Nghiên cứu xác định thuốc trừ sâu nhóm clo hữu cơ trong huyết tương bằng phương pháp sắc ký khí ghép nối khối phổ

TỔ NG QUAN

Hóa ch ấ t b ả o v ệ th ự c v ậ t và th ự c tr ạ ng s ử d ụ ng hóa ch ấ t b ả o v ệ th ự c v ậ t

Hóa chất bảo vệ thực vật, hay còn gọi là pesticide, là thuật ngữ chỉ các chất được sử dụng để kiểm soát và tiêu diệt sâu bệnh gây hại cho cây trồng Các hóa chất này không chỉ bao gồm thuốc trừ côn trùng mà còn cả các loại thuốc diệt cỏ, nấm mốc và các loài gặm nhấm, nhằm bảo vệ mùa màng khỏi những tác nhân gây hại.

Hóa chất bảo vệ thực vật (HCBVTV) được Tổ chức Nông nghiệp và Lương thực của Liên Hiệp Quốc (FAO) định nghĩa là các hợp chất hoặc hỗn hợp nhằm ngăn ngừa, tiêu diệt hoặc kiểm soát các tác nhân gây hại, bao gồm cả vật chủ trung gian truyền bệnh cho con người và động vật HCBVTV có vai trò quan trọng trong việc bảo vệ thực vật và động vật khỏi các bộ phận không mong muốn, đồng thời ảnh hưởng đến quy trình sản xuất, chế biến, bảo quản và vận chuyển thực phẩm, nông sản, gỗ và sản phẩm từ gỗ Ngoài ra, HCBVTV còn được sử dụng để điều hòa sinh trưởng thực vật, làm rụng lá, làm khô cây, thưa quả và ngăn chặn rụng quả sớm Việc sử dụng HCBVTV cho cây trồng trước và sau thu hoạch giúp bảo vệ sản phẩm khỏi hư hỏng trong quá trình bảo quản và vận chuyển.

Các loại thuốc trừ sâu nguy hiểm nhất đối với con người bao gồm thuốc trừ sâu và thuốc diệt chuột Thuốc trừ sâu tổng hợp được nông dân ưa chuộng nhờ tính sẵn có, dễ sử dụng và hiệu quả kinh tế cao Tuy nhiên, việc sử dụng chúng gây ra chi phí môi trường rất lớn.

1.1.1 Thuốc trừ sâu nhóm Clo hữu cơ

Thuốc trừ sâu nhóm Clo hữu cơ là các hợp chất được hình thành từ các phân tử hydrocarbon, trong đó các nguyên tử hydro được thay thế bằng nguyên tử Clo Những hợp chất này có thể chứa vòng benzene hoặc các cấu trúc dị vòng, bao gồm vòng bốn cạnh, vòng năm cạnh, và có thể có các nguyên tố như O, N, hoặc S.

Dưới đây là công thức cấu tạo của một số thuốc trừ sâu nhóm Clo hữu cơ:

Bảng 1.1: Công thức cấu tạo của một số thuốc trừ sâu nhóm Clo hữu cơ

STT Tên chất Công thức cấu tạo KLPT (g/mol) và CTPT

Thuốc trừ sâu nhóm Clo hữu cơ là một trong những loại thuốc được ưa chuộng trong nông nghiệp nhờ hiệu quả kinh tế cao và tác dụng nhanh chóng, tuy nhiên, chúng để lại tồn dư lớn và có chu kỳ phân hủy dài Cơ chế độc hại của chúng phụ thuộc vào cấu trúc hóa học, và mặc dù nhiều loại đã bị cấm, nhưng sự tồn tại của chúng trong môi trường vẫn đáng lo ngại, ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người Theo công ước Stockholm (2001), một số chất ô nhiễm hữu cơ khó phân hủy như Aldrin, Chlordane, Dieldrin, Endrin, và DDT đã được liệt kê và yêu cầu loại trừ Tại Việt Nam, lệnh cấm sử dụng thuốc trừ sâu gốc Clo hữu cơ đã được ban hành từ năm 1995.

1.1.2 Thực trạng sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật

Việt Nam là một quốc gia nông nghiệp phát triển, nơi mà nông nghiệp đóng góp tích cực vào sự phát triển kinh tế - xã hội Hóa chất bảo vệ thực vật (BVTV) đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ cây trồng và phòng trừ dịch hại, đặc biệt trong giai đoạn từ thập kỷ 60 đến 90, khi chúng được sử dụng để chống lại sốt rét và hỗ trợ quân đội.

Mỗi năm, Mỹ tiêu thụ khoảng 1/3 tổng lượng hóa chất bảo vệ thực vật (BVTV) toàn cầu, chủ yếu là hóa chất diệt cỏ Châu Âu cũng sử dụng 30% lượng hóa chất BVTV, trong khi các khu vực khác chỉ khoảng 20% Tại Việt Nam, theo thống kê năm 1957, miền Bắc sử dụng khoảng 100 tấn hóa chất BVTV Trước năm 1985, khối lượng sử dụng hàng năm dao động từ 6.500 đến 9.000 tấn, nhưng trong ba năm gần đây, Việt Nam đã nhập và sử dụng từ 70.000 đến 100.000 tấn, tăng hơn 10 lần.

Theo Cục Bảo vệ Thực vật, việc kiểm soát sản xuất và sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật tại Việt Nam hiện nay gặp nhiều khó khăn Sản xuất nhỏ lẻ không tuân thủ quy chuẩn phun và thu hoạch nông sản dẫn đến tình trạng dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật cao, đặc biệt là trên rau, quả và chè Kết quả kiểm tra từ năm 2000 đến 2002 cho thấy tại Hà Nội, tỷ lệ mẫu nông sản có dư lượng vượt mức cho phép dao động từ 10% đến 26%, trong khi tại TP.HCM cũng ghi nhận tỷ lệ tương tự.

Nghiên cứu về việc sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật (BVTV) tại Thái Nguyên, đồng bằng sông Hồng và Thành Phố Hồ Chí Minh cho thấy tần suất phun thuốc rất cao, có nơi lên đến 26-32 lần mỗi năm Nồng độ hóa chất cũng vượt mức cho phép và việc thu hoạch không tuân thủ quy định, dẫn đến tình trạng tồn dư hóa chất BVTV trong sản phẩm nông nghiệp ở mức đáng lo ngại.

Theo Cục BVTV (Bộ NN-PTNT), Việt Nam hiện có khoảng 1.700 hoạt chất thuốc bảo vệ thực vật với hơn 4.000 sản phẩm thương mại khác nhau Mỗi năm, nước ta chi khoảng 500 triệu USD để nhập khẩu thuốc trừ sâu, trừ cỏ và nguyên liệu sản xuất thuốc BVTV từ Trung Quốc, trong đó gần 50% là thuốc trừ cỏ (khoảng 19.000 tấn) và 32% là thuốc trừ sâu và bệnh (khoảng 16.400 tấn) Sự sử dụng tràn lan thuốc BVTV, đặc biệt là những loại không rõ nguồn gốc, đang ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe cộng đồng.

Hình 1.1: Hàm lượng sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật năm 1996 ( Chemical Week

Theo các chuyên gia y tế, tất cả các loại hóa chất bảo vệ thực vật (BVTV) đều có tác động đến sức khỏe con người, đặc biệt là khi sử dụng không đúng liều lượng và quy trình Mức độ nhiễm độc hóa chất BVTV phụ thuộc vào loại hóa chất và liều lượng sử dụng Các chất lân hữu cơ thường gây nhiễm độc cấp tính qua đường hô hấp, tiêu hóa và da, trong khi chất clo hữu cơ có khả năng tồn lưu lâu trong cơ thể, dẫn đến nguy cơ nhiễm độc mạn tính.

