Nghiên cứu phát hiện dexamethason trong một số chế phẩm đông dược bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ DUYÊN NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN DEXAMETHASON TRONG MỘT SỐ CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỚP MỎNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2013 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ DUYÊN NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN DEXAMETHASON TRONG MỘT SỐ CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỚP MỎNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. PGS .TS. Nguyễn Thị Kiều Anh Nơi thực hiện: Phòng phân tích , kiểm nghiệm và tương đương sinh học HÀ NỘI - 2013 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh – người đã trực tiếp hướng dẫn và chỉ bảo tận tình cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài này. Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ nhiệt tình của các thầy cô, anh chị công tác tại Phòng Phân tích, kiểm nghiệm và tương đương sinh học - Viện công nghệ Dược phẩm quốc gia trong quá trình em làm thực nghiệm tại phòng. Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến: Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất. Bộ môn Dược cổ truyền. Đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khóa luận này. Và cuối cùng em xin bày tỏ lòng yêu thương, biết ơn tới gia đình và bạn bè những người đã luôn động viên, giúp đỡ em trong quá trình học tập và hoàn thành khóa luận. Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2013 Sinh viên Nguyễn Thị Duyên MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 3 1.1. Vài nét về Glucocorticoid 3 1.1.1. Tác dung và tác dụng không mong muốn của Glucocorticoid 3 Tác dụng 3 Tác dụng không mong muốn 3 1.1.2. Đại cương về dexamethason và dexamethason acetat 4 1.1.2.1. Dexamethason 4 1.1.2.2. Dexamethason acetat 6 1.2. Một số nghiên cứu xác định dexamethason và dexamethason acetat 7 1.3. Thực trạng thuốc đông dược và thực phẩm chức năng bị trộn tân dược 9 1.4. Phương pháp xử lý mẫu 10 1.4.1. Phương pháp chiết trực tiếp 11 1.4.2. Phương pháp chiết lỏng lỏng 11 1.4.3. Phương pháp chiết pha rắn 11 1.5. Tổng quan về sắc ký lớp mỏng 12 1.5.1. Nguyên tắc 12 1.5.2. Pha tĩnh 13 1.5.3. Pha động 13 1.5.4. Dụng cụ 14 1.5.5. Ứng dụng của SKLM 15 1.5.6. Ưu nhược điểm của phương pháp sắc ký lớp mỏng 17 CHƯƠNG II: NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NÔI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị 18 2.1.1. Máy móc, thiết bị 18 2.1.2. Hóa chất, dung môi, chất chuẩn 18 2.2. Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu 19 2.2.1. Đối tượng nghiên cứu: 19 2.2.2. Nội dung nghiên cứu 21 2.2.3. Phương pháp nghiên cứu. 21 CHƯƠNG III. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23 3.1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện phân tích. 23 3.1.1. Chuẩn bị các dung dịch chuẩn gốc: 23 3.1.2. Xử lý mẫu 23 3.1.2.1. Mẫu rắn 23 3.1.2.2. Mẫu lỏng 24 3.1.3. Khảo sát, chọn hệ dung môi sắc ký 24 3.1.4. Khảo sát điều kiện phát hiện 27 3.2. Đánh giá phương pháp 29 3.2.1. Tính chọn lọc 29 3.2.2. Giới hạn phát hiện 30 3.2.3. Độ lặp lại và độ tìm lại 33 3.3. Áp dụng trên một số mẫu thử 36 3.4. Bàn luận 42 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ACN DAD DM DMKT GC HPLC LC-MS MeOH R f SKĐ SKLM S/N SPE STT TLC TLTK TPCN t R UV VIS : Acetonitril : Detector diod array : Dung môi : Dung môi khai triển : Glucocorticoid : Sắc ký lỏng hiệu năng cao : Sắc ký lỏng khối phổ : Methanol : Hệ số lưu giữ : Sắc ký đồ : Sắc ký lớp mỏng : Signal/noise : Solid phase extration : Số thứ tự : Sắc ký lớp mỏng : Tài liệu tham khảo : Thực phẩm chức năng : Thời gian lưu : Tử ngoại : Khả kiến DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Một số nghiên cứu chiết dexamethason và dexamethason acetat 7 Bảng 1.2: Một số nghiên cứu phát hiện dexamethason và dexamethason acetat 8 Bảng 1.3 : Một số chất thường dùng làm pha tĩnh cho SKLM 13 Bảng 2.1: Các mẫu thuốc được phân tích 20 Bảng 3.1. Kết quả xác định LOD 33 Bảng 3.3: Kết quả kiểm tra bằng SKLM trên 5 chế phẩm đông dược 38 Bảng 3.4: Kết quả kiểm tra bằng HPLC trên 5 chế phẩm đông dược 41 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 3.1. SKĐ sắc ký với hệ DM1 25 Hình 3.2. SKĐ sắc ký với hệ DM2 25 Hình 3.3. SKĐ khảo sát DM trên nền mẫu rắn 27 Hình 3.4. SKĐ khảo sát DM trên nền mẫu lỏng 27 Hình 3.5. SKĐ khảo sát tìm điều kiện phát hiện (UV-254 nm) 28 Hình 3.6. SKĐ khảo sát tìm điều kiện phát hiện vết (phun dung dịch acid sulfuric trong ethanol) 28 Hình 3.7. SKĐ đánh giá tính chọn lọc (mẫu rắn) 29 Hình 3.8. SKĐ đánh giá tính chọn lọc (mẫu lỏng) 29 Hình 3.9. SKĐ giới hạn phát hiện của Dexamethason và Dexamethason acetat 31 Hình 3.10. SKĐ analog xác định LOD 32 Hình 3.11. SKĐ đánh giá độ lặp lại của phương pháp chiết 34 Hình 3.12. SKĐ chụp ảnh và analog của dịch chiết mẫu tự tạo R 34 Hình 3.13. SKĐ chụp ảnh và analog của dung dịch chuẩn hỗn hợp 0,5 mg/ml 35 Hình 3.14. SKĐ của mẫu thử 37 Hình 3.15: Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp dexamethason và dexamethason acetat 38 Hình 3.16. Phổ hấp thụ tại pic chất chuẩn 39 Hình 3.17. SKĐ mẫu thuốc trị Viêm mũi 39 Hình 3.18. Phổ hấp thụ của mẫu thuốc trị viêm mũi tương ứng với t R = 8,539 39 Hình 3.19.SKĐ mẫu bột thuốc của cơ sở Đặng Đình Toàn 40 Hình 3.20. Phổ hấp thụ tương ứng với t R = 8,535 của mẫu bột thuốc của cơ sở Đặng Đình Toàn 40 Hình 3.21. SKĐ mẫu phong tê nhức khớp thủy 40 Hình 3.22. SKĐ mẫu phong tê cốt thống thủy 41 Hình 3.23. Phổ hấp thụ tương ứng với t R = 8,546 của mẫu phong tê cốt thống thủy 41 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Từ thế kỷ trước, Y học phương Tây, mà người ta quen gọi là “Y học hiện đại”, đã trở thành hệ thống y học chính thống ở hầu hết các quốc gia trên Thế giới, kể cả các nước Đông Nam Á. Thế nhưng, trong những năm gần đây, các loại thuốc có nguồn gốc tự nhiên của Y học truyền thống ở phương Đông (Đông dược) ngày càng được nhiều người, ở cả phương Đông và phương Tây chú ý, ưa chuộng và sử dụng ngày càng nhiều bởi tính an toàn và hiệu quả đáng tin cậy, lâu dài của nó. Tuy nhiên, nhằm tạo ra những hiệu quả tức thời cho người bệnh, giảm đau, ăn ngon, ngủ yên, tăng cân, sinh lực dồi dào , nhiều cơ sở sản xuất thuốc y học cổ truyền và cơ sở chữa bệnh tư nhân đã trộn trái phép vào thuốc đông dược, thực phẩm chức năng một số loại tân dược. Hậu quả của việc dùng thuốc đông y trộn tân dược sẽ rất trầm trọng và khó lường trước được những mối nguy hiểm, vì người bệnh cứ tin chắc rằng đang uống thuốc có nguồn gốc dược liệu nên an toàn và uống kéo dài. Nhóm glucocorticoid là nhóm thuốc chống dị ứng, chống viêm mạnh với nhiều tác dụng phụ, khoảng điều trị hẹp, cần