Xác định đồng thời ba bufadieolid trong một số mẫu phẩm từ cóc bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép nối khối phổ hai lần (lc ms

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH LÊ THỊ THU HÀ XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI BA BUFADIEOLID TRONG MỘT SỐ MẪU PHẨM TỪ CÓC BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP NỐI KHỐI PHỔ HAI LẦN (LC –MS/MS) LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC NGHỆ AN - 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH LÊ THỊ THU HÀ XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI BA BUFADIEOLID TRONG MỘT SỐ MẪU PHẨM TỪ CÓC BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP NỐI KHỐI PHỔ HAI LẦN (LC –MS/MS) LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 60.44.01.18 Người hướng dẫn khoa học: TS NGUYỄN TRUNG DŨNG NGHỆ AN - 2014 LỜI CẢM ƠN Bản luận văn thực Viện kiểm nghiệm An toàn Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia, 48B Tăng Bạt Hổ, Hai Bà Trưng, Hà Nội hoàn thành trường Đại học Vinh với hướng dẫn TS Nguyễn Trung Dũng Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: TS Nguyễn Trung Dũng, Bộ mơn Kỹ thuật Mơi trường, Khoa Hóa Lý kỹ thuật, Học viện Kỹ thuật Quân giao đề tài hết lòng hướng dẫn, bảo tận tình, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm quý báu cho tơi suốt q trình thực luận văn PGS.TS Nguyễn Hoa Du PGS.TS Trần Đình Thắng dành nhiều thời gian đọc viết nhận xét cho luận văn Ban lãnh đạo Viện kiểm nghiệm An toàn vệ sinh Thực phẩm Quốc Gia tạo điều kiện thuận lợi cho tơi học tập hồn thành đề tài Ths Trần Cao Sơn, CN Đỗ Thị Thu Hằng toàn thể anh chị labo Hóa nhiệt tình bảo, hướng dẫn, động viên tơi suốt q trình làm thực nghiệm Các thầy, giảng dạy khoa Hóa học, đặc biệt thầy mơn Hóa Phân tích, cho kiến thức quý giá, tạo điều kiện cho học tập nghiên cứu môi trường khoa học, đại Và cuối cùng, xin chân thành cảm ơn gia đình bạn bè quan tâm động viên tơi q trình học tập thực luận văn Vinh, tháng 10 năm 2014 Học viên Lê Thị Thu Hà MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu bufadienolid 1.1.1 Giới thiệu chung họ cóc độc tố cóc 1.1.2 Cấu tạo tính chất bufalin, cinobufagin, resibufogenin 1.1.3 Tác dụng độc tính bufadienolid 1.1.4 Ngộ độc ăn cóc sản phẩm chế biến từ cóc 1.1.5 Các sản phẩm có nguồn gốc từ cóc 1.1.6 Nghiên cứu bufadienolid nước 10 1.2 Các phương pháp xác định bufadienolid 11 1.3 Phương pháp LC - MS/MS 24 1.3.1 Nguyên lý hoạt động 24 1.3.2 Sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 25 1.3.3 Khối phổ (Mass Spectrometry - MS) 26 1.4 Phương pháp chiết pha rắn 33 1.5 Đánh giá phương pháp phân tích 35 CHƢƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 2.1 Đối tượng, mục tiêu, nội dung phương pháp nghiên cứu 39 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 39 2.1.2 Mục tiêu nghiên cứu 39 2.1.3 Nội dung nghiên cứu thực nghiệm 39 2.1.4 Phương pháp nghiên cứu 40 2.2 Thiết bị, dụng cụ hóa chất 43 2.2.1 Thiết bị, dụng cụ 43 2.2.2 Hóa chất 45 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 47 3.1 Thiết lập điều kiện phân tích bufadienolid LC-MS/MS 47 3.1.1 Tối ưu điều kiện detector khối phổ (MS) 47 3.1.2 Tối ưu hóa điều kiện chạy sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 51 3.