1.1.3 Một số nghiên cứu xác định thuốc trừ sâu gốc Clo hữu cơ trong mẫu sinh học

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu xác định hóa chất bảo vệ thực vật gốc

Clo hữu cơ trong huyết tương được chiết xuất bằng dung môi hoặc hỗn hợp dung môi như n-hexan và n-hexane-acetone, sau đó làm sạch bằng các cột chuyên dụng như SPE, Florisil, C18 và phân tích bằng hệ thống sắc ký khí kết hợp detector bắt giữ điện tử (GC-ECD) Nghiên cứu của Isabelle Romieu và các cộng sự năm 2000 đã chỉ ra mối liên hệ giữa tuổi tác và hàm lượng DDT, DDE trong huyết tương người Tương tự, nghiên cứu của Luz E Ruiz-Suárez và các cộng sự cũng xác nhận phương pháp chiết xuất thuốc trừ sâu gốc clo hữu cơ bằng hỗn hợp ethyl alcohol, ammonium sulfate và n-hexane, sau đó làm sạch bằng ống Baker Florisil column và phân tích trên hệ thống GC-ECD, cho thấy mối liên quan giữa dư lượng thuốc trừ sâu gốc clo trong huyết tương và khu vực sinh sống.

Năm 1986, một nghiên cứu tại Bệnh viện quốc gia Kenyatta ở Nairobi đã phân tích 41 mẫu máu mẹ, sữa, mỡ dưới da và máu dây rốn từ các bà mẹ sinh mổ Kết quả cho thấy các thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) chủ yếu được phát hiện trong tất cả các mẫu bao gồm pp'-DDT (100%), pp' DDE (100%), op' DDT (59%), dieldrin (27%), transnonachlor (15%), β-HCH (12%) và lindane (2%) Mức trung bình của t-DDT trong mỡ dưới da là 5,9 mg/kg, trong sữa mẹ là 4,86 mg/kg, trong huyết thanh mẹ là 2,75 mg/kg và trong huyết thanh rốn là 1,9 mg/kg Đối với β-HCH, mức trung bình trong mỡ dưới da và sữa lần lượt là 0,034 mg/kg và 0,26 mg/kg.

Một nghiên cứu tại Veracruz, Mexico, đã phân tích dư lượng thuốc trừ sâu hữu cơ trong mô mỡ và huyết thanh của 64 bà mẹ tình nguyện Kết quả cho thấy nồng độ t-HCH trong mô mỡ và huyết thanh lần lượt là 0,17 và 0,22 mg/kg, trong khi t-DDT đạt 5,851 mg/kg trong mô mỡ và 5,2626 mg/kg trong huyết thanh Ngoài ra, hexachloro benzen có nồng độ 0,065 mg/kg trong mô mỡ và 0,18 mg/kg trong huyết thanh Đáng lưu ý, tại Việt Nam hiện chưa có nghiên cứu nào xác định dư lượng thuốc trừ sâu gốc Clo hữu cơ trong huyết tương, nước tiểu hay sữa mẹ.

Phương pháp QuEChERS

QuEChERS là một phương pháp chiết xuất đa dư lượng thuốc trừ sâu, được áp dụng cho nhiều loại mẫu khác nhau Tên gọi QuEChERS là viết tắt của các từ tiếng Anh: quick (nhanh), easy (đơn giản), cheap (rẻ), effective (hiệu quả), rugged (ổn định) và safe (an toàn).

Phương pháp QuEChERS sử dụng acetonitril đã được ổn định pH để chiết xuất mẫu, kết hợp với muối magnesi sulfat (MgSO4) nhằm tách nước Quá trình làm sạch bằng chiết phân tán pha rắn (d-SPE) giúp loại bỏ acid hữu cơ, nước dư và các thành phần không mong muốn thông qua chất hấp phụ amin bậc 1 và bậc 2 (PSA) cùng MgSO4 Cuối cùng, dịch chiết được tách ra và phân tích bằng sắc ký khối phổ.

Hiện nay phương pháp QuEChERS thường được lựa chọn để phân tích hóa chất bảo vệ thực vật trong nhiều nền mẫu khác nhau [10]

Năm 2005, Lehotayetat đã áp dụng phương pháp QuEChERS để phân tích dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trong sữa và trứng có chứa tới 20% chất béo

Năm 2007, Florian và cộng sự đã phát triển phương pháp phân tích dư lượng dược phẩm sử dụng axetonitril làm chất chiết và MgSO4 để loại bỏ nước, với phân tích dịch chiết trên GC-MS, đạt hiệu suất xác định hơn 40 loại thuốc và chất độc trong máu lên đến 80% Năm 2008, Aguilera-luiz thành công trong việc thử nghiệm 18 loại thuốc thú y trong sữa, với hiệu suất thu hồi từ 70-100%, sử dụng 1% axit axetic trong axetonitril và 0,1M đệm EDTA, sau đó lọc bằng đầu lọc 0,2µm và phân tích trên LC/MS/MS Các phương pháp cải tiến của QuEChERS đã được áp dụng để phân tích dư lượng thuốc kháng sinh, hóa chất bảo vệ thực vật và phụ gia thực phẩm trên nhiều loại mẫu như trứng, sữa, phô mai, đồ ăn trẻ em, thịt gà và tôm.

Một nghiên cứu tại Ontario, Canada đã phân tích mô mỡ và mẫu máu từ các nạn nhân tai nạn ở Norfolk, cùng với 52 mẫu máu từ những người sử dụng DDT trong nông nghiệp và 315 mẫu máu của người dân Hà Lan Kết quả cho thấy giá trị trung bình dư lượng DDT trong mô mỡ và máu lần lượt là 5,83 và 0,032 ppm, với sự tương quan có ý nghĩa thống kê giữa hai loại mẫu này Cụ thể, giá trị trung bình DDT trong máu của nạn nhân ở Norfolk là 0,032 ppm, ở người dân Hà Lan là 0,016 ppm, và ở 26 người bị phơi nhiễm DDT trong nông nghiệp là 0,063 ppm.

Các tác giả đều áp dụng phương pháp QuEChERS, nhưng có những điều chỉnh nhất định về dung môi chiết và các thuốc thử để phù hợp với loại mẫu và điều kiện cụ thể trong phòng thí nghiệm.

Phương pháp sắ c ký khí – kh ố i ph ổ (GC-MS)

Sắc ký là kỹ thuật tách và xác định đồng thời các chất trong hỗn hợp dựa trên tính chất hóa học và vật lý của chúng Có hai loại cột sắc ký: cột nhồi và cột mao quản Cột nhồi thường ngắn, tối đa 6m, thích hợp cho việc tách các hỗn hợp mẫu đơn giản với cấu tử có tính chất khác biệt rõ rệt và thành phần không phức tạp.

Sắc ký cột mao quản với chiều dài cột tách từ 20-60m rất hiệu quả trong việc phân tách nhiều loại hỗn hợp mẫu, từ đơn giản đến phức tạp, có thể tách gần 100 chất khác nhau.

Detector là thiết bị quan trọng trong việc ghi nhận và xử lý tín hiệu của chất phân tích, chuyển đổi chúng thành tín hiệu điện Trong phân tích HCBVTV bằng phương pháp GC, có một số loại detector phổ biến như detector đo độ dẫn điện (TCD), detector ion hóa ngọn lửa (FID), detector bắt điện tử (ECD) và detector khối phổ (MMD).

Hệ thống sắc khí ghép khối phổ (GC-MS) kết hợp hai kỹ thuật sắc ký khí (GC) và khối phổ (MS), với áp suất tại đầu ra của GC cao gần bằng áp suất khí quyển và áp suất trong buồng MS rất thấp (10-5 đến 10-6 Torr) để duy trì tính chân không Nếu áp suất tại MS vượt quá 10-3, hệ thống sẽ bị đánh giá là hở, gây nguy hiểm cho filament, do đó, tất cả các hệ thống MS đều được kết nối với bơm chân không để đảm bảo an toàn Các hợp chất thích hợp cho phương pháp GC bao gồm những chất có khối lượng phân tử thấp và độ phân cực trung bình hoặc thấp, với nồng độ từ ppb đến ppm, cũng phù hợp với yêu cầu của MS Phương pháp GC-MS mang lại hiệu quả đáng kể trong việc phân tích và nhận diện nhiều hợp chất phức tạp, định lượng chính xác, và cung cấp thông tin về định danh và định lượng mẫu, đồng thời cho phép so sánh và nhận diện các chất với thư viện phổ phong phú.

ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U 12 2.1 Đối tượ ng nghiên c ứ u

Đối tượ ng phân tích

Mẫu huyết tương được lấy từ bệnh nhân ung thư vú chưa điều trị hóa chất và từ người bình thường sống tại Hà Nội Sau khi thu thập, huyết tương sẽ được tách ra và bảo quản ở nhiệt độ -80°C để đảm bảo chất lượng mẫu.