được bác sỹ kê đơn và phải theo dõi khi dùng. Các chất này rất hay được trộn một cách khéo léo và tinh vi vào thuốc đông dược có chỉ định điều trị thấp khớp, hen phế quản, gout…hay thuốc bổ do có tác dụng nhanh, mạnh và tác dụng không mong muốn gây tích nước, béo phì giả tạo. Đã có rất nhiều chế phẩm phát hiện có chứa corticoid như: Tân hòa truy phong tê thấp thủy, Hạnh đức khu phong tê thấp thủy (trộn betamethason) [25], mẫu thuốc bột định xuyễn của Trung Quốc có prednisolon acetat, Tăng phì đoàn của Đài Loan, Nam liên truy phong thấu cốt hoàng của Trung Quốc có dexamethason acetat [10]. Dexamethason là một glucocorticoid bán tổng hợp, có tác dụng (chống viêm, chống dị ứng) mạnh, kéo dài, không giữ muối, 2 nước. Do đó nó được dùng rộng rãi và cũng dễ bị trộn trái phép vào thuốc đông dược. Nghiên cứu định tính, định lượng các glucocorticoid trộn trái phép vào thuốc đông dược đã và đang thu hút được nhiều nhóm nghiên cứu, đã có một số công bố về xác định dexamethason, dexamethason acetat bằng các phương pháp khác nhau như: HPLC-MS, HPLC-DAD… Tuy nhiên các phương pháp này yêu cầu máy móc khá đắt tiền. Để đóng góp một phương pháp phân tích nhanh, đơn giản và kinh tế hơn trong xác định chất cấm dexamethason, dexamethason acetat trong thuốc đông dược, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu phát hiện Dexamethason trong một số chế phẩm đông dược bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng” Với mục tiêu cụ thể sau đây: 1. Xây dựng được phương pháp phát hiện dexamethason, dexamethason acetat trong chế phẩm đông dược, thực phẩm chức năng bằng sắc ký lớp mỏng 2. Áp dụng phương pháp xây dựng được để phát hiện dexamethason, dexamethason acetat trong một số chế phẩm đông dược, thực phẩm chức năng (dạng thuốc nước và thuốc rắn) có nghi ngờ trên thị trường. [...]... kiện phát hiện, nhận biết các chất trên bản mỏng • Đánh giá tính chọn lọc, độ lặp lại, độ tìm lại của phương pháp • Xác định giới hạn phát hiện chất phân tích • Áp dụng phương pháp phân tích đã xây dựng đã xây dựng để kiểm tra một số mẫu thuốc đông dược và thực phẩm chức năng • Đánh giá kết quả phân tích mẫu thử 2.2.3 Phương pháp nghiên cứu • Xử lý mẫu: Dựa trên nguyên tắc của các kỹ thuật xử lý mẫu dược. .. tách, tinh chế, làm giàu mẫu, đặc biệt hiệu quả cho các mẫu dịch sinh học, phân tích vi lượng, môi trường 1.5 Tổng quan về sắc ký lớp mỏng 1.5.1 Nguyên tắc Sắc ký lớp mỏng (SKLM) (Thin Layer Chromatography) là một kỹ thuật phân tích dùng để tách các chất trong hỗn hợp Phương pháp SKLM bao gồm pha tĩnh là một lớp mỏng chất hấp phụ được phủ trên một mặt phẳng trơ, pha động là chất lỏng gồm một hay nhiều... biến mất trong ethanol - Khoảng 10 mg chế phẩm cho phản ứng của nhóm acetyl  Liều dùng trung bình: 0,5-10 mg/ngày [6], [10] 1.2 Một số nghiên cứu xác định dexamethason và dexamethason acetat Bảng 1.1: Một số nghiên cứu chiết dexamethason và dexamethason acetat TLTK [10] Nền mẫu Thuốc nước PP chiết Chiết pha rắn Dung môi/cột Cột 250SPE (500mg C18 và HLB; 8ml [11] Kem Trực tiếp [9] Chế phẩm đông Trực... kiện phát hiện vết (phun dung dịch acid sulfuric trong ethanol) Nhận xét: Phát hiện bằng cách phun dung dịch acid sulfuric 20% trong Hình 3.5 SKĐ khảo sát tìm điều kiện phát hiện (UV-254 nm) ethanol rồi soi đèn tử ngoại ở bước sóng 366 nm có độ nhạy cao hơn Nhưng do điều kiện thực tế, chúng tôi