2.3.1. Chiết xuất
• Xỏc định độ ẩm của bột dược liệu:
Dược liệu được sấy khụ, cắt nhỏ và nghiền thành bột. Lấy khoảng 1g bột mẫu nghiờn cứu để xỏc định độ ẩm của dược liệu. Bật mỏy đo độ ẩm, điều chỉnh nhiệt độ ở 110oC, rắc bột dược liệu lờn đĩa cõn và trải đều lờn mặt đĩa, đậy đĩa cõn và đợi mỏy tự động hiện kết quả lờn màn hỡnh. Đọc kết quả. Tiến hành 3 lần, lấy kết quả trung bỡnh.
• Chiết xuất:
Để chiết được nhúm chất chứa đối tượng nghiờn cứu phải xõy dựng được cỏc qui trỡnh chiết xuất thớch hợp. Tựy theo tớnh chất của mỗi chất mà sử dụng dung mụi cú độ phõn cực khỏc nhau. Khảo sỏt cỏc phương phỏp và dung mụi khỏc nhau nhằm đảm bảo hợp lớ cả hai yờu cầu: chiết được tối đa lượng chất nghiờn cứu và tối thiểu tạp chất để thuận tiện cho quỏ trỡnh tinh chế và định lượng tiếp theo.
Đối với saponin, chỳng tụi tiến hành khảo sỏt quy trỡnh chiết xuất với 3 phương phỏp: chiết soxhlet, chiết hồi lưu, chiết siờu õm, với mỗi phương phỏp sử dụng 4 dung mụi khỏc nhau là MeOH, EtOH 50%, 70%,90%.
Phương phỏp chiết bằng soxhlet
Hỡnh 2.1. Bộ dụng cụ chiết soxhlet
- Làm tỳi bằng giấy lọc: cắt một miếng giấy lọc vuụng, cuộn trũn, gập đỏy, dựng gim để ghim mộp giấy.
- Cõn chớnh xỏc khoảng 50g bột dược liệu thụ cho vào trong tỳi đó chuẩn bị sẵn, gập miệng tỳi và đặt vào dụng cụ chiết.
- Lắp dụng cụ, đặt lờn nồi cỏch thuỷ. éặt phễu lờn miệng ống sinh hàn. Rút 500ml dung mụi qua phễu (lần lượt là MeOH, EtOH 50%,70%,
90%).
- Chiết hồi lưu nhiều lần cho đến khi saponin được chiết kiệt (kiểm tra bằng SKLM với hệ dung mụi CHCl3:MeOH:H2O = 65:35:10)
- Gộp dịch chiết lọc qua giấy lọc rồi cất thu hồi dung mụi dưới ỏp suất giảm đến cắn. Dựng cắn thu được tiến hành cỏc bước như hỡnh 2.4.
Phương phỏp chiết hồi lưu
Hỡnh 2.2. Bộ dụng cụ chiết hồi lưu
- Cõn chớnh xỏc khoảng 50g bột dược liệu thụ cho vào bỡnh cầu sạch dung tớch 500ml, thấm ẩm bột dược liệu bằng lượng dung mụi vừa đủ rồi thờm dung mụi đến ngập hết dược liệu (tổng 250ml dung mụi), lần lượt là MeOH, EtOH 50%,70%, 90%.
- Lắp dụng cụ, đặt lờn nồi cỏch thủy. Đun sụi trong 30 phỳt. Lấy dịch chiết và lọc. Tiếp tục thờm dung mụi đến ngập dược liệu và chiết đến khi dịch chiết trong suốt (3 lần). Gộp dịch chiết thu được đem lọc rồi cất thu hồi dung mụi dưới ỏp suất giảm đến cắn. Dựng cắn thu được tiến hành cỏc bước như hỡnh 2.4.
Phương phỏp chiết siờu õm
Hỡnh 2.3. Mỏy chiết siờu õm
- Cõn chớnh xỏc khoảng 50g bột dược liệu thụ cho vào cốc cỏ mỏ sạch dung tớch 500ml, thấm ẩm bột dược liệu bằng lượng dung mụi vừa đủ rồi thờm dung mụi đến ngập hết dược liệu (tổng 250ml dung mụi) với dung mụi lần lượt là MeOH, EtOH 50%,70%,
90%. - Tiến hành chiết bằng mỏy siờu õm trong thời gian 10 phỳt, cụng suất 40%. Thu lấy dịch chiết. Tiếp tục thờm dung mụi đến ngập dược liệu và chiết đến khi dịch chiết trong suốt (3 lần). Gộp dịch chiết thu được đem lọc rồi cất thu hồi dung mụi dưới ỏp suất giảm đến cắn. Dựng cắn thu được tiến hành cỏc bước như hỡnh 2.4.
Trong đú S: hàm lượng saponin (%)
a: khối lượng saponin toàn phần (g) M: khối lượng dược liệu (g)
x: Hàm ẩm dược liệu
Hỡnh 2.4. Sơ đồ định lượng saponin toàn phần theo phương phỏp cõn bằng cỏc phương phỏp chiết và dung mụi khỏc nhau.
Cụng thức: Hàm lượng saponin toàn phần
Cõn cắn và tớnh hàm lượng cỏc cắn theo cụng thức: S = ) 1 ( x M a − ì ì100% s
2.3.2. Tinh chế
Căn cứ vào tài liệu tham khảo và quy trỡnh thực nghiệm, chỳng tụi xõy dựng quy trỡnh tinh chế mẫu bằng phương phỏp chiết lỏng-rắn như sau:
• Chuẩn bị
- Nhựa sử dụng: D101, được làm sạch bằng nước cất.
- Cõn khoảng 5g dược liệu, chiết bằng phương phỏp đó lựa chọn, lấy dịch chiết bốc hơi dung mụi đến cắn rồi hũa tan bằng 5ml nước thu được dung dịch (1).
- Chuẩn bị cột: Cột thủy tinh cú khúa và nỳt mài, đường kớnh 2,5cm; chiều dài 25cm; rửa sạch, sấy khụ, cố định trờn giỏ theo chiều thẳng đứng, lút một lớp bụng thủy tinh ở đỏy cột.
- Chất nhồi cột: 20g nhựa hấp phụ (đó làm sạch) ngõm trong dung dịch (1) trong 60 phỳt, vừa ngõm vừa lắc nhẹ để quỏ trỡnh hấp phụ xảy ra hoàn toàn.
• Khảo sỏt dung mụi rửa giải
Để lựa chọn dung mụi rửa giải thớch hợp, chỳng tụi tiến hành khảo sỏt dung mụi rửa giải từ nước cất, EtOH 10% đến EtOH 90%, MeOH
- Nhồi cột: Đưa nhựa hấp phụ ngõm trong dung dịch (1) vào cột từ từ, vừa rút vừa gừ nhẹ để đuổi hết bọt khớ.
- Rửa giải:
Ban đầu rửa giải bằng nước đến hết màu.
Lần lượt rửa giải với cỏc dung mụi EtOH 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% và MeOH. Chuyển dung mụi mới khi đó rửa kiệt saponin bằng dung mụi cũ (kiểm tra bằng phản ứng tạo bọt và SKLM với hệ CHCl3:MeOH:H2O = 65:35:10). Từng dịch rửa được hứng vào cỏc cốc cú mỏ sạch và làm khụ đến cắn.
Định tớnh saponin trong cỏc cắn thu được bằng phản ứng tạo bọt Căn cứ vào kết quả thu được lựa chọn dung mụi rửa giải thớch hợp để thu được saponin toàn phần.