3.1.1. Khảo sỏt phương phỏp chiết xuất
Tiến hành quỏ trỡnh chiết xuất bằng cỏc phương phỏp như đó trỡnh bày trong mục 2.3.1. Kết quả tớnh hàm lượng saponin toàn phần trong Giảo cổ lam được trỡnh bày túm tắt trong bảng 3.1, chi tiết cỏc thụng số cho từng lần khảo sỏt được thể hiện trong Phụ lục 1.
Bảng 3.1. Hàm lượng saponin toàn phần thu được từ giảo cổ lam bằng cỏc phương phỏp và dung mụi chiết khỏc nhau.
Phương phỏp và dung mụi chiết xuất Hàm lượng saponin thu được (%)
Chiết soxhlet
MeOH : H2O = 4:1 5,21
EtOH 50% 3,5
EtOH 70% 4,23
EtOH 90% 3,12
Chiết hổi lưu
MeOH : H2O = 4:1 4,48 EtOH 50% 3,85 EtOH 70% 4,18 EtOH 90% 3,52 Chiết siờu õm MeOH : H2O = 4:1 5,06 EtOH 50% 4,11 EtOH 70% 5,14 EtOH 90% 3,98 Nhận xột:
- Đối với mỗi phương phỏp chiết, sử dụng dung mụi MeOH : H2O = 4:1 và EtOH 70% luụn cho hàm lượng saponin thu được cao nhất.
- Phương phỏp chiết bằng soxhlet với dung mụi MeOH : H2O = 4:1 cho kết quả tốt nhất (5,21%), phương phỏp chiết siờu õm với dung mụi EtOH 70% cho kết quả gần tương đương (5,14%).
- So sỏnh 2 phương phỏp trờn nhận thấy
+ Chiết soxhlet cú ưu điểm là cú thể chiết kiệt dược liệu, cho hàm lượng saponin cao. Tuy nhiờn phương phỏp này tốn thời gian, phải sử dụng dung mụi đắt tiền và độc hại.
+ Chiết siờu õm với EtOH 70% là phương phỏp chiết đơn giản, nhanh chúng, dung mụi rẻ tiền, an toàn và hàm lượng saponin thu được gần như tương đương với phương phỏp trờn. Vỡ vậy phương phỏp này được chỳng tụi lựa chọn sử dụng.
3.1.2. Khảo sỏt phương phỏp tinh chế
• Khảo sỏt dung mụi rửa giải
Tiến hành khảo sỏt dung mụi rửa giải theo mục 2.3.2. Kết quả được trỡnh bày trong bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả khảo sỏt dung mụi rửa giải
STT Dung mụi KQ Định tớnh STT Dung mụi KQ định tớnh
1 H2O - 7 EtOH 60% +
2 EtOH 10% - 8 EtOH 70% +
3 EtOH 20% - 9 EtOH 80% +
4 EtOH 30% + 10 EtOH 90% -
5 EtOH 40% + 11 EtOH tuyệt đối -
6 EtOH 50% + 12 MeOH -
Như vậy: Saponin được rửa giải với dung mụi EtOH 30˚ đến EtOH 80˚ Sử dụng dung mụi EtOH 20˚ để loại tạp và EtOH 80˚ để thu saponin
• Đỏnh giỏ phương phỏp tinh chế
Phương phỏp tinh chế bằng chiết lỏng-rắn sử dụng nhựa hấp phụ cú những ưu điểm nổi bật:
- Khả năng tinh chế tụt, loại được hầu hết cỏc tạp chất trong dịch chiết và khụng làm mất mỏt saponin trong quỏ trỡnh tinh chế. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Khắc phục được những nhược điểm của phương phỏp chiết lỏng-lỏng là quy trỡnh phức tạp, tốn thời gian, cần dựng nhiều dung mụi đắt tiền, dễ chỏy nổ, độc hại với người phõn tớch và với mụi trường.
