Xác định hàm lượng tổng axit amin trong một số loài nấm nuôi cấy bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu nâng cao

664 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO NAM TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT Độc lập -Tự -Hạnh phúc NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên : Khóa MSV Ngành : : : Nguyễn Thị Bích Ngọc Đinh Thị Dung 50 0952040393 Công nghệ thực phẩm Msv: 0952040387 Msv: 0952040393 1.Tên đề tài: Xác định hàm lƣợng tổng axit amin số lồi nấm ni cấy phƣơng pháp sắc kí lỏng hiệu cao Nội dung nghiên cứu, thiết kế tốt nghiệp: ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… Cán hƣớng dẫn : Ngày giao nhiệm vụ đồ án : Ngày hoàn thành đồ án : ThS Hoàng Văn Trung Ngày tháng năm 2013 Ngày tháng năm 2013 Ngày Chủ nhiệm môn (Ký ghi rõ họ tên) Sinh viên hoàn thành nộp đồ án vào ngày tháng năm 2013 Cán hƣớng dẫn (Ký, ghi rõ họ tên) tháng năm 2013 Ngƣời duyệt (Ký, ghi rõ họ tên) BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập -Tự -Hạnh phúc BẢN NHẬN XÉT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: Nguyễn Thị Bích Ngọc Khóa: Cán hƣớng dẫn: Cán duyệt: Msv: 0952040387 Đinh Thị Dung 50 Msv: 0952040393 Ngành: Cơng nghệ thực phẩm ThS Hồng Văn Trung Nội dung nghiên cứu, thiết kế: ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… Nhận xét cán hƣớng dẫn: ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………… Ngày tháng năm 2013 Cán hƣớng dẫn (Ký, ghi rõ họ, tên) BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập -Tự -Hạnh phúc BẢN NHẬN XÉT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: Nguyễn Thị Bích Ngọc Khóa: Cán hƣớng dẫn: Cán duyệt: Msv: Đinh Thị Dung 50 0952040387 Msv: 0952040393 Ngành: Cơng nghệ thực phẩm ThS Hồng Văn Trung Nội dung nghiên cứu, thiết kế: ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………… Nhận xét cán duyệt: ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… …………………………………… ……………………………………… tháng năm 2013 Cán duyệt (Ký, ghi rõ họ, tên) Ngày Đồ án tốt nghiệp GVHD : Th.S Hồng Văn Trung LỜI CẢM ƠN Khóa luận đƣợc thực phịng thí nghiệm Trung tâm Kiểm định An tồn Thực phẩm Mơi trƣờng - Trƣờng Đại học Vinh Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc, xin chân thành cảm ơn đến thầy giáo Th.S Hồng Văn Trung - Khoa Hóa học - Trƣờng Đại học Vinh giao đề tài, tận tình hƣớng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi suốt q trình nghiên cứu hồn thành đề tài Chúng xin chân thành cảm ơn ThS Chu Thị Thanh Lâm – Trung tâm kiểm định An toàn thực phẩm Mơi trƣờng – T.T Thực hành thí nghiệm Trƣờng Đại học Vinh tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ chúng tơi q trình làm thí nghiệm, hƣớng dẫn cách sử dụng máy HPLC đo mẫu Đề tài đƣợc hoàn thành nhờ hỗ trợ kinh phí từ đề tài Nghị định thƣ hợp tác