Phương tiệ n nghiên c ứ u

Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu thuộc loại tinh khiết phân tích bao gồm

- Acetonitril dùng cho LC-MS của Merck, Đức

- Magnesi sulfat khan (MgSO 4 ) của Merck, Đức

- Natri clorua khan (NaCl) của Merck, Đức

- Chất hấp phụ PSA (primary secondary amines) của Agilent, Mỹ

- n-hexan dung cho GC-MS của Merck, Đức

The pesticide standard reference is a mixture of 18 compounds, including Aldrin, α-BHC, β-BHC, δ-BHC, γ-BHC, Heptachlor, Heptachlor epoxide, Dieldrin, Endosulfan I, Endosulfan II, Endosulfan sulfate, Endrin, Endrin aldehyde, Endrin ketone, p,p’ DDD, p,p’ DDT, p,p’ DDE, and Methoxychlor, with each component present at a concentration of 2000 ppm The reference code is N9331029, batch number LK150619006, and it is produced by PerkinElmer, USA.

Bảng 2.1 Các chất chuẩn đơn của Lgcstandards

STT Tên hóa học CAS-No

Chuẩn bị dung dịch chuẩn:

Dung dịch chuẩn trung gian Mix 18 OCPs 20ppm được tạo ra bằng cách sử dụng micropipette để lấy chính xác 10 àL dung dịch chuẩn gốc 2000ppm, sau đó cho vào vial 1000 àL và thêm 990 àL n-Hexan, lắc đều Dung dịch này cần được bảo quản ở nhiệt độ dưới -20 oC và có thể sử dụng trong vòng 6 tháng.

Dung dịch chuẩn trung gian Mix 18 OCPs 1ppm được tạo ra bằng cách sử dụng micropipette để lấy 50 àL dung dịch chuẩn trung gian 20ppm, sau đó cho vào vial 1000 àL và thêm 950 àL n-Hexan Sau khi lắc đều, dung dịch nên được bảo quản ở nhiệt độ thấp hơn 0 độ C.

20 o C, có thể giữ trong 1 tháng

Dung dịch chuẩn trung gian Mix 18 OCPs 200ppb được chuẩn bị bằng cách sử dụng micropipette để lấy chính xác 10 µL dung dịch chuẩn trung gian 20ppm, sau đó cho vào vial 1000 µL và thêm 980 µL n-Hexan Sau khi lắc đều, dung dịch cần được bảo quản ở nhiệt độ thấp hơn 0 độ C.

20 o C, có thể giữ trong 1 tháng

- Dung dịch chuẩn làm việc: Sử dụng dung dịch chuẩn trung gian Mix 18 OCPs 1ppm và Mix 18 OCPs 200ppb pha dãy các dung dịch chuẩn theo bảng 2.2:

Blank 2 (ppb) 5 (ppb) 10 (ppb) 20 (ppb) 50 (ppb)

- Hệ thống sắc ký khí GC-MS Claurus 680, nhà cung cấp Perkin Elmer Cột Elite -5 MS 30m*0.32mm*0.25àm Bộbơm mẫu tựđộng autosampler 82 vị trớ

- Bình khí nito 5.0 và van điều chỉnh áp suất

- Bình khí Heli 99,999% và van điều chỉnh áp suất

- Cân phân tích có độchính xác đạt 0.001 gram

- Ống ly tâm thủy tinh 15 mL

- Màng lọc Milex đường kớnh 13 mm, kớch thước lỗ lọc 0.45 àm

- Những dụng cụ khác cần thiết.

Phương pháp nghiên cứ u

2.3.1 Phương pháp xử lý mẫu

Trong nghiên cứu sử dụng hai phương pháp nghiên cứu là phương phápchiết pha rắn và phương pháp QuEChERS cụ thể như sau:

Phương pháp chiết pha rắn sử dụng dung môi n-Hexan và hỗn hợp n-Hexan: aceton (9:1) để chiết mẫu, sau đó làm sạch mẫu bằng cột chiết pha rắn Florisil Các dung môi n-Hexan và hệ dung môi kết hợp n-Hexan với Dichloromethane được sử dụng với các tỷ lệ khác nhau để tối ưu hóa quá trình chiết xuất.

Phương pháp QuEChERS là một kỹ thuật hiệu quả để phân tích dư lượng thuốc trừ sâu gốc Clo trong mẫu huyết tương Quá trình bắt đầu bằng việc trích ly mẫu bằng acetonitril, sau đó dịch chiết được làm sạch bằng chất hấp phụ PSA Dịch sau khi làm sạch được bay hơi dưới dòng khí nitơ và hòa tan lại trong n-Hexan Cuối cùng, dư lượng thuốc trừ sâu gốc Clo được định lượng bằng hệ thống sắc ký khí GCMS.

Các bước xử lý mẫucủa phương pháp QuEChERS:

- Hút 0.5mL huyết tương vào ống ly tâm thủy tinh 15mL

- Thêm 2mL dung môi chiết (Acetonitril), lắc đều bằng tay và lắc xoáy trong vòng 1 phút

- Thêm 700 mg MgSO4, 100 mg NaCl (được khảo sát để tối ưu), lắc đều bằng tay và lắc xoáy trong vòng 1 phút

- Ly tâm ở 4000 vòng/phút trong 5 phút

Lấy dịch ly tâm từ lớp trên và cho vào ống ly tâm 2mL đã chứa sẵn 180 mg PSA và 110 mg MgSO4, được khảo sát để tối ưu hóa quy trình Sau đó, lắc xoáy hỗn hợp trong 1 phút để đảm bảo sự hòa trộn đồng nhất.

- Ly tâm ở 4000 vòng/phút trong 5 phút

- Hút chính xác 1,0 mL dịch chiết, đem thổi khô bằng khí nitơ sau đó hòa tan lại bằng 0.25mL n-Hexan và phân tích bằng GC-MS

2.3.2 Phương pháp phân tích bằng sắc ký khí ghép nối khối phổ

Trong nghiên cứu sử dụng hệ thống sắc ký khí khối phổ GC-MS của Perkin

Elmer bao gồm các bộ phận sau:

- Máy sắc kí khí GC Clarus 680

- Detector khối phổ MS Clarus

- Case máy tính thu nhận dữ liệu hãng

- Hệ thống phần mềm điều khiển thiết bị và thu nhận dữ liệu Turbo Mass

- Bơm Rotary hỗ trợ tạo chân không

- Bộlưu điện UPS SANTAK 10.0 kVA

- Đối với kỹ thuật sắc ký: Phân tích mẫu trắng, mẫu thêm chuẩn và chất chuẩn cùng nồng độ

• Mẫu trắng không được cho tín hiệu tại thời gian lưu của chất phân tích

Mẫu thêm chuẩn cần phải được thực hiện tại thời gian lưu gần với thời gian lưu của chất chuẩn, với chênh lệch không vượt quá 5% đối với sắc ký lỏng và 2% đối với sắc ký khí.

Để đảm bảo độ chính xác của phương pháp, cần đánh giá ảnh hưởng của các chất không mong muốn bằng cách thêm chúng vào mẫu với nồng độ phù hợp Việc này giúp xác định sai lệch kết quả so với mẫu gốc, và mức sai lệch cho phép không được vượt quá 5%.

Hệ thống sắc ký sử dụng detector chuỗi diod (DAD) cho phép xác định tính chọn lọc thông qua việc đánh giá độ tinh khiết của píc tại ba vị trí: đỉnh píc, nửa trước píc và nửa sau píc Để đảm bảo tính chính xác, giá trị độ tinh khiết phải đạt tối thiểu 99,0% (hoặc 0,990).

Giới hạn phát hiện được định nghĩa là nồng độ tại đó giá trị xác định được lớn hơn độ không đảm bảo đo của phương pháp Đây là nồng độ thấp nhất của chất phân tích trong mẫu có thể phát hiện, nhưng chưa đủ để định lượng trong các phương pháp định lượng.

Tiến hành thí nghiệm trên mẫu thử bằng cách thực hiện 10 lần song song Mẫu thử có nồng độ thấp, nằm trong khoảng 5 đến 7 lần giới hạn phát hiện (LOD) ước lượng Sau khi thu thập dữ liệu, tính giá trị trung bình (x̄) và độ lệch chuẩn (SD) để đánh giá kết quả.

