Căn cứ vào cỏc tài liệu tham khảo [18], [23], [38] và quy trỡnh thực nghiệm, chỳng tụi tiến hành xõy dựng phương phỏp định lượng như sau:
• Chuẩn bị thuốc thử, dung dịch chuẩn, dung dịch thử và mụi trường
- Chuẩn bị thuốc thử vanillin trong acid acetic băng 50mg/ml: Cõn 0,5g vanillin tinh thể pha trong acid acetic băng vừa đủ 10ml thu được thuốc thử cú nồng độ 50mg/ml.
- Thuốc thử: acid perchloric - Mụi trường: acid acetic băng
- Dung dịch chuẩn: Lấy chớnh xỏc 10,0 mg chất chuẩn Rb1 pha trong EtOH tuyệt đối vừa đủ 100ml thu được dung dịch chuẩn cú nồng độ 0,1mg/ml.
- Dung dịch thử: Cõn chớnh xỏc 10,8 mg cắn toàn phần (thu được sau quỏ trỡnh chiết xuất và tinh chế) pha trong EtOH tuyệt đối vừa đủ 100ml thu được dung dịch thử cú nồng độ 1,08mg/ml.
• Khảo sỏt và tỡm điều kiện đo quang
Khảo sỏt cực đại hấp thụ quang
Do cỏc saponin ớt cú cỏc nối đụi, nhất là nối đụi liờn hợp nờn chỉ hấp thụ tử ngoại ở vựng súng ngắn 195-210 nm. Vỡ vậy để định lượng được saponin bằng phương phỏp đo quang, chỳng tụi tiến hành phản ứng Rosenthalercủa saponin với thuốc thử acid perchloric và vanillin trong acid acetic băng cho sản phẩm màu tớm hoa cà. Sau đú quột phổ trờn mỏy đo quang phổ trong khoảng bước súng từ 300 – 800nm. Cuvet thạch anh l=1cm.
Dung dịch so sỏnh là mẫu trắng được làm song song với mẫu thử, chỉ khụng chứa chất nghiờn cứu.
Khảo sỏt ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng
Nhiệt độ của phản ứng được khảo sỏt bằng cỏch tiến hành phản ứng ở cỏc nhiệt độ khỏc nhau (điều chỉnh nhiệt độ bằng bể điều nhiệt).
Khảo sỏt ảnh hưởng của thời gian phản ứng
Thời gian của phản ứng được được khảo sỏt bằng cỏch tiến hành phản ứng trong cỏc khoảng thời gian khỏc nhau tại nhiệt độ đó xỏc định. Phản ứng tạo màu được cho là ổn định khi giỏ trị độ hấp thụ của nú ớt dao động.
Khảo sỏt ảnh hưởng của nồng độ thuốc thử vanillin
Nồng độ thuốc thử vanillin được khảo sỏt bằng cỏch tiến hành phản ứng với những lượng thuốc thử vanillin khỏc nhau trong cựng điều kiện phản ứng đó chọn.
Khảo sỏt ảnh hưởng của nồng độ acid perchloric
Nồng độ thuốc thử acid perchloric được khảo sỏt bằng cỏch tiến hành phản ứng với những lượng thuốc thử acid perchloric khỏc nhau trong cựng điều kiện phản ứng đó chọn.