Việt Nam – Đài Loan PGS.TS Trần Đình Thắng – Khoa Hóa học, trƣờng Đại Học Vinh Chúng tơi xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô, cán khoa Hoá giúp đỡ chúng tơi q trình thực đề tài Và lịng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè động viên, giúp đỡ chúng tơi hồn thành đề tài Vinh, ngày tháng năm 2013 Sinh viên thực Nguyễn Thị Bích Ngọc Đinh Thị Dung Lớp 50K- Hóa thực phẩm ii Đồ án tốt nghiệp GVHD : Th.S Hoàng Văn Trung MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU 1 Lí chọn đề tài Nhiệm vụ đồ án Đối tƣợng nghiên cứu CHƢƠNG : TỔNG QUAN Tổng quan Nấm 1.1 Giới thiệu giới nấm 1.2 Phân loại nấm 1.3 Các đặc điểm sinh học nấm 1.3.1 Đặc điểm cấu tạo tế bào 1.3.2 Đặc điểm dinh dƣỡng 1.4 Thành phần dinh dƣỡng nấm 1.5 Công dụng nấm Tổng quan Protein axitamin 10 2.1 Lịch sử phát Protein axit amin 10 2.2 Định nghĩa phân loại protein 11 2.3 Cấu tạo phân tử protein 12 2.3.1 Thành phần nguyên tố protein 12 2.3.2 Đơn vị cấu tạo sở protein – axit amin 12 2.3.2.1 Phân loại axitamin 12 2.3.2.2 Peptid 13 2.4 Cấu trúc phân tử protein 14 2.4.1 Cấu trúc bậc protein 14 2.4.2 Cấu trúc bậc hai protein 14 2.4.3 Cấu trúc bậc ba protein 14 2.4.4 Cấu trúc bậc bốn protein 15 2.5.Một số tính chất hóa lý protein axit amin 15 2.5.1 Tính chất biến tính 15 Lớp 50K- Hóa thực phẩm iii Đồ án tốt nghiệp GVHD : Th.S Hồng Văn Trung 2.5.2.Tính chất lƣỡng tính 15 2.5.3 Tính kị nƣớc 16 2.6 Tính chất hóa học protein axit amin 16 2.7 Chức năng, vai trò protein axit amin 17 2.7.1 Chức protein 17 2.7.2 Vai trò axit amin 19 2.8 Lƣợng nhu cầu axit amin cần thiết ngƣời 20 2.9 Nguồn protein axitamin 21 2.9.1 Trong thực phẩm 21 2.9.2 Protein axit amin trong nấm 22 Tổng quan phƣơng pháp định lƣợng protein axit amin 22 3.1 Định lƣợng protein phƣơng pháp Kjeldahl 22 3.1.1 Xác định nitơ tổng số theo phƣơng pháp Kjeldahl 22 3.1.2 Xác định nitơ phi protein 23 3.1.3 Định lƣợng protein nguyên liệu 23 3.2 Định lƣợng protein hòa tan 23 3.2.1 Định lƣợng protein hòa tan phƣơng pháp thông thƣờng 24 3.2.2 Định lƣợng protein hòa tan phƣơng pháp so màu 24 3.3 Định lƣợng protein tiêu hóa pepsin 25 3.4 Định lƣợng nitơ axit amin phƣơng pháp chuẩn độ 25 3.4.1 Định lƣợng nitơ formol (hóa sinh học ) 25 3.4.2 Định lƣợng nitơ axit amin Iốt 25 3.4.3 Định lƣợng axit amin theo phƣơng pháp Van Slyke 26 3.5 Các phƣơng pháp tách xác định đồng thời axit amin` 26 3.5.1 Các phƣơng pháp sắc ký cổ điển 26 3.5.1.1 Phƣơng pháp sắc ký mỏng 26 3.5.1.2 Phƣơng pháp sắc ký cột 26 3.5.1.3 Phƣơng pháp chuẩn độ điện 27 3.5.2 Phƣơng pháp sắc ký khí 27 3.5.3 Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 28 Lớp 50K- Hóa thực phẩm iv Đồ án tốt nghiệp GVHD : Th.S Hoàng Văn Trung 3.5.3.1 Cơ sở lý thuyết 28 3.5.3.2 Nguyên tắc trình sắc ký cột 29 3.5.3.3 Phân loại 29 3.5.3.4 Cấu tạo hệ thống HPLC 30 3.5.3.5 Chọn điều kiện sắc ký 33 3.5.3.6 Tiến hành sắc ký 35 3.5.3.7 Chuẩn bị mẫu đo HPLC 36 3.5.3.8 Cách đo HPLC 36 CHƢƠNG : THỰC NGHIỆM 37 Thiết bị 37 Dụng cụ 37 Hoá chất 37 Kỹ thuật thực nghiệm 38 4.1 Chất tạo dẫn xuất 38 4.2 Khảo sát thời gian thủy phân tối ƣu 39 4.3 Chuẩn bị hóa chất phân tích 39 4.4 Chuẩn bị xử lí mẫu 39 4.5 Tiến hành phân tích máy 42 CHƢƠNG III : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43 Xây dựng đƣờng chuẩn biểu diễn phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ 43 Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lƣợng 48 Tối ƣu hóa điều kiện thủy phân mẫu 49 3.1 Khảo sát nồng độ HCl 49 3.2 Khảo sát thời gian thủy phân mẫu 52 3.3 Xác định hiệu suất thu hồi phƣơng pháp 55 3.4 Xác định hàm lƣợng acid amin mẫu nấm 59 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 65 Kết luận 65 2.Kiến nghị 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO 67 Lớp 50K- Hóa thực phẩm v Đồ án tốt nghiệp GVHD : Th.S Hoàng Văn Trung DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 1: Trị số ƣớc lƣợng đòi hỏi axit amin cần thiết (mg/kg cân nặng/ngày): 20 Bảng 2: Đối chiếu loại axit amin thiết yếu: 21 Bảng 3: Sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ axit Aspartic 44 Bảng 4: Giá trị LOD LOQ axit Aspartic qua lần đo chuẩn 48 Bảng 5: Giá trị LOD LOQ 17 axit amin 49 Bảng 6: Ảnh hƣởng nồng độ HCl lên hiệu suất thu hồi 50 Bảng 7: Ảnh hƣởng thời gian thủy phân đến hiệu suất thu hồi 53 Bảng 8: Hiệu suất thu hồi axit amin nấm lỗ 56 Bảng 9: Hiệu suất thu hồi axit amin nấm 01 58 Bảng 10: Bảng quy đổi đơn vị 60 Bảng 11: Hàm lƣợng axit amin có mẫu nấm 61 Lớp 50K- Hóa thực phẩm vi Đồ án tốt nghiệp GVHD : Th.S Hoàng Văn Trung DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1: Mẫu nấm 01………………………………………………………………4 Hình 2: Mẫu nấm 02 Hình 3: Mẫu nấm 608……………………………………………………………4 Hình 4: Mẫu nấm 619 Hình 5: Mấu nấm 621…………………………………………………………… Hình 6: Mẫu nấm HKG 401……………………………………………………… Hình 7: Mẫu nấm HKG 406………………………………………………………5 Hình 8: Mẫu nấm lỗ Hình 9: Cấu trúc tế bào nấm ( Nguyễn Lân Dũng, 2002) Hình 10: Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC 30 Hình 11: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axit amin nồng độ 10pmol 43 Hình 12: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axit amin nồng độ 25pmol 43 Hình 13: Sắc đồ hỗn hợp chuẩn 17 axit amin nồng độ 100 pmol 44 Hình14 : Sự phụ thuộc hiệu suất thu hồi axit amin vào nồng độ HCl 50 Hình 15: Sắc đồ axit amin mẫu nấm 01 nồng độ HCl 5M 51 Hình16 : Sắc đồ axit amin mẫu nấm 01 nồng độ HCl 5.5M 51 Hình 17: Sắc đồ axit amin mẫu nấm 01 nồng độ HCl 6M 52 Hình 18: Sắc đồ axit amin mẫu nấm 01 nồng độ HCl 6.5M 52 Hình 19 : Sự phụ thuộc hiệu suất thu hồi axit amin vào thời gian thủy phân 53 Hình 20: Sắc đồ axit amin mẫu nấm 01 thời gian thủy phân 16h 54 Hình 21: Sắc đồ axit amin mẫu nấm 01 thời gian thủy phân 18h 54 Hình 22: Sắc đồ axit amin mẫu nấm 01 thời gian thủy phân 20h 55 Hình 23: Sắc đồ axit amin mẫu nấm 01 thời gian thủy phân 22h 55 Hình 24 : Sắc đồ axit amin nấm lỗ : 57 Hình 25: Sắc đồ axit amin mẫu nấm lỗ thêm chuẩn : 57 Hình 26: Sắc đồ axit amin mẫu nấm 01 58 Hình 27 : Sắc đồ axit amin mẫu nấm 01 thêm chuẩn 59 Hình 28: Sắc đồ axit amin nấm 02 62 Lớp 50K- Hóa thực phẩm vii Đồ án tốt nghiệp GVHD : Th.S Hồng Văn Trung Hình 29: Sắc đồ axit amin nấm 608 62 Hình 30: Sắc đồ axit amin nấm 619 63 Hình31 : Sắc đồ axit amin nấm 621 63 Hình 32: Sắc đồ axit amin nấm HKG401 64 Hình 33: Sắc đồ axit amin nấm HKG406 64 Lớp 50K- Hóa thực phẩm viii Đồ án tốt nghiệp GVHD : Th.S Hoàng Văn Trung Hình 22: Sắc đồ axit amin mẫu nấm 01 thời gian thủy phân 20h Hình 23: Sắc đồ axit amin mẫu nấm 01 thời gian thủy phân 22h 3.3 Xác định hiệu suất thu hồi phƣơng pháp Đây thông số thiếu đánh giá phƣơng pháp phân tích Dựa vào việc thêm chuẩn vào mẫu thực với việc tiến hành làm mẫu thực không thêm chuẩn song song chúng tơi tiến hành tính độ thu hồi nhƣ sau : Lớp 50K- Hóa thực phẩm 55 Đồ án tốt nghiệp GVHD : Th.S Hoàng Văn Trung Cs+mẫu - Cmẫu x 100% Cso - Hiệu suất thu hồi: %H = Trong đó: %H hiệu suất thu hồi Cs+ mẫu nồng độ tổng chuẩn thêm vào mẫu thực có đo đƣợc Cmẫu nồng độ mẫu thực đo đƣợc Cso nồng độ chuẩn biết trƣớc Chúng tiến hành xác định hiệu suất thu hồi mẫu nấm 01 nấm lỗ Tiến hành song song mẫu thực mẫu thêm chuẩn với quy trình nhƣ trình bày trên, thu đƣợc kết nhƣ sau : Bảng 8: Hiệu suất thu hồi axit amin nấm lỗ TT Nồng độ (µg/g) Axit amin Cs+ mẫu Cmẫu Cs+mẫu - Cmẫu Cso (µg/l) %H Asp KPH KPH - 66,5 Glu 806,8275 751,2615 55,5660 73,5 75,6 Ser 239,9244 196,6802 43,2442 52,5 82,37 His 61,1791 1,4886 59,6905 77,5 77,02 Gly 56,7681 26,7678 30,0003 37,5 80,43 Thr 372,7604 319,4663 53,2941 59,5 89,57 Ala 333,2854 289,0969 44,1885 44,5 99,30 Arg 452,661 363,3120 89,3490 87 102,70 Tyr 194,9995 114,6898 80,3097 90,5 88,74 10 Cys – ss - Cys 332,1471 275,2771 56,8700 60,5 94 11 Val 313,0356 249,5163 63,5193 58,5 108,58 12 Met 165,3619 109,5465 58,8154 74,5 74,92 13 Phe 57,783 - - 82,5 70,04 14 Ile 436,6478 380,5798 56,0680 65,5 85,60 15 Leu 378,0531 317,7931 60,2600 65,5 92 16 Lys 359,2015 276,7115 82,4900 73 113 17 Pro 429,7723 378,5886 51,2037 57,5 89,05 Lớp 50K- Hóa thực phẩm 56 Đồ án tốt nghiệp GVHD : Th.S Hồng Văn Trung Hình 24 : Sắc đồ axit amin nấm lỗ : Hình 25: Sắc đồ axit amin mẫu nấm lỗ thêm chuẩn : Lớp 50K- Hóa thực phẩm 57 Đồ án tốt nghiệp GVHD : Th.S Hoàng Văn Trung Bảng 9: Hiệu suất thu hồi axit amin nấm 01 TT Nồng độ (µg/g) Axit amin Cs+ mẫu Cmẫu Cs+mẫu - Cmẫu Cso (µg/l) %H Asp 79.9995 KPH 79.9995 66.5 120.3 Glu 421.9653 341.2080 80.8573 