- Đánh giá LOD đã tính được: tính R − x / LOD

+ Nếu 4 < R < 10 thì nồng độ dung dịch thử là phù hợp và LOD tính được là đáng tin cậy

+ Nếu R < 4 thì phải dùng dung dịch thử đậm đặc hơn, hoặc thêm một ít chất chuẩn vào dung dịch thửđã dùng và làm lại thí nghiệm và tính lại R

+ Nếu R > 10 thì phải dùng dung dịch thử loãng hơn, hoặc pha loãng dung dịch thửđã dùng và làm lại thí nghiệm và tính lại R

LOQ, hay còn gọi là nồng độ tối thiểu có thể định lượng, là mức độ tối thiểu của một chất trong mẫu thử mà phương pháp khảo sát có thể xác định được, đồng thời đảm bảo kết quả đạt độ chụm mong muốn.

Cách xác định: Đa số việc ước lượng LOQ dựa trên độ lệch chuẩn hoặc LOD

2.3.3.4 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn Để xác định khoảng tuyến tính, thực hiện đo các dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu vào nồng độ Xác định sự phụ thuộc giữa diện tích píc thu được vào nồng độ cho đến khi không còn tuyến tính Xây dựng đường chuẩn trên nền mẫu thực, nhằm mục đích loại trừ ảnh hưởng của nền mẫu đến kết quả phân tích Các bước xâydựng đường chuẩn:

- Pha dãy chuẩn trên nền dịch chiết mẫu trắng

- Các đường chuẩn được đánh giá dựa trên hai tiêu chí:

- Hệ số tương quan tuyến tính, 𝑅𝑅 2 ≥ 0,99 - Độ chệch của từng điểm chuẩn so với đường chuẩn, ∆i ≤ 15%, (∆i ≤ 20% tại LOQ) Độ chệch được tính theo công thức sau: ( ) ( )

Công thức tính nồng độ theo đường chuẩn được biểu diễn bằng ∆ = − ×, trong đó Ci(tt) là nồng độ thực tế của điểm chuẩn thứ “i”, được tính bằng ng/mL Ci(lt) đại diện cho nồng độ lý thuyết, tức là nồng độ của dung dịch chuẩn tại điểm chuẩn thứ “i”, cũng được tính bằng ng/mL.

2.3.3.5 Đánh giá độ chính xác(độ chụm và độ đúng của phương pháp) a) Độ đúng (được đánh giá quá độ thu hồi)

Để tính độ thu hồi của mẫu thử, cần thêm một lượng chất chuẩn xác định vào mẫu phân tích Sau đó, thực hiện lặp lại quy trình khảo sát này 10 lần với các mẫu đã thêm chất chuẩn Kết quả thu hồi sẽ được tính toán theo công thức đã quy định.

Cm+c: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thêm chuẩn

Cm: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thử

Cc: Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết)

Ctt: Nồng độ chất phân tích trong mẫu trắng thêm chuẩn

Sau đó tính độ thu hồi chung là trung bình của độ thu hồi các lần lặp

Để đảm bảo độ chính xác trong nghiên cứu, cần thêm chất chuẩn ở hai mức nồng độ: mức thấp (LOQ của phương pháp) và mức trung bình trong khoảng nồng độ làm việc Đánh giá độ chụm được thực hiện thông qua việc xác định độ lặp lại và độ tái lập, nhằm đảm bảo tính nhất quán của kết quả.

- Với cùng một mẫu đã được làm đồng nhất, tiến hành xác định bằng phương pháp đề xuất 10 lần như sau:

Để xác định độ lặp lại (RSD < 21%), một người cần thực hiện 10 lần thử nghiệm trên cùng một thiết bị trong khoảng thời gian ngắn và dưới các điều kiện thí nghiệm giống nhau.

Độ tái lập nội bộ được xác định là dưới 31,7%, với hai cán bộ thực hiện phân tích cùng một mẫu ở các thời điểm khác nhau, mỗi cán bộ tiến hành phân tích 10 lần.

Sau đó tính SDr; SDRhoặc RSD r ; RSDRtheo công thức:

Trong đó: xi : là giá trị đo được thứ i

: là giá trị trung bình n : là số lần đo.

SDr: Độ lệch chuẩn lặp lại

RSDr: Độ lệch chuẩn tương đối lặp lại

SDR: Độ lệch chuẩn tái lập (nội bộ)

RSDr: Độ lệch chuẩn tương đối tái lập (nội bộ)

Sử dụng đường chuẩn trên nền mẫu thực để phân tích kết quả Các kết quảđược tính theo công thức sau:

Cm (ppb): Nồng độ của thuốc bảo vệ thực vật hữu cơ gốc Clo trong mẫu

C (ppb): Nồng độ thuốc bảo vệ thực vật hữu cơ gốc Clo trong mẫu tính toán từđường chuẩn

2.3.5 Phương pháp sử lý số liệu

KẾ T QU Ả NGHIÊN C Ứ U

Điề u ki ệ n s ắ c ký

Khảo sát lựa chọn các điều kiện tách của GC:

Cột sắc ký là công cụ quan trọng trong việc xác định đồng thời hỗn hợp nhiều loại thuốc trừ sâu, yêu cầu khảo sát pha tĩnh Nghiên cứu này sử dụng pha tĩnh 1,4-bis(dimethylsiloxy)phenylene dimethyl polysiloxane với cột Elite-5 MS (30M, 0,32mmID, 0,25 àm) của PerkinElmer Loại pha tĩnh này có tính phân cực yếu, phù hợp cho việc phân tích các hợp chất thơm đa vòng, hydrocacbon clo hóa, phthalate, phenol, amin, thuốc trừ sâu nhóm Clo hữu cơ và thuốc bảo vệ thực vật gốc phosphor hữu cơ.

- Khí mang được sử dụng là khí Heli có độ tinh khiết trên 99,999%, với tốc độdòng được khảo sát là 1,5mL/ phút

Bộ tiêm mẫu tự động có hai chế độ tiêm: không chia dòng và chia dòng Chế độ không chia dòng mang lại độ nhạy cao, phù hợp cho phân tích dạng vết và siêu vết Trong khi đó, chế độ chia dòng giúp tạo hình dạng píc đẹp hơn, đồng thời vẫn duy trì độ nhạy và giảm nhiễu nền khi sử dụng tỷ lệ phù hợp Nhiệt độ buồng tiêm được thiết lập ở 250 o C, và ba chế độ chia dòng được khảo sát bao gồm chia dòng 9:1, chia dòng 4:1 và chia dòng 1:1.

Hình 3.1 : Sắc ký đồ của thuốc trừ sâu Clo hữu cơ với chếđộ chia dòng 1:1

Hình 3.2 : Sắc ký đồ của thuốc trừ sâu Clo hữu cơ với chếđộ chia dòng 4 :1

Hình 3.3 : Sắc ký đồ của thuốc trừ sâu Clo hữu cơ với chếđộ chia dòng 9 :1

Kết quả khảo sát cho thấy chế độ chia dòng 4:1 là tối ưu nhất, mang lại sự tách biệt rõ ràng giữa các chất, cường độ pic cao và nền ổn định nhất.

3.1.2 Khảo sát thể tích tiêm mẫu

Thể tích tiêm mẫu với bộ tiêm mẫu tự động chỉ phù hợp với mức 1-2 mL, với mức tối đa là 2 mL, giúp tăng độ nhạy của thiết bị Tuy nhiên, nếu có dấu hiệu kéo đuôi pic do mẫu chưa được hóa hơi hoàn toàn, thể tích được lựa chọn sẽ là 1 mL.

3.1.3 Khảo sát chương trình nhiệt độ cột tách Điều kiện gradient nhiệt độđược lựa chọn như sau: Khảo sát 4 chương trình sau:

• Chương trình 1: 70 0 C giữ 1 phút, tăng 15 0 C/phút đến 180 0 C giữ 0 phút, sau đó tăng 3,5 0 C/phút đến 230 0 C giữ 2 phút, tiếp tục tăng 20 0 C/phút đến 280 0 C giữ

• Chương trình 2: 65 0 C giữ 1 phút, tăng 15 0 C/phút đến 180 0 C giữ 0 phút, sau đó tăng 3 0 C/phút đến 230 0 C giữ 1 phút, tiếp tục tăng 30 0 C/phút đến 280 0 C giữ 3 phút

Hình 3.4 : Sắc ký đồ của thuốc trừ sâu Clo hữu cơ với chương trình nhiệt 1

Hình 3.6: Sắc ký đồ của thuốc trừ sâu Clo hữu cơ với chương trình nhiệt 3

Sắc ký đồ của thuốc trừ sâu Clo hữu cơ được thể hiện qua chương trình nhiệt 6, cho thấy sự thay đổi của chương trình nhiệt ảnh hưởng đến diện tích pic của các chất cụ thể Hai bảng dưới đây minh họa sự biến đổi này một cách rõ ràng.

Bảng 3.1: Thời gian lưu và diện tích pic mảnh của các chương trình nhiệt 1 đến 3

STT Tên Chương trình 1 Chương trình 2 Chương trình 3

Thời gian Diện tích Thời gian

Bảng 3.2: Thời gian lưu và diện tích pic mảnh của các chương trình nhiệt 4 đến 6

STT Tên Chương trình 4 Chương trình 5 Chương trình 6

Thời gian Diện tích Thời gian

Bảng 3.3 Chương trình lò cột của GC

Thời gian duy trì (phút)

3.1.4 Khảo sát nhiệt độ cổng bơm

Nhiệt độ cổng bơm ở các nhiệt độ 200 o C, 210 o C, 220 o C, 230 o C, 240 o C, 250 o C,

Khi khảo sát ở nhiệt độ 260 oC, kết quả cho thấy rằng khi nhiệt độ cổng bơm tăng, đa số diện tích pic cũng tăng lên Tuy nhiên, sự gia tăng này chỉ diễn ra đến mức 240 oC, sau đó diện tích pic bắt đầu giảm khi nhiệt độ tiếp tục tăng Kết quả này chỉ ra rằng có một giới hạn nhiệt độ ảnh hưởng đến diện tích pic.

240 o C cho diện tích pic chất lớn nhất với tất cả các chất nghiên cứu

Bảng 3.4: Thời gian lưu và diện tích pic chất khảo sát nhiệt độ cổng bơm dưới 220 o C

Bảng 3.5: Thời gian lưu và diện tích pic chất khảo sát nhiệt độ cổng bơm trên 220 o C

STT Tên Mảnh phổ Tại 230 o C Tại 240 o C Tại 250 o C Tại 260 o C

3.1.5 Khảo sát tốc độ khí mang Heli

Tốc độ khí mang heli (99,999%) có ảnh hưởng rõ rệt đến thời gian lưu và diện tích pic ở các mức 1,3 ml/phút đến 1,7 ml/phút, như thể hiện trong Bảng 3.6 và 3.7 Kết quả cho thấy khi tốc độ khí mang heli tăng, thời gian lưu giảm và các pic vẫn tách biệt rõ ràng, đồng thời diện tích pic của các chất tăng lên Để đảm bảo sự tách biệt hoàn toàn giữa các chất, tốc độ dòng khí mang heli 1,7 ml/phút đã được lựa chọn.

Bảng 3.6: Thời gian lưu và diện tích pic tại 1,3mL/ phút và 1,4mL/ phút

STT Tên Mảnh phổ Tại 1,3ml/ phút Tại 1,4ml/ phút

Thời gian Diện tích Thời gian Diện tích

Bảng 3.7 Thời gian lưu và diện tích pic chất khảo sát tốc độ dòng khí heli tại

1,5mL/ phút; 1,6mL/ phút và 1,7mL/ phút

Tại 1,5ml/phút Tại 1,6ml/phút Tại 1,7ml/phút

3.1.6 Khảo sát nhiệt độống chuyển GC-MS

Nhiệt độ của bộ phận kết nối GC-MS ở các mức 230 o C, 240 o C, 250 o C, 260 o C, 270 o C và

280 o C đã được khảo sát Kết quả từ bảng 3.5 cho thấy rằng nhiệt độ bộ phận kết nối GC-

Nhiệt độ 250 oC trong quá trình phân tích GC-MS cho phép các pic tách biệt rõ ràng và đạt diện tích pic chất lớn nhất Vì vậy, nhiệt độ này được lựa chọn để tối ưu hóa hiệu suất phân tích.

Bảng 3.8: Thời gian lưu và diện tích pic chất khảo sát nhiệt độ Transfer Line

STT Tên Mảnh phổ Tại 230 o C Tại 240 o C Tại 250 o C

Mảnh phổ Tại 260 o C Tại 270 o C Tại 280 o C

3.1.7 Khảo sát nhiệt độ nguồn ion hóa

Khảo sát các nhiệt độ của nguồn ion hóa tại 200 o C, 210 o C, 220 o C, 230 o C, 240 o C,

250 o C được thực hiện Kết quả từ Bảng 3.9 cho thấy khi nhiệt độtăng từ 200 o C đến

230 o C thì diện tích pic tăng và sau đó diện tích pic giảm nên nhiệt độ nguồn tại

Bảng 3.9: Thời gian lưu và diện tích pic chất khảo sát nhiệt độ nguồn

STT Tên Mảnh phổ Tại 200 o C Tại 210 o C Tại 220 o C

Mảnh phổ Tại 230 o C Tại 240 o C Tại 250 o C

 Tổng hợp các điều kiện tối ưu của GC-MS đượcxác định dưới bảng sau:

Bảng 3.11 Điều kiện tối ưu để xác định thuốc trừ sâu Clo hữu cơ trên thiết bị GC-

Năng lượng ion hóa Ei 70 eV

Năng lượng khuếch đai đầu dò

Nhiệt độ bộ phận kết nối

Cột sắc ký Cột mao quản Elite-5

Kích thước cột 30 m (Chiều dài cột) x 0,32mm (Đường kính trong) x

Tốc độ dòng qua cột 1,7 ml/phút

Thời gian ngắt dung môi 7 phút

Chếđộ chạy SIM và SCAN

 Thời gian lưu của chất phân tích

Dưới điều kiện tối ưu, các dẫn chất thuốc trừ sâu nhóm Clo hữu cơ đã được tách biệt hoàn toàn trong vòng 20 phút.

Bảng 3.12: Thời gian lưu của các chất trong hỗn hợp 18 chất chuẩn

TT Tên chất Thời gian lưu

(phút) TT Tên chất Thời gian lưu

 Xác định các chất theo mảnh ion (m/z) thu được

Trong phân tích GC-MS, ngoài việc xác định chất dựa trên thời gian lưu, còn sử dụng giá trị mảnh phổ m/z của các chất cần phân tích so với giá trị mảnh phổ của chất chuẩn trong thư viện phổ có sẵn thông qua kỹ thuật SCAN Các mảnh khối chính được dùng để định lượng và các mảnh đặc trưng để định tính cho mỗi chất trong hỗn hợp 18 chất chuẩn đã được xác định (Bảng 3.13).

Bảng 3.13: Các mảnh phổ đặc trưng và mảnh chính sử dụng theo GC-MS/SIR

STT Tên chất Các mảnh khối đặc trưng Mảnh định lượng

Xây d ự ng quy trình chi ế t tách thu ố c tr ừ sâu g ố c clor h ữu cơ từ m ẫ u huy ế t tương

Chúng tôi đã áp dụng đồng thời hai phương pháp chiết tách: chiết pha rắn với cột florisil và phương pháp QuEChERS Mẫu huyết tương là một nền mẫu mới và phức tạp, có thể ảnh hưởng đến kết quả phân tích Vì vậy, chúng tôi đã tối ưu hóa các điều kiện và đạt được kết quả như mong đợi.

3.2 1 Phương pháp chiết pha rắn

Chiết mẫu bằng dung môi n-Hexan và hỗn hợp n-Hexan: aceton (9:1) được thực hiện, sau đó dịch chiết được làm sạch bằng cột chiết pha rắn Florisil với các dung môi n-Hexan và hệ dung môi kết hợp n-Hexan và Dichloromethane theo các tỉ lệ khác nhau.

- Trong nghiên cứu chúng tôi thực hiện hai quy trình chiết như sau:

Để tiến hành chiết xuất, thêm 5mL n-Hexan vào 1mL huyết tương, sau đó lắc bằng máy vontex trong 1 phút Tiếp theo, ly tâm ở tốc độ 4400 vòng/phút trong 5 phút và hút lớp dung môi phía trên Quy trình này được lặp lại hai lần và gộp lại dịch chiết thu được.

• Thêm 3 giọt iso- octan sau đó đểbay hơi (hoặc cô Nito) đến khoảng 2mL

To prepare the Florisil column, add 1 gram of activated 𝑁𝑁𝑁𝑁 2 𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆

• Cô cạn và định mức bằng 1mL n- Hexan, lọc qua đầu lọc kích thước 0.45àm, sau đú phõn tớch trờn GCMS

• 1mL huyết tương bổ sung 5mL hỗn hợn n-Hexan: Aceton (9:1)

• Sau đó lắc vontex 1 phút và ly tâm ở 4400 vòng/ phút trong vòng 5 phút Hút lớp dung môi phía trên Lặp lại hai lần và gộp dịch chiết

• Thêm 3 giọt iso- octan sau đó để bay hơi (hoặc cô Nito) đến khoảng 2mL

Add 1 gram of activated Florisil to the column, followed by the addition of 10 mL of n-Hexane Transfer the extract onto the column and elute with 6 mL of n-Hexane and 6 mL of a mixture of n-Hexane and Dichloromethane in a 5:1 ratio.

• Cô cạn và định mức bằng 1mL n- Hexan, lọc qua đầu lọc kích thước 0.45àm, sau đú phõn tớch trờn GCMS.

Phương pháp chiết pha rắn đã được sử dụng rộng rãi và mang lại hiệu quả tốt trong việc chiết xuất từ các mẫu thực phẩm, trầm tích và dược liệu Tuy nhiên, khi áp dụng trên mẫu huyết tương, hiệu suất thu hồi chỉ đạt khoảng 40-45% Nguyên nhân có thể do quá trình rửa giải qua cột chưa hoàn toàn hiệu quả, vì vậy chúng tôi đã tiến hành khảo sát các điều kiện chiết khác nhau Mặc dù đã thử nghiệm, hiệu suất thu hồi của phương pháp vẫn chưa được cải thiện.

Hình 3.10: Hiệu suất thu hồi của phương pháp khi chiết mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn ở cùng nồng độ 20ppb

3.2.2 Chiết bằng phương pháp Qu e ChERS:

Dựa trên nguyên tắc xử lý mẫu huyết tương và tính chất lý hóa của thuốc trừ sâu nhóm Clo hữu cơ, phương pháp QueChERS đã được chọn làm phương pháp xử lý mẫu sau khi thực hiện khảo sát các phương pháp khác.

Phương pháp QueChERS sử dụng axetonitril đã đệm hóa để chiết mẫu và tách nước bằng muối magie sulfat (MgSO4) và natri clorua (NaCl) Quá trình làm sạch d-SPE giúp loại bỏ axit hữu cơ và nước dư thừa thông qua chất hấp phụ amin bậc 1 và 2 (PSA) kết hợp với MgSO4 Dịch chiết sau đó được cô cạn và hòa tan bằng n-Hexan, rồi phân tích bằng sắc ký khí Tỷ lệ MgSO4: NaCl được điều chỉnh để tối ưu hóa hiệu suất thu hồi Các bước trong quy trình chiết này bao gồm nhiều công đoạn quan trọng.

Để tạo ra hỗn hợp huyết tương đồng hóa, cần tiến hành đồng hóa huyết tương và bổ sung nước tinh khiết đã loại ion với tỷ lệ 1:1 theo thể tích.

Để chuẩn bị dung môi chiết axetonitril được đệm hóa và tách nước, cần thêm MgSO4 và NaCl vào axetonitril Lượng MgSO4 sử dụng từ 100-500 mg cho mỗi ml axetonitril, trong khi lượng NaCl sử dụng từ 50-100 mg cho mỗi ml axetonitril.

- Thêm hỗn hợp huyết tương nêu trên vào dung môi chiết axetonitril được đệm hóa và tách nước nêu trên

Để làm sạch dung dịch trên bề mặt, hãy thêm dung dịch vào hỗn hợp MgSO4 (100-150mg) và PSA (150-200mg) Sau đó, tiến hành cô đặc dung dịch đã được làm sạch bằng thiết bị cô sử dụng khí nitơ.

Dựa trên quy trình đã nêu, một số khảo sát đã được tiến hành để tối ưu hóa hiệu suất chiết xuất từ mẫu huyết tương.

- Khảo sát lựa chọn dung môi chiết

- Đánh giá ảnh hưởng của nền mẫu

 Lựa chọn dung môi chiết

Dung môi acetonitril là một lựa chọn hiệu quả cho quá trình chiết xuất và mang lại sự phân lớp tối ưu Tuy nhiên, tỷ lệ giữa MgSO4 và NaCl cũng như giữa MgSO4 và PSA có thể ảnh hưởng đến hiệu quả tách chiết Các quy trình QuEChERS đã được nghiên cứu để tối ưu hóa quá trình này.

Bảng 3.14 : Các quy trình khảo sát tỷ lệ MgSO 4 :NaCl

Để đạt được nồng độ 20ppb trên mẫu, cần sử dụng mẫu huyết tương thêm chuẩn Mỗi nồng độ thêm chuẩn được thực hiện ba lần và tính toán kết quả trung bình Các kết quả thu được được trình bày trong hình.

Hình 3.11 So sánh độ thu hồi của hóa chất bảo vệ thực vật nhóm clor hữu cơ của bốn quy trình

Tỷ lệ MgSO4 : NaCl ảnh hưởng đáng kể đến hiệu suất chiết xuất chất bảo vệ thực vật nhóm Clo hữu cơ Quy trình 3 với tỷ lệ MgSO4 : NaCl là 4:1 đạt hiệu suất chiết cao nhất Muối NaCl giúp dịch chiết phân lớp hiệu quả hơn, đóng vai trò quan trọng trong việc tách biệt hai pha nước và Acetonitril.

Tỷ lệ của PSA NaCl cũng được khảo sát trong nghiên cứu này Chúng tôi thay đổi hàm lượng của NaCl lần lượt là 100, 120, 150, 180, 200, 220 thì tại giá trị

180, 100 và 220 thì dịch chiết là ổn định nhất, sạch nhất.

Th ẩm định các phương pháp phân tích hóa chấ t b ả o v ệ th ự c v ậ t g ố c clor h ữ u cơ trong nề n m ẫ u huy ết tương

Phương pháp đã được đánh giá qua các thông số sau:

- Tính đặc hiệu, chọn lọc

- Khoảng tuyến tính và đường chuẩn

- Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

- Độ lặp lại và độ thu hồi

3.3.1 Tính đặc hiệu chọn lọc

Bơm lần lượt dung dịch chuẩn chứa hỗn hợp 18 chất chuẩn với nồng độ đã biết, cùng với mẫu thêm chuẩn và mẫu trắng vào cột sắc ký trong cùng điều kiện phân tích Mẫu thêm chuẩn là mẫu thực tế được bổ sung chất chuẩn, trong khi mẫu trắng là mẫu kiểm soát không chứa chất quan tâm Phân tích được thực hiện lặp lại 10 lần cho cả mẫu dung dịch chuẩn và mẫu thêm chuẩn nhằm xác định thời gian lưu của các chất.

Hình: 3.12 Sắc ký đồ chế độ quét SIR của các hợp chất hữu cơ

Thời gian lưu của hỗn hợp thuốc trừ sâu nhóm Clo hữu cơ được trình bày trong bảng 3.15, kèm theo giá trị độ lệch chuẩn tuyệt đối (SD) và độ lệch chuẩn tương đối (RSD) Kết quả từ Hình 3.9 và Hình 3.12 cho thấy, trong hai chế độ quét SCAN và SIR, tín hiệu của 18 pic tương đối cân xứng xuất hiện trong khoảng thời gian lưu từ 9,2 đến 17,8 phút khi phân tích dung dịch chuẩn và mẫu thêm chuẩn Do đó, hệ thống GC-MS và phương pháp phân tích này có thể được sử dụng để phân tích định tính và định lượng các thuốc trừ sâu nhóm Clo hữu cơ.

Bảng 3.15 Thời gian lưu của hỗn hợp thuốc trừ sâu nhóm Clo hữu cơ

STT Tên chất Thời gian lưu (phút) STT Tên chất Thời gian lưu

Bảng 3.16: Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống của phương pháp

STT Tên chất SD RSD (%)

3.3.2 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng

Thực hiện thử nghiệm lặp trên mẫu trắng với chuẩn được thêm vào ở hàm lượng thấp 2ppb, thấp hơn giới hạn phát hiện Giới hạn phát hiện được tính toán theo công thức.

LOD = X +3SD Trong đó X : Kết quả nồng độ trung bình khi thử mẫu trắng, mẫu thêm chuẩn SD: Độ lệch chuẩn khi thử mẫu trắng, mẫu thêm chuẩn

Vì nồng độ mẫu thấp hơn giới hạn định lượng dự kiến nên:

LOD=3*SD Giới hạn định lượng được tính theo công thức:

Để xác định độ ổn định của phương pháp, tiến hành thêm chuẩn vào mẫu trắng với nồng độ 2ppb và ước lượng các giá trị LOD Kết quả từ bảng 3.17 cho thấy hiệu suất thu hồi và độ lệch tiêu chuẩn tương đối tại giá trị LOQ là phù hợp, chứng minh rằng LOQ=3*LOD.

The AOAC 2016 guidelines, outlined in the "Official Methods of Analysis" by the Association of Official Analytical Chemists, provide standardized procedures for analytical testing These official methods are essential for ensuring accuracy and reliability in various analytical processes.

Bảng 3.17: Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp

STT Tên chất LOD (ppb) LOQ(ppb)

Nồng độ thêm chuẩn (ppb)

STT Tên chất LOD (ppb) LOQ(ppb)

Nồng độ thêm chuẩn (ppb)

3.3.3 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn Đường chuẩn được chuẩn bị trên nền mẫu huyết tương người để loại trừ ảnh hưởng của nền Mẫu trắng được chiết theo quy trình để thu lấy dịch chiết, pha dung dịch chuẩn trên nền mẫu trắng ở các khoảng nồng độ 0; 5; 10; 20; 50; 100; 200 ng/ml Đồ thịđường chuẩn của các chất phân tích được thể hiện trên Hình 3.13 đến Hình 3.28 với hệ sốxác định R 2 thỏa mãn 0,995≤ 𝑅𝑅 2 ≪ 1

Bảng 3.18: Bảng đường chuẩn của hỗn hợp các chất

Số thứ tự Chất chuẩn Mối tương quan Hệ sốxác định R 2

Hình 3.13: Đường chuẩn Alpha-BHC Hình 3.14 : Đường chuẩn Beta-BHC

Hình 3.15: Đường chuẩn Gama-BHC Hình 3.16 : Đường chuẩn Delta-BHC

Hình 3.17: Đường chuẩn Heptaclor Hình 3.18: Đường chuẩn Aldrin

Hình 3.19: Đường chuẩn Heptaclor epoxy

Hình 3.21: Đường chuẩn p,p’-DDE Hình 3.22: Đường chuẩn Dieldrin

Hình 3.23: Đường chuẩn Endrin Hình 3.24: Đường chuẩn Bet

Hình 3.25: Đường chuẩn Endosunfan sunfat

Hình 3.27 : Đường chuẩn Endrin keton Hình 3.28 : Đường chuẩn Methoxyclor

3.3.4 Độ lặp lại, độ tái lặp, độ thu hồi

Thêm chất chuẩn ở hai mức nồng độ thấp, cụ thể là 5ppb và 10ppb, cùng với mức nồng độ trung bình trong khoảng làm việc, sẽ giúp nâng cao độ chính xác trong phân tích.

Kết quả xác định mẫu thêm chuẩn ở nồng độ 50ppb cho thấy hiệu suất thu hồi tốt, đáp ứng các tiêu chí quy định trong AOAC 2016, như thể hiện trong bảng 3.17 và bảng 3.19.

Bảng 3.19: Kết quả độ thu hồi tại nồng độ 50ppb

STT Tên chất Thời gian H(%)

 Độ lặp lại, độ tái lập nội bộ

Với cùng một mẫu đã được làm đồng nhất, tiến hành xác định bằng phương pháp đề xuất 10 lần như sau Kết quảthu được biểu diễn ở Bảng 3.20

Bảng 3.20: Kết quả độ lặp lại là độ tái lập nội bộ tại nồng độ 50ppb

STT Tên chất Độ lặp(%) Độ tái lặp(%)

Các kết quả thu được đối với mẫu thêm chuẩn tại nồng độ 50 ppb cho … (bàn luận

K ế t qu ả th ẩm định phương pháp

Chúng tôi đã phát triển một phương pháp định lượng thuốc trừ sâu gốc Clor hữu cơ bằng kỹ thuật GC-MS, sử dụng nguồn ion EI và thiết bị phân tích khối loại tứ cực của Perkin Elmer Phương pháp này có khả năng định tính và định lượng đồng thời 18 loại thuốc trừ sâu hữu cơ với giới hạn phát hiện (LOQ) từ 5-10 ng/ml Giá trị LOQ của phương pháp đáp ứng yêu cầu phát hiện và định lượng dư lượng thuốc trừ sâu hữu cơ trong huyết tương.

Trong nghiên cứu này, tất cả các thuốc trừ sâu hữu cơ đều cho thấy độ tuyến tính tốt với hệ số tương quan R ≥ 0,995 trong khoảng nồng độ khảo sát Độ lặp lại của các phép đo nằm trong khoảng 3,92 đến 7,93%, trong khi độ tái lập nội bộ dao động từ 4,57 đến 8,89%.

Hiệu suất thu hồi đạt từ 78,17 đến 102,23% Tất cả các khảo sát trên phù hợp với các điều kiện được đưa ra theo AOAC 2017.

K ế t qu ả dư lượ ng m ộ t s ố thu ố c tr ừ sâu g ố c Clo h ữu cơ trong huyết tương

Trong nghiên cứu này, chúng tôi xác định hàm lượng của 18 hợp chất clo hữu cơ, bao gồm Alpha-BHC, beta-BHC, gama-BHC, Delta-BHC, Heptaclor, Aldrin, Heptaclor epoxy, Alpha-Endosulfan, Dieldrin và Endrin.

Trong nghiên cứu, chỉ phát hiện được 4 hợp chất gồm alpha-BHC, gama-BHC, p,p’-DDE và p,p’-DDT trong mẫu huyết thanh của các đối tượng Tỷ lệ phát hiện các hợp chất này khác nhau giữa các nhóm đối tượng nghiên cứu.

- Alpha-BHC và gama-BHC chỉ được phát hiện trên nhóm chứng với tỷ lệ 1/70 (1.43%)

- P,p’-DDE có tỷ lệ phát hiện là 6/70 (8.6%) và chỉ phát hiện thấy trên nhóm chứng

- P,p’-DDT có tỷ lệ phát hiện được ở nhóm chứng là 1/70 (1.43%) và nhóm bệnh là 5/79 (6.3%)

Hợp chất p,p’-DDE chỉ được phát hiện ở nhóm chứng với tỷ lệ 6/70, trong khi p,p’-DDT xuất hiện nhiều hơn ở nhóm bệnh với tỷ lệ 5/79 và chỉ 1/70 ở nhóm chứng Tổng cộng, tỷ lệ phát hiện cả p,p’-DDE và p,p’-DDT trong nghiên cứu là 6/149 (4.03%) p,p’-DDE là sản phẩm chuyển hoá từ p,p’-DDT, và hàng năm, tỷ lệ phân huỷ của p,p’-DDT thành p,p’-DDE rất thấp, chỉ chiếm vài phần trăm Hợp chất p,p’-DDE có độc tính hóa học cao hơn so với p,p’-DDT.

Phương pháp đo GC-MS đã được đánh giá dựa trên các thông số như tính đặc hiệu, tính chọn lọc, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, khoảng tuyến tính và độ chụm, độ đúng Đường chuẩn được xây dựng trên nền mẫu nhằm loại trừ ảnh hưởng của nền, gồm bảy điểm với mỗi chất phân tích, sử dụng dung dịch pha loãng từ dung dịch chuẩn và có hệ số tuyến tính lớn hơn 0,995 Hàm lượng chất nghiên cứu trong đất được xác định thông qua diện tích pic sắc ký, đảm bảo độ đúng và độ chính xác trong giới hạn đo của phương pháp.