chỉ sử dụng cách phát hiện vết bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm Vậy điều kiện sắc ký để phát hiện dexamethason. .. Đặc biệt sự bùng nổ của thị trường TPCN trong mấy năm gần đây đã gây nhiều khó khăn cho các cơ quan quản lý Vì vậy, việc xây dựng các phương pháp phát hiện chất cấm trong đông dược và TPCN là rất cần thiết 1.4 Phương pháp xử lý mẫu [2] Các thuốc đông dược thường là những thuốc có thành phần phức tạp, do đó để phân tích các thuốc tân dược lẫn trong các thuốc đông dược thì việc xử lý mẫu, tách chiết các... mỏng: Đo diện tích hay cường độ màu của vết sắc ký Hiện nay dùng 2 kỹ thuật: 17 - Densitometer: chiếu chùm tia vào vết sắc ký và đo cường độ hấp thụ hoặc huỳnh quang - Xử lý ảnh với camera kỹ thuật số: Quét bản mỏng với hệ thống phân tích hình ảnh, nhất là camera kỹ thuật số có độ phân giải cao để thu nhận hình ảnh của vết sắc ký Xử lý dữ liệu ảnh bằng máy tính 1.5.6 Ưu nhược điểm của phương pháp sắc. .. tan trong nước, hơi tan trong ethanol, khó tan trong methylen clorid, tan trong aceton  Định tính: [4], [20] - Đo phổ hấp thụ của dẫn chất hydrazon: cho phản ứng với phenylhydrazin trong môi trường acid cho dẫn chất phenihydrazon có màu vàng (hấp thụ cực đại ở 419nm) - Phổ hồng ngoại của chế phẩm phải phù hợp với phổ hồng ngoại của dexamethason chuẩn - Dùng phương pháp sắc ký lớp mỏng: Dùng bản mỏng. .. thực tế, tiến hành xử lý mẫu theo phương pháp sau: - Dạng rắn: sử dụng phương pháp chiết trực tiếp bằng dung môi aceton - Dạng lỏng:sử dụng phương pháp chiết lỏng lỏng bằng dung môi ethyl acetat • Sử dụng phương pháp SKLM để xây dựng điều kiện phát hiện chất phân tích trong mẫu tự tạo có gây nhiễm chất cần phân tích Mẫu tự tạo: Mẫu trắng có cho thêm dexamethason và dexamethason acetat chuẩn - Mẫu tự... phẩm chức năng bị trộn tân dược Hiện nay, tình hình thuốc đông dược, thực phẩm chức năng bị trộn trái phép tân dược đang xảy ra rất phổ biến và được cơ quan quản lý phát hiện nhiều ở các vùng miền, từ các thành phố lớn đến các vùng tỉnh thành khác trong toàn quốc Các chế phẩm bị trộn tân dược cũng rất đa dạng và phong phú, thủ đoạn của người sản xuất làm giả ngày một khéo léo và tinh vi (trộn Tân dược. .. chất lượng thuốc • Nhược điểm [1] - Trong một số trường hợp độ lặp lại của trị số Rf thấp do thành phần pha động thay đổi trong quá trình triển khai sắc ký - Tăng giãn rộng pic sắc ký do khuếch tán vì tốc độ dòng của pha động thấp 18 CHƯƠNG II: NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NÔI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 2.1.1 Máy móc, thiết bị  Bản mỏng silicagel GF254 của Merck (Đức) . TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ DUYÊN NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN DEXAMETHASON TRONG MỘT SỐ CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỚP MỎNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ. TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ DUYÊN NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN DEXAMETHASON TRONG MỘT SỐ CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỚP MỎNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng. bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng Với mục tiêu cụ thể sau đây: 1. Xây dựng được phương pháp phát hiện dexamethason, dexamethason acetat trong chế phẩm đông dược, thực phẩm chức năng bằng sắc ký