Vỡ vậy chỳng tụi lựa chọn phương phỏp chiết lỏng-rắn sử dụng nhựa hấp phụ D101 để tinh chế dịch chiết, thu được saponin toàn phần.
Hỡnh 3.1. Quy trỡnh tinh chế saponin bằng chiết lỏng-rắn và chiết lỏng-lỏng.
3.1.3. Quy trỡnh xử lớ mẫu
Từ kết quả khảo sỏt phương phỏp chiết xuất và khảo sỏt dung mụi rửa giải, chỳng tụi đưa ra quy trỡnh xử lớ mẫu để thu được saponin toàn phần trong GCL như sau:
- Dược liệu được nghiền thành bột thụ. Cõn chớnh xỏc khoảng 20g bột dược liệu, chiết bằng mỏy siờu õm 3 lần, mỗi lần 10 phỳt với 250ml dung mụi EtOH 70%. Bốc hơi dịch chiết đến dung dịch đậm đặc (khoảng 20ml)
- Nhựa hấp phụ D101: được làm sạch bằng nước cất và ngõm vào dung dịch đậm đặc thu được trong 60 phỳt, vừa ngõm vừa lắc nhẹ để quỏ trỡnh hấp phụ xảy ra hoàn toàn. Tỉ lệ nhựa sử dụng khoảng 4g nhựa/1g dược liệu.
- Chuẩn bị cột: Cột thủy tinh cú khúa và nỳt mài, đường kớnh 4.5cm, chiều dài 65cm, rửa sạch, sấy khụ, cố định trờn giỏ theo chiều thẳng đứng, lút một lớp bụng thủy tinh ở đỏy cột.
- Nhồi cột: Đưa nhựa đó bóo hũa lờn cột từ từ, vừa rút vừa gừ nhẹ để đuổi hết bọt khớ.
- Rửa giải:
Bước 1: Rửa cột bằng nước cất đến hết màu
Bước 2: Rửa cột với dung dịch EtOH 20% để loại tạp.
Bước 3: Rửa cột với dung dịch EtOH 80% đến hết saponin (kiểm tra bằng phản ứng tạo bọt và SKLM).
Thu dịch EtOH 80%, cất thu hồi dung mụi dưới ỏp suất giảm đến cắn. Bảo quản cắn ở 4o
C.
3.3. KHẢO SÁT CỰC ĐẠI HẤP THỤ QUANG VÀ ĐIỀU KIỆN PHẢN ỨNG 3.3.1. Khảo sỏt cực đại hấp thụ quang 3.3.1. Khảo sỏt cực đại hấp thụ quang
Để khảo sỏt cực đại hấp thụ quang chỳng tụi tiến hành như sau:
- Hỳt chớnh xỏc 5,0 ml dung dịch chuẩn (được chuẩn bị theo mục 2.3.3) vào bỡnh định mức 5ml, đun cỏch thủy đến cắn, thờm 0,3 ml vanillin/acid acetic băng (TT) và 0,6ml acid perchloric (TT), lắc đều và đặt vào bể điều nhiệt ở 80 độ C trong 10 phỳt, sau đú làm lạnh nhanh trong cốc nước đỏ và thờm dung dịch acid acetic băng đến vạch.
- Dung dịch so sỏnh là mẫu trắng được chuẩn bị song song với mẫu thử, chỉ khụng chứa chất chuẩn phõn tớch.
- Quột phổ trờn mỏy đo quang phổ trong khoảng bước súng từ 300 – 800nm. Kết quả thu được như hỡnh 3.3.
Hỡnh 3.2. Phổ hấp thụ của sản phẩm tạo thành
Từ kết quả trờn cho thấy, độ hấp thụ quang của dung dịch đạt giỏ trị cực đại tại bước súng 548nm -> 550nm. Do đú chỳng tụi chọn 550nm là bước súng khảo sỏt.