- So sánh hàm lượng thuốc bảo vệ thực vật nhóm clo hữu cơ trên các đối tượng nghiên cứu và một số nghiên cứu khác

Các thuốc trừ sâu gốc clo hữu cơ như DDT và DDE có khả năng tan trong mỡ cao và thời gian bán huỷ dài, dẫn đến tích luỹ sinh học trong sinh vật và môi trường Mặc dù đã bị cấm, DDT vẫn được phát hiện trong nhiều sinh vật Nghiên cứu tại Hà Nội cho thấy 47/60 mẫu đất có DDT và các hợp chất chuyển hoá, với hàm lượng DDT trong đất nông nghiệp gần đạt ngưỡng tối đa cho phép (100 ng/g) Một số mẫu vượt ngưỡng này, trong khi tại các khu công nghiệp và trung tâm thành phố, DDT được phát hiện với nồng độ từ không đến 67,82 ng/g Tỷ lệ trung bình của DDT và các chất chuyển hoá so với DDT tổng trong các mẫu đất giảm theo thứ tự: p,p’-DDE (54,4%) > p,p’-DDD.

Nghiên cứu cho thấy hàm lượng p,p’-DDT đạt 25,5% và DDT đạt 20,1%, cho thấy rằng nồng độ DDT cùng các hợp chất chuyển hóa của nó vẫn còn rất cao trong đất Điều này là một trong những nguồn chính gây xâm nhập DDT vào cơ thể con người.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Qua quá trình thực hiện đềtài, chúng tôi đã thu được các kết quảchính như sau:

1 Đã xây dựng được quy trình định lượng đồng thời 18 thuốc trừ sâu nhóm Clor trong huyết tương người bằng GC-MS như sau:

• Đã khảo sát và xây dựng được quy trình xử lý mẫu bằng phương pháp

QuEChERS sử dụng dung chiết acetonitril đã đệm hóa để tách nước trong mẫu bằng phương pháp phân bố lỏng lỏng, kết hợp với muối magie sulfat (MgSO4) và natri clorua (NaCl) Quá trình làm sạch bằng chiết phân tán pha rắn (d-SPE) giúp loại bỏ axit hữu cơ, nước dư và các thành phần không mong muốn nhờ sự kết hợp của chất hấp phụ amin bậc 1 và bậc 2 (PSA) cùng với MgSO4 Sau khi dịch chiết được cô cạn, nó được hòa tan bằng dung môi n-Hexan và sau đó bơm vào hệ thống GCMS, đảm bảo hiệu suất thu hồi cao, độ lặp lại và độ tái lập tốt.

Điều kiện sắc ký đã được thiết lập với cột sắc ký khí Elite 5 (30 m × 0,25 mm; 0,25 µm) Nhiệt độ buồng bơm mẫu được duy trì ở 240 °C, sử dụng chế độ tiềm khủng chia dòng Khí mang là heli với tốc độ dòng 1,7 mL/phút và nhiệt độ bộ phận kết nối giữa sắc ký khí và khối phổ là 250 °C Chương trình nhiệt độ cột GC bắt đầu ở 70 °C trong 1 phút, sau đó tăng 15 °C/phút đến 180 °C giữ trong 0 phút, tiếp tục tăng 5 °C/phút đến 210 °C giữ trong 0 phút, và cuối cùng tăng 15 °C/phút đến 280 °C giữ trong 3 phút.

- Bộ tiờm mẫu tựđộng với thể tớch tiờm mẫu 1 àL

- Khối phổ ba tứ cực với nguồn ion hoá: EI 70 eV, nhiệt độ nguồn ion: 230 o C

2 Đã thẩm định được phương pháp xác định 18 thuốc trừ sâu gốc clor hữu cơ bằng GC-MS

Phương pháp nghiên cứu cho thấy có độ đặc hiệu cao, cho phép định tính và định lượng đồng thời 18 chất trong huyết tương với giới hạn phát hiện thấp (5-10 ng/ml) và tương quan tuyến tính giữa tín hiệu và nồng độ với R ≥ 0,995 Độ lặp lại của phương pháp đạt từ 3,92 đến 7,93%, trong khi độ tái lập nội bộ nằm trong khoảng 4,57 đến 8,89% Hiệu suất thu hồi đạt từ 78,17 đến 102,23%, tất cả đều phù hợp với các tiêu chuẩn AOAC 2017.

Tiếp tục thực hiện phân tích mẫu lớn hơn để đánh giá khả năng tồn dư của thuốc trừ sâu nhóm Clo hữu cơ trong huyết tương người, nhằm xác định mối liên hệ giữa nhóm chất này và nguy cơ mắc bệnh ung thư vú.

Kỹ thuật GC-MS được mở rộng để xác định các nhóm thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) trong mẫu huyết tương, giúp đánh giá mức độ phơi nhiễm và tác động của từng nhóm thuốc BVTV đối với sức khỏe con người và động vật.

[1] Nguyễn Mạnh Chinh (2012), Cẩm nang thuốc bảo vệ thực vật, NXB Nông nghiệp, Hà Nội

[2] Hoàng Thị Hợi (2004), Giáo trình hóa bảo vệ thực vật, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội

[3] Phạm Luận (2014), Phương pháp phân tích sắc ký và chiết tách, Trường đại học Quốc gia Hà Nội

[4] Phạm Văn Lầm (2016), Bảo vệ thực vật phục vụ nông nghiệp theo hướng bền vững với nông sản an toàn, Hà Nội

"Fast and easy multiresidue method employing acetonitrile extraction/partitioning and dispersive solid-phase extraction for the determination of pesticide residues in produce", Journal of AOAC International, 86(2), 412–431

In their 2005 study published in the Journal of AOAC International, Lehotay et al validated a rapid and straightforward method for detecting residues of 229 pesticides in fruits and vegetables This innovative approach combines gas and liquid chromatography with mass spectrometric detection, enhancing the efficiency of pesticide residue analysis in food safety.

In their 2005 study published in the Journal of AOAC International, Lehotay, Mastovska, and Lightfield explore innovative techniques, including buffering, to enhance the analysis of problematic pesticide residues in fruits and vegetables Their research presents a fast and efficient method aimed at improving the accuracy of residue detection, contributing significantly to food safety and quality assurance.

The study by Payá et al (2007) presents the Quick Easy Cheap Effective Rugged and Safe (QuEChERS) method for analyzing pesticide residues, integrating gas and liquid chromatography along with tandem mass spectrometric detection Published in the journal Analytical and Bioanalytical Chemistry, this research highlights the effectiveness and reliability of the QuEChERS method in detecting multiple pesticide residues, demonstrating its significance in food safety and environmental monitoring.

[9] Reigart, J.R., & Roberts J.R (1999), “Recognition and Management of Pesticide Poisonings”, 5thedition, United State Environmental Protection Agency, Washington DC

[11] Prof H B Mathur, Prof H C Agarwa, Dr Sapna Johnson, Dr Nirmali Saikia( 2005), “Analysis Of Pesticide Residues In Blood Samples From Villages Of Punjab”, India

[12] FAO (2005), “International code of conduct on the distribution and use of pesticides”, Rome

[13] Herbicide use: benefits for society as a whole - a review

,accessed: 01/08/2019

Thực trạng sử dụng thuốc bảo vệ thực vật trong nông nghiệp ở Việt Nam cho thấy sự gia tăng trong việc áp dụng các hóa chất này nhằm bảo vệ cây trồng Tuy nhiên, việc lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật có thể dẫn đến những tác động tiêu cực đến môi trường và sức khỏe con người Cần có các biện pháp quản lý và giáo dục nông dân về việc sử dụng an toàn và hiệu quả các loại thuốc này để đảm bảo phát triển bền vững trong nông nghiệp.

[15] Isabelle Romieu, Mauricio Hernandez-Avila, Eduardo Lazcano-Ponce, Jean Philippe Weber,3 and Eric Dewailly, “Breast Cancer, Lactation History, and Serum Organochlorines”, 2000, USA

Tiêu đề	Nghiên Cứu Xác Định Thuốc Trừ Sâu Nhóm Clo Hữu Cơ Trong Huyết Tương Bằng Phương Pháp Sắc Ký Khí Ghép Nối Khối Phổ
Tác giả	Vũ Thị Cúc
Người hướng dẫn	PGS.TS. Nguyễn Xuân Trường, TS. Đặng Thế Hưng
Trường học	Trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội
Chuyên ngành	Hóa học
Thể loại	luận văn thạc sĩ
Năm xuất bản	2021
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	93
Dung lượng	1,78 MB