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu 59 3.2.1 Chọn quy trình xử lý mẫu 59 3.2.2 Khảo sát dung môi chiết 61 3.2.3 Khảo sát thể tích dung mơi chiết 64 3.2.4 Khảo sát cột chiết pha rắn 67 3.2.5 Khảo sát dung môi rửa giải 68 3.2.6 Khảo sát thể tích dung môi rửa giải 70 3.3 Thẩm định phương pháp 74 3.3.1 Tính đặc hiệu/ chọn lọc 74 3.3.2 Xác định khoảng tuyến tính đường chuẩn 76 3.3.3 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) 79 3.3.4 Độ lặp lại độ thu hồi 80 3.4 Phân tích mẫu thực tế 84 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 86 Kết luận 86 Kiến nghị 87 TÀI LIỆU THAM KHẢO 88 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1.1: Một số lồi cóc có độc giới Hình 1.2: Một số sản phẩm có nguồn gốc từ cóc 10 Hình 1.3: Mơ hình hệ thống LC - MS/MS 25 Hình 1.4: Kỹ thuật APCI với chế độ bắn phá ion dương 27 Hình 1.5: Chế độ ion hóa phun điện tử ESI 28 Hình 1.6: Cấu tạo phân tích khối tứ cực chập ba 31 Hình 1.7: Các bước trình chiết pha rắn 33 Hình 2.1: Hệ thống máy LC - MS/MS .44 Hình 3.1: Cơ chế phân mảnh bufalin 49 Hình 3.2: Sắc đồ tổng ion mẫu chất chuẩn ba bufadienolid 500 ng/ ml hai ion bufalin 51 Hình 3.3: Sắc đồ ba bufadienolid dùng dung môi pha động acid HCOOH 0,1% 54 Hình 3.4: Sắc đồ bufadienolid chế độ gradient 56 Hình 3.5: Sắc đồ rửa giải bufadienolid với tốc độ dòng ml/ phút 58 Hình 3.6: Quy trình xử lý mẫu dự kiến 61 Hình 3.7: Ảnh hưởng dung mơi chiết đến hiệu suất thu hồi bufadienolid mẫu bột cóc 63 Hình 3.8: Ảnh hưởng dung môi chiết đến hiệu suất thu hồi bufadienolid mẫu xương cóc 64 Hình 3.9: Ảnh hưởng thể tích dung mơi chiết đến hiệu suất chiết bufadienolid mẫu bột cóc 65 Hình 3.10: Ảnh hưởng thể tích dung môi chiết đến hiệu suất chiết bufadienolid mẫu xương cóc 66 Hình 3.11: Ảnh hưởng dung mơi rửa giải đến hiệu suất thu hồi bufadienolid mẫu bột cóc 69 Hình 3.12: Ảnh hưởng dung môi rửa giải đến hiệu suất thu hồi bufadienolid mẫu xương cóc 70 Hình 3.13: Ảnh hưởng thể tích dung mơi rửa giải đến suất thu hồi bufadienolid mẫu bột cóc 71 Hình 3.14: Ảnh hưởng thể tích dung mơi rửa giải đến suất thu hồi bufadienolid mẫu xương cóc 72 Hình3.15: Quy trình xử lý mẫu tối ưu 73 Hình 3.16: Sắc đồ mẫu trắng bột cóc 75 Hình 3.17: Sắc đồ mẫu trắng bột có thêm chuẩn 75 Hình 3.18: Sắc đồ mẫu chuẩn hỗn hợp ba bufadienolid 500 ng /ml 75 Hình 3.19: Đường chuẩn bufalin mẫu bột cóc .76 Hình 3.20: Đường chuẩn cinobufagin mẫu bột cóc .77 Hình 3.21: Đường chuẩn resibufogenin mẫu bột cóc 77 Hình 3.22: Đường chuẩn bufalin mẫu xương cóc .78 Hình 3.23: Đường chuẩn cinobufagin mẫu xương cóc .78 Hình 3.24: Đường chuẩn resibufogenin