3.3.2. Khảo sỏt điều kiện phản ứng
Là phản ứng tạo màu, nhằm xỏc định cỏc điều kiện tối ưu cho quỏ trỡnh này, chỳng tụi khảo sỏt 3 yếu tố của phản ứng là nhiệt độ phản ứng, thời gian phản ứng và nồng độ thuốc thử.
• Khảo sỏt nhiệt độ phản ứng
Chuẩn bị 6 bỡnh định mức dung tớch 5ml, đỏnh số từ 1-6. Hỳt chớnh xỏc vào 5 bỡnh mỗi bỡnh 1ml dung dịch chuẩn, làm khụ đến cắn. Thờm vào cả 6 bỡnh 0,3ml thuốc thử vanillin và 0,6ml thuốc thử acid perchloric, đặt bỡnh vào bể điều nhiệt với cỏc nhiệt độ tương ứng (50˚C, 60˚C, 70˚C, 80˚C, 90˚C) trong 10 phỳt, sau đú làm lạnh nhanh, thờm acid acetic đến vạch và đo quang tại bước súng 550 nm, bỡnh 6 là mẫu trắng. Kết quả được trỡnh bày trong bảng 3.3.
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới phản ứng
T (˚C) 50 60 70 80 90
D 0,184 0,264 0,349 0,357 0,353
Hỡnh 3.3. Đồ thị ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nhận xột: Từ kết quả trờn cho thấy, ở nhiệt độ 80 - 90˚C mật độ hấp thụ quang đạt cực đại và khụng cú sự chờnh nhiều. Vỡ thế ở cỏc thớ nghiệm tiếp theo chỳng tụi tiến hành phản ứng ở nhiệt độ 80˚C (cỏc phản ứng tiến hành trong bể điều nhiệt)
• Khảo sỏt ảnh hưởng của thời gian phản ứng
Tiến hành
Chuẩn bị 8 bỡnh định mức dung tớch 5ml, đỏnh số từ 1-8.
Hỳt chớnh xỏc vào 7 bỡnh (từ 1-7) mỗi bỡnh 1ml dung dịch chuẩn, làm khụ đến cắn. Thờm vào cả 8 bỡnh 0,3ml thuốc thử vanillin và 0,6ml thuốc thử acid perchloric, lắc đều. Cho vào bể điều nhiệt ở 80˚C trong những khoảng thời gian nhất định (5 phỳt, 10 phỳt, 15 phỳt, 20 phỳt, 25 phỳt, 30 phỳt, 40 phỳt), sau đú làm lạnh nhanh trong cốc nước đỏ, thờm acid acetic băng đến vạch, lắc đều và đo độ hấp thụ tại 550nm. Bỡnh 8 là mẫu trắng. Kết quả khảo sỏt thu được như bảng 3.4.
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng
T (phỳt) 5 10 15 20 25 30 40
Hỡnh.3.4. Đồ thị ảnh hưởng của thời gian phản ứng
Nhận xột: Kết quả trờn cho thấy sau 20 phỳt phản ứng, độ hấp thụ đạt cực đại và gần như khụng thay đổi khi tăng thời gian. Vỡ thế ở cỏc thớ nghiệm tiếp theo chỳng tụi tiến hành phản ứng trong thời gian 20 phỳt.
• Khảo sỏt ảnh hưởng của nồng độ thuốc thử vanillin
Tiến hành.
Chuẩn bị 6 bỡnh định mức dung tớch 5ml, đỏnh số từ 1-6.
Hỳt chớnh xỏc vào 5 bỡnh (từ 1-5), mỗi bỡnh 1ml dung dịch chuẩn, làm khụ đến cắn.Thờm vào cả 6 bỡnh lượng thuốc thử vanillin tương ứng như trong bảng và 0,6ml thuốc thử acid perchloric, lắc đều. Cho cỏc bỡnh vào bể điều nhiệt ở nhiệt độ 80˚C trong 20 phỳt, sau đú làm lạnh nhanh trong cốc nước đỏ, thờm acid acetic đến vạch, lắc đều và đem đo độ hấp thụ ở 550nm. Bỡnh 6 là mẫu trắng.