73.5 110.01 Ser 45.9375 - 45.9375 52.5 87.5 His 73.408 - 73.408 77.5 94.72 Gly 39.3007 13.077 26.2237 37.5 69.93 Thr 235.9299 192.6853 43.2446 59.5 72.68 Ala 188.5627 148.6462 39.9165 44.5 89.7 Arg 276.7896 197.4108 79.3788 87 91.24 Tyr 134.4435 47.111 87.3325 90.5 96.5 10 Cys – ss - Cys 223.3086 178.6778 44.6308 60.5 73.77 11 Val 136.5429 88.1634 48.3795 58.5 82.7 12 13 14 15 16 17 Met Phe Ile Leu Lys Pro 98.6192 65.9175 216.5788 153.1904 217.1135 277.6497 31.5096 KPH 151.9303 97.8036 160.0275 229.5222 67.1096 65.9175 64.6485 55.3868 57.086 48.1275 74.5 82.5 65.5 65.5 73 57.5 90.08 79.9 98.7 84.56 78.2 83.7 Hình 26: Sắc đồ axit amin mẫu nấm 01 Lớp 50K- Hóa thực phẩm 58 Đồ án tốt nghiệp GVHD : Th.S Hồng Văn Trung Hình 27 : Sắc đồ axit amin mẫu nấm 01 thêm chuẩn Các kết độ thu hồi nằm khoảng tuyến tính Do kết luận phƣơng pháp cho phép xác định hàm lƣợng axit amin có độ thu hồi khoảng 70-120 % Phần lớn axit amin có độ thu hồi khoảng từ 80 – 95 % Độ thu hồi tốt so với độ thu hồi cho phép xác định chất có hàm lƣợng 10 – 1000ppb 3.4 Xác định hàm lƣợng acid amin mẫu nấm Sau tìm đƣợc điều kiện tối ƣu cho trình xử lý mẫu phân tích axit amin mẫu nấm Đánh giá thống kê quy trình phân tích axit amin đạt giới hạn cho phép, tiến hành áp dụng phân tích mẫu thực tế gồm mẫu nấm : 01, 02, 608, 619, HKG401, HKG 406, 621, nấm lỗ Hàm lƣợng axit amin (μg/g) có mẫu đƣợc tính theo cơng thức sau : C=(Co/m).Vdm.f Trong : - C hàm lƣợng axit amin có mẫu, tính theo μg/g - Co: Hàm lƣợng axit amin có dịch chiết ( Co) thơng qua đƣờng chuẩn mg/l - f: hệ số pha lỗng (nếu có) - m: khối lƣợng mẫu thử (g) - Vdm: Thể tích bình định mức mẫu (ml) Lớp 50K- Hóa thực phẩm 59 Đồ án tốt nghiệp GVHD : Th.S Hoàng Văn Trung  Đổi đơn vị : Bảng 10: Bảng quy đổi đơn vị Axit amin Đơn vị Asparatic acid (Asp) 1pmol/ l = 133 x 10-12 g/10-6l = 133 g /l Glutamic acid (Glu) 1pmol/ l = 147 g /l Serine (Ser) 1pmol/ l = 105 g /l Histidine (His) 1pmol/ l = 155 g /l Glycine (Gly) 1pmol/ l = 75 g /l Threonine (Thr) 1pmol/ l = 119 g /l Alanine (Ala) 1pmol/ l = 89 g /l Arginine (Arg) 1pmol/ l = 174 g /l Tyrosine (Tyr) 1pmol/ l = 181 g /l Cystine (Cys-SS-Cys) 1pmol/ l = 121 g /l Valine (Val) 1pmol/ l = 117 g /l Methionine (Met) 1pmol/ l = 149 g /l Phenylalanine (Phe) 1pmol/ l = 165 g /l Isoleucine (Ile) 1pmol/ l = 131 g /l Leucine (Leu) 1pmol/ l = 131 g /l Proline (Pro) 1pmol/ l = 115 g /l Lysine (Lys) 1pmol/ l = 146 g /l Lớp 50K- Hóa thực phẩm 60 Đồ án tốt nghiệp GVHD : Th.S Hoàng Văn Trung Kết phân tích cụ thể nhƣ sau: Bảng 11: Hàm lượng axit amin có mẫu nấm TT 10 11 12 13 14 15 16 17 Axit amin Asp Glu Ser His Gly Thr Ala Arg Tyr Cys – ss – Cys Val Met Ile Phe Leu Lys Pro Nấm lỗ KPH 751.2615 196.6802 1.4886 26.7678 319.4663 289.0969 363.312 114.6898 275.2771 249.5163 109.5465 380.5798 317.7931 276.7115 378.5686 01 KPH 341.2080 13.0770 192.6853 148.6462 197.4108 47.1110 178.6778 88.1634 31.5096 151.9303 KPH 97.8036 160.0275 229.5222 621 46.9857 56.3033 27.8842 KPH 57.4663 34.6435 118.0815 26.6526 8.4304 72.6428 24.1760 43.4955 40.1744 22.2989 88.2795 HKG 401 119.1522 213.0847 58.5369 19.283 80.2328 51.1094 65.2164 98.8853 25.3519 88.4769 55.2976 12.7539 KPH 98.6485 74.9809 70.2063 117.7930 608 276.2877 398.7024 114.6333 KPH 213.5576 123.5347 226.8908 190.0863 116.6080 296.1869 KPH 119.8434 103.8448 272.4343 253.3374 324.9544 146.4243 02 112.0883 209.814 55.9888 19.9784 63.0291 50.3355 116.264 86.0780 27.6856 75.8754 54.8260 13.3675 KPH 96.6563 74.4710 56.9954 134.0986 619 274.1999 533.964 113.4935 34.9985 181.3566 110.3236 226.7254 212.5792 87.8081 271.7423 139.1503 64.4078 3.4050 346.0226 187.3459 253.3170 135.1953 HKG 406 298.3277 450.9439 126.1812 51.2003 235.10707 156.9827 248.6685 271.1044 222.2114 637.38244 200.3547 156.9467 39.1907 630.4908 315.3618 602.31 163.5509 18 Tổng 6658.5046 1877.7727 667.5146 1249.0097 2977.3263 1247.911 2881.184 4806.3151 Lớp 50K- Hóa thực phẩm 61 Đồ án tốt nghiệp GVHD : Th.S Hoàng Văn Trung  Sắc đồ axit amin mẫu nấm : Hình 28: Sắc đồ axit amin nấm 02 Hình 29: Sắc đồ axit amin nấm 608 GVHD: Th.s Hoàng Văn Trung 62 Đồ án tốt nghiệp GVHD : Th.S Hoàng Văn Trung Hình 30: Sắc đồ axit amin nấm 619 Hình31 : Sắc đồ axit amin nấm 621 GVHD: Th.s Hoàng Văn Trung 63 Đồ án tốt nghiệp GVHD : Th.S Hồng Văn Trung Hình 32: Sắc đồ axit amin nấm HKG401 Hình 33: Sắc đồ axit amin nấm HKG406 GVHD: Th.s Hoàng Văn Trung 64 Đồ án tốt nghiệp GVHD : Th.S Hoàng Văn Trung KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Sau hoàn thành khóa luận, chúng tơi thu đƣợc kết sau : - Tối ƣu hóa số điều kiện quy trình thủy phân xác định hàm lƣợng axit amin nấm : + Thời gian thủy phân mẫu tối ƣu 24h + Nồng độ HCl thủy phân tối ƣu 6M - Xác định đƣợc giới hạn phát LOD giới hạn định lƣợng LOQ, cụ thể nhƣ sau : TT Acid amin LOD(pmol) LOQ(pmol) Asp 0,0270 0,0900 Glu 0,0250 0,0830 Ser 0,0156 0,0520 His 0,0240 0,0800 Gly 0,0214 0,0713 Thr 0,0207 0,0690 Ala 0,0219 0,0730 Arg 0,0158 0,0526 Tyr 0,0198 0,0660 10 Cys-SS-Cys 0,0455 0,1516 11 Val 0,0513 0,0510 12 Met 0,0146 0,0480 13 Phe 0,0183 0,0610 14 Ile 0,0159 0,0530 15 Leu 0,0155 0,0516 16 Lys 0,0460 0,1530 17 Pro 0,0285 0,0950 GVHD: Th.s Hoàng Văn Trung 65 Đồ án tốt nghiệp GVHD : Th.S Hoàng Văn Trung - Xác định đƣợc hiệu suất thu hồi phƣơng pháp - Đã xây dựng đƣợc phƣơng trình đƣờng chuẩn 17 loại axit amin - Phát thấy hàm lƣợng 17 loại axit amin có 7/8 loại axit amin thiết yếu cần thiết cho ngƣời lớn - Hàm lƣợng axit amin tƣơng đối lớn Tổng hàm lƣợng axit amin mẫu nấm nhƣ sau : Nấm lỗ : 6658.5046 μg/g Mẫu nấm 01 : 1877.7727 μg/g Mẫu nấm 02: 1247.911 μg/g Mẫu nấm 621 : 667.5146 μg/g Mẫu nấm HKG 401 : 1249.0097 μg/g Mẫu nấm HKG 406 : 4806.3151 μg/g Mẫu nấm 608 : 2977.3263 μg/g Mẫu nấm 619 : 2881.184 μg/g Kiến nghị Do điều kiện phân tích khơng cho phép nên chúng tơi khơng thể tiến hành phân tích hàm lƣợng axit amin phƣơng pháp phân tích khác nhƣ tiến hành phân tích mẫu khơ Mong muốn đƣợc tiếp tục nghiên cứu đánh giá thành phần axit amin nhiều loại nấm khác để khẳng định đƣợc giá trị loại nấm số thực phẩm khác Nếu có thể, chúng tơi mong muốn đƣợc chạy thử dẫn xuất AQC PITC GVHD: Th.s Hoàng Văn Trung 66 Đồ án tốt nghiệp GVHD : Th.S Hoàng Văn Trung TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt [1] Hà Huy Khôi (2004), Những đường biên dinh dưỡng học, Nhà xuất y học, tr 28-54 [2] Nguyễn Trung Nhuần, Phạm Thị Thu (2002), Bách khoa dinh dưỡng, Nhà xuất phụ nữ Hà Nội, tr 28 – 52 [3] Phạm Luận (1999), Cơ sở lý thuyết sắc ký lỏng hiệu cao, Khoa hóa học, Trƣờng Đại học Tổng hợp Hà Nội [4] Nguyễn Hữu Nhân, Dinh dưỡng học, Nhà xuất Nông nghiệp, tr 44 – 49 [5] Lê Ngọc Tú, Hóa sinh cơng nghiệp, Nhà xuất Khoa Học Kỹ Thuật, 92 – 124 [6] Nguyễn Quang Vinh (2004), Thực tập hóa sinh học, Nhà xuất Đại học Quốc gia Hà Nội [7] Nguyễn Đức Lƣơng, Thí Nghiệm cơng nghệ sinh học, Nhà xuất Đại học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh [8] Phạm Văn Sổ, Bùi Thị Nhƣ Thuận (1978), Kiểm nghiệm lương thực thực phẩm, Nhà xuất Khoa Học Kỹ Thuật – Hà Nội trang 128 – 183 [9] Trần Bích Lam, Thí nghiệm hóa sinh thực phẩm, Nhà xuất Đại học Quốc Gia TP Hồ Chí Minh [10] Hồng Kim Anh, Hóa học thực phẩm (2006), Nhà xuất Khoa Học Kỹ Thuật, tr 31 – 119 [11] Nguyễn Lân Dũng, 2002 Công nghệ nuôi trồng nấm - tập 1,2 Nhà xuất Nông nghiệp Hà Nội [12] Lê Duy Thắng (1999) Kĩ thuật trồng nấm – Tập 1: Nuôi trồng số nấm ăn thông dụng Việt Nam Nhà xuất Nông nghiệp, TP.HCM [13] Đào Hữu Vinh, Nguyễn Xuân Dũng cộng (1985) Các phương pháp sắc ký Nhà xuất Khoa Học Kỹ Thuật Tiếng Anh [14] Kenneth J Carpenter (1994), protein and energy, Cambridge university press, pp 119 – 17 GVHD: Th.s Hoàng Văn Trung 67 Đồ án tốt nghiệp GVHD : Th.S Hoàng Văn Trung [15] Moore, S Stein, W.H (1948), Phorimatric ninhydrin method for use in the chromatography of amino acid, journal of Biological Chemistry 176, pp 367 – 388 [16] Moore, S Stein, W.H (1948), A modified ninhydrin reagent for the photometric determinanation of amino acid and related compounds, journal of Biological Chemistry 211, pp 907 – 913 [17] Judy A White and R J Hart, HPLC Analysis of aminoacid, pp 75 – 115 [18] I Molnar-Per (2000), Role of chromatography in the analysix of sugar, carboxylic acids and amino acid in food, Journal of Chromatography A, 891, pp.1 – 32 [19] Alexander, R.R., Griffiths, J.M., Wilkinson, M.L., (1985) Indentification of amino acids by thin-layer chromatography In: Basic Biochemical Methods Wiley, Newyork, pp 24-28 [20] Bailey, J.L., (1962), Estimation of amino acids by ninhydrin In: Techniques in protein chemistry Elsevier, Amsterdam, pp 73-81 [21] Brewer, J.M., Roberts, C.W., Stimson, W.H., Alexander, J., (1995), Accurate Determination of Adjuvant-Associated protein or peptide by Ninhydrin Assay, vol 13 Butterworth-Heminemann, Stoneham, MA (pp 1441-1444) [22] Constantinos K Zacharis, Georgios A Theodoridis, Anastasios N Voulgaropoulos, (2005), Coupling of sequential injection with liquid chromatography for the automated derivatization and on-line determination of amino acids, Talanta 68, pp 448-458 [23] Fini C., Floridi A., Fnelli V.N., & et (1990), Amino acid analysis and protein sequencing, Laboratory methodology in Biochemistry [24] Jose L Penalvo, Tarja Nurmi, Herman Adlercreutz (2004), A simplified HPLC method for total isoflavons in soy products Food chemistry 87: p 297-305 [25] Moore, S., (1968), Amino acid analysis; aqueous dimethyl sulfoxide as solvent for the ninhydrin reaction Journal of Biological Chemistry 243, 6281-6283 [26] Fisher, G.H., Arias, I., Quesada, I., D’Aniello, S., Errico, F., Di Fiore, MM., D’Aniello, A., (2001) A fast and sensitive mathod for measuring picomole levels of total free amino acids in very small amounts of biological tissues Amino acids 20, 163-173 [27] Fountoulakis M., Lahm H, -W, (1998), Hydrolysis and aminoacid composition analysis of protein, Journal of chromatography A, 826, p 109 GVHD: Th.s Hoàng Văn Trung 68 Đồ án tốt nghiệp GVHD : Th.S Hoàng Văn Trung [28] Fruchter, R.G., Crestfield, A.M., (1965), Preparation and properties of two active forms of ribonuclease dimer, Journal of Biological Chemistry 240, 3868-3874 [29] H.C Hsieh, T.H Kao, B.H Chen (2004) A fast HPLC method for analysis of issoflavones in soybean Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies, Volume 27, issue 2, p 315-324 Trang web 30 http://vi.wikipedia.org/wiki/Protein 31 http://www.voer.edu.vn/m/07c9b2d0 32 http://tailieu.vn/xem-tai-lieu/phan-loai-cac-acid-amin.280102.html 33 http://www.doko.vn/luan-van/sinh-tong-hop-axit-amin-245618 34 http://www.ebook.edu.vn/?page=1.18&view=6449 GVHD: Th.s Hoàng Văn Trung 69 ... phƣơng pháp phân tích có tốc độ nhanh hiệu suất cao Xuất phát từ thực tế đó, chúng tơi lựa chọn đề tài nghiên cứu : ? ?Xác định hàm lượng tổng axit amin số lồi nấm ni cấy phương pháp sắc kí lỏng hiệu. .. amin` Nhƣợc điểm phƣơng pháp xác định axit amin protein đề cập xác định đƣợc tổng số nitơ mà xác định đƣợc riêng rẽ axit amin Để khắc phục nhƣợc điểm phải tách chất nhóm axit amin trƣớc xác định. .. 62 Hình 30: Sắc đồ axit amin nấm 619 63 Hình31 : Sắc đồ axit amin nấm 621 63 Hình 32: Sắc đồ axit amin nấm HKG401 64 Hình 33: Sắc đồ axit amin nấm HKG406 64