mẫu xương cóc 78 Hình 3.25: Sắc đồ bufalin giới hạn phát LOD 1,25 µg/kg 75 Hình 3.26: Sắc đồ resibufogenin giới hạn phát LOD 2,5 µg/kg 80 Hình 3.27: Sắc đồ cinobufagin giới hạn định lượng LOQ 5,0 µg/kg 80 Hình 3.28: Sắc đồ resibufogenin giới hạn định lượng LOD 10,0 µg/kg 80 Hình 3.29: Sắc đồ mẫu bột cóc thêm chuẩn bufadienolid mức nồng độ 500 µg/kg .82 Hình 3.30: Sắc đồ mẫu xương cóc thêm chuẩn bufadienolid mức nồng độ 500 µg/kg 83 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Cấu tạo tính chất bufalin, cinobufagin, resibufogenin Bảng 1.2: Thống kê vụ ngộ độc ăn cóc sản phẩm chế biến từ cóc Bảng 1.3: Các phương pháp xác định nhóm độc tố bufadienolid 12 Bảng 1.4: Đánh giá độ lặp lại phương pháp theo hội đồng Châu Âu 2002/657/EC 37 Bảng 1.5: Đánh giá độ phương pháp theo hội đồng Châu Âu 2002/657/EC 38 Bảng 2.1: Thông tin mẫu nghiên cứu 41 Bảng 3.1: Các thơng số tối ưu hóa điều kiện phân mảnh 48 Bảng 3.2: Các thông số tối ưu MS/MS 51 Bảng 3.3: Chương trình chạy gradient .53 Bảng 3.4: Ảnh hưởng dung môi pha động đến thời gian lưu diện tích pic 53 Bảng 3.5: Khảo sát chương trình chạy gradient .55 Bảng 3.6: Kết khảo sát gradient .56 Bảng 3.7: Khảo sát tốc độ dòng pha động 57 Bảng 3.8: Chương trình gradient tối ưu 58 Bảng 3.9: Khảo sát quy trình xử lý mẫu 60 Bảng 3.10: Khảo sát dung môi chiết với mẫu bột cóc .62 Bảng 3.11: Khảo sát dung mơi chiết với mẫu xương cóc 63 Bảng 3.12: Khảo sát thể tích dung mơi chiết với mẫu bột cóc 65 Bảng 3.13: Khảo sát thể tích dung mơi chiết với mẫu xương cóc .66 Bảng 3.14: Khảo sát cột chiết pha rắn 67 Bảng 3.15: Khảo sát dung môi rửa giải với mẫu bột cóc 68 Bảng 3.16: Khảo sát dung môi rửa giải với mẫu xương cóc 69 Bảng 3.17: Khảo sát thể tích dung mơi rửa giải với mẫu bột cóc .71 Bảng 3.18: Khảo sát thể tích dung mơi rửa giải với mẫu xương cóc 72 Bảng 3.19: Ion mẹ ion bufadienolid .74 Bảng 3.20: Phương trình đường chuẩn bufadienolid mẫu bột cóc 76 Bảng 3.21: Phương trình đường chuẩn bufadienolid mẫu xương cóc 77 Bảng 3.22: Giới hạn phát giới hạn định lượng bufadienolid .79 Bảng 3.23: Độ lặp lại hiệu suất thu hồi bufadienolid mẫu bột cóc .81 Bảng 3.24: Độ lặp lại hiệu suất thu hồi bufadienolid mẫu xương cóc 82 Bảng 3.25: Kết phân tích bufadienolid mẫu phẩm làm từ cóc .84 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC TỪ VIẾT TẮT Kí hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt ACN Acetonitrile Acetonitril Association of Official Analytical Hiệp hội cộng đồng phân Community tích thức Atmospheric pressure chemical Chế độ ion hóa áp suất ionization khí EI Electron Impact Va chạm electron ESI Electrospray ionization Ion hóa phun điện tử AOAC APCI GC-MS HPLC Gas chromatography mass spectrometry High performance liquid chromatography Sắc ký khí khối phổ Sắc ký lỏng hiệu cao Normal phase high performance Sắc ký lỏng hiệu cao liquid chromatography pha thuận Reversed phase high performance Sắc ký lỏng hiệu cao liquid chromatography