Kết quả thu được như bảng 3.5.
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ thuốc thử vanillin
Vvanilin (TT) (ml) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Cvanilin (TT) (mg/ml) 1 2 3 4 5
Hỡnh 3.5. Đồ thị ảnh hưởng của nồng độ thuốc thử Vanilin
Nhận xột: Kết quả trờn cho thấy khi dựng 0.3 ml thuốc thử vanillin/acid acetic băng (tương ứng với nồng độ thuốc thử là 3mg/ml) thỡ mật độ quang đạt giỏ trị cực đại. Do đú trong cỏc thớ nghiệm tiếp theo, chỳng tụi chọn giỏ trị này để khảo sỏt.
• Khảo sỏt ảnh hưởng của nồng độ acid perchloriC
Chuẩn bị 8 bỡnh định mức dung tớch 5ml, đỏnh số từ 1-8.
Hỳt chớnh xỏc vào 7 bỡnh (từ 1-7), mỗi bỡnh 1ml dung dịch chuẩn, làm khụ đến cắn.Thờm vào cả 8 bỡnh 0,3ml thuốc thử vanillin và 1 lượng thuốc thử acid perchloric tương ứng như trong bảng, lắc đều. Cho cỏc bỡnh vào bể điều nhiệt ở nhiệt độ 80˚C trong 20 phỳt, sau đú làm lạnh nhanh trong cốc nước đỏ, thờm acid acetic đến vạch, lắc đều và đem đo độ hấp thụ ở 550nm. Bỡnh 8 là mẫu trắng.
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ acid perchloric
Va.perchloric (ml) 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 Ca.perchloric (g/ml) 0,0668 0,1336 0,2004 0,2672 0,334 0,4008 0,4676 Ca.perchloric (ml/ml) 0,04 0,08 0,12 0,16 0,2 0,24 0,28
Hỡnh 3.6. Đồ thị ảnh hưởng của nồng độ acid perchloric
Nhận xột: Khi thể tớch a.perchloric bằng 0,8ml (tương ứng nồng độ 0,2672mg/ml) thỡ mật độ quang đạt giỏ trị cực đại. Do đú, chỳng tụi chọn giỏ trị này để khảo sỏt.
Kết luận: Từ kết quả quỏ trỡnh khảo sỏt chỳng tụi đưa ra điều kiện định lượng như sau:
- Nồng độ thuốc thử Vanilin: 3 mg/ml.
- Nồng độ thuốc thử acid perchloric: 0,16 ml/ml (tt/tt) - Nhiệt độ phản ứng: 80˚C .
- Thời gian phản ứng: 20 phỳt. - Bước súng đo quang: 550 nm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.4. THẨM ĐỊNH VÀ ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP UV-VIS KHI ĐỊNH LƯỢNG SAPONIN TOÀN PHẦN TRONG GIẢO CỔ LAM. LƯỢNG SAPONIN TOÀN PHẦN TRONG GIẢO CỔ LAM.
3.4.1. Thẩm định phương phỏp
• Xỏc định khoảng tuyến tớnh
Chuẩn bị 8 bỡnh định mức dung tớch 5ml được đỏnh số từ 1 đến 8. Hỳt chớnh xỏc vào 7 bỡnh định mức (từ 1 đến 7) cỏc thể tớch dung dịch chuẩn lần lượt là 0,2ml, 0,6ml, 1,0ml, 1,4ml, 1,8ml, 2,2ml, 2,6ml, làm khụ đến cắn bằng đun cỏch thủy. Lần lượt cho vào cả 8 bỡnh 0,3ml thuốc thử vanillin, 0,8ml thuốc thử acid perchloric rồi đặt vào bể điều nhiệt ở 80 C trong 20 phỳt. Sau đú làm lạnh nhanh trong cốc nước
đỏ, thờm acid acetic băng đến vạch, lắc đều, đo độ hấp thụ tại 550nm. Mẫu trắng là bỡnh thứ 8.
Kết quả được trỡnh bày trong bảng 3.7.
Bảng 3.7. Kết quả xõy dựng đường chuẩn
mchuẩn (mg) 0,02 0,06 0,1 0,14 0,18 0,22 0,26
Cchuẩn (àg/ml) 4 12 20 28 36 44 52
D 0,096 0,31 0,508 0,708 0,912 1,118 1,375 Phương trỡnh hồi quy tuyến tớnh D = 0,026 x C - 0,014
Hệ số tương quan R= 0,999
Hỡnh 3.7. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc mật độ quang vào nồng độ chất chuẩn tại bước súng 550nm
Nhận xột: Như vậy trong khoảng khảo sỏt nồng độ từ 4 – 52àg/ml, tại bước súng 550nm cho thấy cú sự phụ thuộc tuyến tớnh giữa độ hấp thụ và nồng độ chất khảo sỏt với hệ số tương quan rất gần 1 (R>0.99), chứng tỏ cú sự tương quan tuyến tớnh chặt chẽ giữa độ hấp thụ và nồng độ chất khảo sỏt.
• Khảo sỏt độ lặp lại của phương phỏp
Bỡnh 1: Hỳt chớnh xỏc 1ml dung dịch thử được chuẩn bị ở mục 2.3.3, làm khụ đến cắn bằng đun cỏch thủy
Bỡnh 2-6: Hỳt chớnh xỏc 1ml dung dịch thử và lần lượt 0,2ml, 0,4ml, 0,6ml, 0,8ml, 1,0ml dung dịch chuẩn (tương ứng với nồng độ chuẩn lần lượt là 4-8-12-16- 20 àg/ml) làm khụ đến cắn bằng đun cỏch thủy.
Lần lượt cho vào cả 7 bỡnh 0,3ml thuốc thử vanillin, 0,8ml thuốc thử acid perchloric rồi đặt vào bể điều nhiệt ở 80 C trong 20 phỳt. Sau đú làm lạnh nhanh trong cốc nước đỏ, thờm acid acetic băng đến vạch, lắc đều, đo độ hấp thụ tại 550nm. Mẫu trắng là bỡnh thứ 7. Hàm lượng saponin được tớnh dựa vào đường chuẩn thu được.
Tiến hành lặp lại 6 lần quy trỡnh trờn. Kết quả được trỡnh bày trong bảng 3.8 và hỡnh 3.8.
Bảng 3.8. Kết quả khảo sỏt độ lặp lại của phương phỏp
Lần Mật độ quang (D) Csaponin (àg/ml) Hàm lượng saponin/ mẫu thử (àg/ml) B1 B2 B3 B4 B5 B6 1 0,496 0,605 0,683 0,81 0,914 0,998 19,8400 99,2000 2 0,511 0,608 0,736 0,819 0,961 1,091 18,0370 90,1850 3 0,502 0,584 0,713 0,828 0,943 1,007 19,2222 96,1110 4 0,509 0,589 0,705 0,834 0,924 0,989 20,2000 101,0000 5 0,512 0,601 0,699 0,836 0,912 1,072 18,3704 91,8520 6 0,504 0,597 0,694 0,818 0,929 1,022 19,0385 95,1925 Số liệu thống kờ 95,6901 S =1,074 RSD (%)=5,62
Hỡnh 3.8. Đồ thị xỏc định hàm lượng saponin toàn phần cú trong mẫu GCL theo kỹ thuật thờm đường chuẩn.
Nhận xột: Kết quả khảo sỏt độ lặp lại của phương phỏp cho thấy độ lệch chuẩn tương đối của cỏc phộp thử RSD (%) trong khoảng cho phộp. Như vậy phương phỏp cú độ lặp lại cao.
•Khảo sỏt độ đỳng của phương phỏp.
- Lấy chớnh xỏc 2 ml dung dịch chuẩn Rb1 cho vào bỡnh định mức 10ml, sau đú thờm dung dịch thử vừa đủ tới vạch, lắc đều thu được dung dịch tổng. Sử dụng dung dịch thử cú nồng độ trung bỡnh là 95,6901 àg/ml.
- Chuẩn bị 7 bỡnh định mức dung tớch 5 ml, đỏnh số từ 1 đến 7.
Bỡnh 1: cho 1ml dung dịch tổng. Bỡnh 2-6: cho 1ml dung dịch tổng và lần lượt 0,2ml; 0,4ml; 0,6ml; 0,8ml dung dịch chuẩn. Cụ cỏch thủy đến cắn. Thờm vào cả 7 bỡnh 0,3ml thuốc thử vanillin, 0,8ml thuốc thử acid perchloric rồi đặt vào bể điều nhiệt ở 80 C trong 20 phỳt. Sau đú làm lạnh nhanh trong cốc nước đỏ, thờm acid acetic băng đến vạch, lắc đều, đo độ hấp thụ tại 550nm. Bỡnh 7 là mẫu trắng.
- Tiến hành lặp lại 6 lần quy trỡnh trờn. Kết quả được tổng hợp trong bảng 3.9. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 3.9. Kết quả khảo sỏt độ đỳng của phương phỏp
Lần
Cthử trung
bỡnh
(àg/ml)
Cchuẩn
(àg/ml) Cdung dịch tổng Cchuẩn thu hồi (àg/ml) Tỷ lệ thu hồi (%) 1 15,3104 4,00 19,2800 3,9696 99,24 2 19,2573 3,9469 98.67 3 19,0768 3,7664 94.16 4 19,1512 3,8408 96.02 5 19,4036 4,0932 102.33 6 19,2172 3,9068 97.67 Trung bỡnh 96,0150 RSD (%) 3,71
Nhận xột: Kết quả khảo sỏt cho thấy phương phỏp phõn tớch đó lựa chọn cho tỷ lệ thu hồi cao, cú độ đỳng tốt.
3.4.2. Đỏnh giỏ phương phỏp.
Tiến hành song song định lượng saponin toàn phần trong GCL bằng phương phỏp cõn và phương phỏp đo quang. Làm 3 lần với mỗi phương phỏp. Kết quả thu được như sau:
Bảng 3.10. Kết quả định lượng saponin toàn phần trong GCL bằng phương phỏp cõn và phương phỏp UV-VIS
Lần Hàm lượng saponin toàn phần (%)
Phương phỏp cõn Phương phỏp đo quang
1 5,3246 5,2106 2 5,4174 5,1247 3 5,6951 5,3736 = 5,4790 S = 0,1928 = 5,2363 S = 0,1264
• So sỏnh độ lặp lại của 2 phương phỏp.
Đỏnh giỏ bằng chuẩn F (Fisher): = 2,3266 Trong đú:
S1: Độ lệch chuẩn của phương phỏp cõn S2: Độ lệch chuẩn của phương phỏp UV-VIS
Ở mức độ tin cậy 95%, bậc tự do K1= 3-1=2; K2= 3-1=2 thỡ Flt (0,05;2;2) = 19,000 Nhận xột: Ftn < Flt nờn độ lặp lại của hai phương phỏp định lượng saponin toàn phần khỏc nhau khụng cú ý nghĩa thống kờ.
• So sỏnh giỏ trị trung bỡnh kết quả của 2 phương phỏp.
Do độ lặp lại của 2 phương phỏp khỏc nhau khụng cú ý nghĩa thống kờ nờn để so sỏnh kết quả giỏ trị trung bỡnh của 2 phương phỏp, chỳng tụi sử dụng test T.
Ta cú: Sp = = 0,1630 = = 1,8236 Ở mức độ tin cậy 95%, bậc tự do K=3+3-2 =4 thỡ Tlt (0,05;4) = 2,776