú ý nghĩa thống kờ.
Ttn > Tlt: Giỏ trị trung bỡnh kết quả định lượng của 2 phương phỏp khỏc nhau cú ý nghĩa thống kờ.
Tlt: Tra ở bảng mức tin cậy 95% khi bậc tự do K = n1 + n2 - 2
2.3.6. Ứng dụng phương phỏp xõy dựng được để định lượng saponin toàn phần trong một số mẫu Giảo cổ lam. trong một số mẫu Giảo cổ lam.
- Tiến hành chiết xuất và tinh chế cỏc mẫu dược liệu theo quy trỡnh đó lựa chọn.
- Trờn cơ sở đó khảo sỏt, chọn nồng độ định lượng mẫu thử nằm trong khoảng tuyến tớnh.
- Sử dụng kĩ thuật thờm chuẩn để xỏc định được nồng độ chất cần phõn tớch cú trong mẫu định lượng, từ đú tớnh ra hàm lượng saponin cú trong mẫu dược liệu.
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ
3.1. KHẢO SÁT PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT VÀ TINH CHẾ MẪU 3.1.1. Khảo sỏt phương phỏp chiết xuất 3.1.1. Khảo sỏt phương phỏp chiết xuất
Tiến hành quỏ trỡnh chiết xuất bằng cỏc phương phỏp như đó trỡnh bày trong mục 2.3.1. Kết quả tớnh hàm lượng saponin toàn phần trong Giảo cổ lam được trỡnh bày túm tắt trong bảng 3.1, chi tiết cỏc thụng số cho từng lần khảo sỏt được thể hiện trong Phụ lục 1.
Bảng 3.1. Hàm lượng saponin toàn phần thu được từ giảo cổ lam bằng cỏc phương phỏp và dung mụi chiết khỏc nhau.
Phương phỏp và dung mụi chiết xuất Hàm lượng saponin thu được (%)
Chiết soxhlet
MeOH : H2O = 4:1 5,21
EtOH 50% 3,5
EtOH 70% 4,23
EtOH 90% 3,12
Chiết hổi lưu
MeOH : H2O = 4:1 4,48 EtOH 50% 3,85 EtOH 70% 4,18 EtOH 90% 3,52 Chiết siờu õm MeOH : H2O = 4:1 5,06 EtOH 50% 4,11 EtOH 70% 5,14 EtOH 90% 3,98 Nhận xột:
- Đối với mỗi phương phỏp chiết, sử dụng dung mụi MeOH : H2O = 4:1 và