pha đảo High speed countercurrent Sắc kí ngược dịng tốc độ chromatography cao Liquid chromatography tandem Sắc ký lỏng ghép khối phổ mass spectrometry hai lần LD50 Lethal Dose Liều gây chết trung bình LOD Limit of detection Giới hạn phát LOQ Limit of quantification Giới hạn định lượng NP-HPLC RP-HPLC HSCCC LC-MS/MS 96 Phụ lục 2: Sắc đồ khảo sát chƣơng trình gradient Hình P2.1: Chương trình gradient Hình P2.2: Chương trình gradient Hình P2.3: Chương trình gradient 97 Hình P2.4: Chương trình gradient Hình P2.5: Chương trình gradient 98 Phụ lục 3: Sắc đồ khảo sát tốc độ dịng Hình P3.1: Tốc độ dịng :0,8ml/ phút Hình P3.2: Tốc độ dịng :1,0ml/ phút Hình P3.3: Tốc độ dịng :1,2ml/ phút 99 Phụ lục 4: Sắc đồ khảo sát dung môi chiết Hình P4.1: Dung mơi: methanol - mẫu bột cóc xương cóc Hình P4.2: Dung mơi: acetonitril - mẫu bột cóc xương cóc 100 Hình P4.3: Dung mơi: ethyl acetat - mẫu bột cóc xương cóc Hình P4.4: Dung mơi: chloroform - mẫu bột cóc xương cóc 101 Phụ lục 5: Sắc đồ khảo sát thể tích dung mơi chiết Hình P5.1: Chiết lần - 5ml MeOH mẫu bột cóc xương cóc Hình P5.2: Chiết lần - 5ml MeOH mẫu bột cóc xương cóc 102 Hình P5.3: Chiết lần - 10ml MeOH mẫu bột cóc xương cóc Hình P5.4: Chiết lần - 10ml MeOH mẫu bột cóc xương cóc 103 Phụ lục 6: Sắc đồ khảo sát dung môi rửa giải Hình P6.1: 0,1% CH3COOH methanol mẫu bột cóc xương cóc Hình P6.2: 0,5% CH3COOH methanol mẫu bột cóc xương cóc 104 Hình P6.3: 1% CH3COOH methanol mẫu bột cóc xương cóc 105 Phụ lục 7:Sắc đồ khảo sát thể tích dung mơi rửa giải Hình P7.1: ml dung dịch acid acetic 0,1% methanol mẫu bột cóc xương cóc Hình P7.2: ml dung dịch acid acetic 0,1% methanol mẫu bột cóc xương cóc 106 Hình P7.3: ml dung dịch acid acetic 0,1% methanol mẫu bột cóc xương cóc 107 Phụ lục 8: Sắc đồ số điểm chuẩn Hình P8.1: Điểm chuẩn 50ppb bột cóc xương cóc Hình P8.2: Điểm chuẩn 100ppb bột cóc xương cóc 108 Hình P8.3: Điểm chuẩn 200ppb bột cóc xương cóc Hình P8.4: Điểm chuẩn 500ppb bột cóc xương cóc 109 Phụ lục 9: Sắc đồ số mẫu thực tế Hình P9.1: Bột cóc royal Baby Hình P9.2: Xương cóc Hình P9.3: Thuốc đen Hình P9.4: Thiềm châu 110 Hình P9.5: Gan cóc Hình P9.6: Trứng cóc pha lỗng 10 lần Hình P9.7: Da cóc pha lỗng 40 lần Hình P9.8: Nhựa cóc 0,1779g pha lỗng 50 lần ... HÀ XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI BA BUFADIEOLID TRONG MỘT SỐ MẪU PHẨM TỪ CÓC BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP NỐI KHỐI PHỔ HAI LẦN (LC ? ?MS/ MS) LUẬN VĂN THẠC SĨ HĨA HỌC Chun ngành: Hóa phân tích Mã số: ... ký mỏng, sắc ký phân bố ngược dòng tốc độ cao, sắc ký khí ghép khối phổ sắc ký lỏng hiệu cao (ghép nối với detector UV, PDA, MS, MS/ MS) Phương pháp sắc ký lỏng ghép nối khối phổ hai lần có nhiều... nguy tiềm ẩn ngộ độc độc tố cóc chúng tơi chọn đề tài: ? ?Xác định đồng thời ba bufadienolid số mẫu phẩm từ cóc phương pháp sắc ký lỏng ghép nối khối phổ hai lần (LC - MS/ MS)” 3 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN