Nghiên cứu phương pháp định lượng diltiazem trong huyết tương người bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC MS)

Một sốdoanh nghiệp dược trong nước đã và đang nghiên cứu sản xuất dạng bào chếphóng thích biến đổi có chứa hoạt chất này, do vậy nhu cầu nghiên cứu vềSKD, TĐSH đối với DTZ là điều cần th

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay cùng với sự phát triển của ngành công nghiệp dược thì lĩnhvực đánh giá kiểm tra chất lượng thuốc có một vai trò rất quan trọng Theoquan điểm sinh dược học đánh giá chất lượng thuốc không chỉ thông qua cácchỉ tiêu hoá lý thông thường như định tính, định lượng, độ rã, độ hoà tan …như quy định trong dược điển mà phải bằng đánh giá sinh khả dụng (SKD)vàtương đương sinh học (TĐSH) [6] Nghiên cứu đánh giá SKD và TĐSH đãđược các doanh nghiệp dược Việt Nam quan tâm trong vài năm gần đây Nhờ

đó, các nhà sản xuất có thể lựa chọn công thức, kỹ thuật bào chế tối ưu để tạo

ra các sản phẩm có chất lượng tương đương với thuốc phát minh Đồng thời,các nghiên cứu này còn cung cấp thêm bằng chứng chất lượng làm cơ sở chobác sỹ lựa chọn thuốc thay thế hoặc điều chỉnh liều trong thực hành lâm sàng

Trên thế giới, các nước có nền công nghiệp dược phát triển và một sốnước trong khu vực đã qui định danh mục các loại chế phẩm cần phải xem xétkết quả nghiên cứu SKD và TĐSH khi cấp phép lưu hành thuốc [17,29] Hầuhết các thuốc có khoảng điều trị hẹp, có dược động học bất thường, thuốcphóng thích chậm, thuốc tim mạch đều thuộc nhóm nằm trong danh mục bắtbuộc phải nghiên cứu Trước xu thế hội nhập và nhu cầu nâng cao chất lượngđiều trị, Bộ Y tế đã ban hành thông tư 08/2010/TT-BYT, ngày 26/4/2010 về

việc Hướng dẫn báo cáo số liệu nghiên cứu sinh khả dụng/ tương đương sinh học trong đăng ký thuốc Tại thông tư này, Bộ Y tế đã đưa ra nguyên tắc lựa

chọn dược chất đưa vào danh mục bắt buộc phải nghiên cứu SKD hoặc TĐSHgồm cỏc nhóm thuốc ưu tiên: thuốc tim mạch, chống co giật, kháng sinh…Đồng thời, thông tư này cũng qui định giới hạn với (1) các thuốc generic ởdạng bào chế quy ước có chứa 12 dược chất trong danh mục và (2) nhữngthuốc bào chế ở dạng phóng thích biến đổi

Dilitiazem (DTZ) là một thuốc tim mạch có tác dụng chẹn kênh calciđược sử dụng rộng rãi trong điều trị dự phòng các cơn đau thắt ngực, một loại

bệnh có tỷ lệ ngày càng tăng ở Việt Nam Trên thị trường hiện nay hoạt chấtnày được bào chế ở cả 2 dạng thuốc qui ước và phóng thích biến đổi Một sốdoanh nghiệp dược trong nước đã và đang nghiên cứu sản xuất dạng bào chếphóng thích biến đổi có chứa hoạt chất này, do vậy nhu cầu nghiên cứu vềSKD, TĐSH đối với DTZ là điều cần thiết và xuất phát từ thực tế.

Để thực hiện được các nghiên cứu đánh giá SKD và TĐSH các thuốcnói chung và DTZ núi riêng, một trong những nội dung quan trọng đầu tiên làxây dựng qui trình kỹ thuật chiết tách, xử lý mẫu và phân tích định lượngthuốc trong dịch sinh học (máu, huyết tương, nước tiểu,…) Quá trình phântích thuốc trong dịch sinh học thường gặp nhiều khó khăn do nồng độ thuốctrong mẫu thường rất thấp; mẫu có nhiều thành phần tạp chất gây ảnh hưởngtới quá trình phân tích thuốc Hơn nữa, sau khi vào cơ thể dược chất bịchuyển hoá tạo thành nhiều dẫn chất khác nhau, có cấu trúc và tính chất hoá

lý tương tự với dược chất nên việc phân tách để định lượng gặp nhiều khókhăn Chính vì vậy, phương pháp phân tích phải được thẩm định chặt chẽ theonhững qui định riêng, để đảm bảo kết quả thử nghiệm chính xác và tin cậy

Hệ thống phân tích LC/MS/MS ra đời là bước nhảy vọt về kỹ thuậtphân tích, tạo điều kiện cho các nhà khoa học dược thực hiện được các nghiêncứu sinh khả dụng phức tạp Với ưu điểm vượt trội về độ nhạy và tính đặchiệu cao, kỹ thuật phân tích này ngày càng được áp dụng nhiều trong nghiêncứu các chế phẩm có hàm lượng thấp Tuy nhiên, ở Việt Nam kỹ thuật nàycòn rất mới mẻ và khả năng ứng dụng còn hạn chế

Vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu phương pháp định lượng Diltiazem trong huyết tương người bằng sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS)” với các mục tiêu sau:

1 Nghiên cứu xây dựng quy trình xử lý mẫu và định lượng DTZ trong huyếttương người bằng LC-MS

2 Thẩm định phương pháp phân tích đã xây dựng

PHẦN 1 TỔNG QUAN1.1 TỔNG QUAN VỀ DILTIAZEM

1.1.1 Đặc điểm cấu tạo và tính chất hóa lý [24,28]

a Công thức cấu tạo

- Công thức phân tử: C22H26N2O4S HCl

- Khối lượng phân tử: 450.98 g/mol

- Tên khoa học: (dimethylamino)ethyl]-2,3-dihydro-2-(4-methoxyphenyl),

1,5-Benzothiazepin-4(5H)-one,3-(acetyloxy)-5-[2-monohydrochloride,

b Tính chất vật lý, hóa học:

- Bột kết tinh hoặc tinh thể nhỏ màu trắng, không mùi

- Nhiệt độ nóng chảy: Từ 207,50 C đến 212,00 C

- Hệ số phân bố: Log P(octanol/nước) = 2,79

- Dạng muối tan tốt trong nước, và acid formic, it tan trong ethanol, khôngtan trong ether Dạng base tan tốt trong cloroform, ether Do đó khi chiếtDTZ trong huyết tương bằng phương pháp chiết lỏng – lỏng nên kiềm hóa

để chuyển sang dạng base rồi chiết bằng dung môi hữu cơ không phân cựcnhư cloroform, diclormethan, diethyl ether, n-hexan…

- Dạng dược dụng thường kết hợp với 1 phân tử acid hydrocloric nên có thểđịnh lượng DTZ theo phương pháp chuẩn độ bạc nitrat

- Phổ hấp thụ UV-Vis: Đỉnh hấp thụ trong dung dịch acid H2SO4 0,2M là

236 nm, trong dung dịch kiềm là 237 nm Do đó với dạng nguyên liệu vàchế phẩm có thể định lượng bằng cách đo trực tiếp phổ hấp thụ UV hoặcHPLC với detector UV

và làm chậm dẫn truyền nút nhĩ thất Thuốc được sử dụng trong điều trị đauthắt ngực và tăng huyết áp

b Dược động học [16,23,25,26]:

- Thuốc được hấp thu nhanh theo đường tiêu hóa, không bị ảnh hưởngbởi thức ăn Trong thực tế bệnh nhân thường được khuyờn dựng ngay trướcbữa ăn để trỏnh quờn thuốc Thuốc bị chuyển hóa qua gan lần đầu, tạo thànhnhiều chất chuyển hóa khác nhau Tỷ lệ thuốc liên kết với protein cao(khoảng 80 - 85%) Vì vậy khi dùng liều duy nhất 60 mg DTZ, nồng độ thuốctrong huyết tương đạt cực đại khoảng 200 ng/ml Thể tích phân bố biểu kiến

từ 3 đến 8 l/kg, đào thải chủ yếu qua phân, chỉ có khoảng 2 – 4 % đào thảidạng không biến đổi qua nước tiểu Thời gian bán thải khoảng 3 - 8 giờ

- Sản phẩm chuyển hóa bao gồm:

o Deacetyl diltiazem(1)

o N mono demethyl diltiazem(2)

o Deacetyl-N-monodemethyl diltiazem(3)

o Deacetyl diltiazemN-oxid(4)

o Deacetyl O-demethyl diltiazem(5)

o Deacetyl N,O-didemethyl diltiazem(6)

- Khi xây dựng phương pháp phân tích DTZ trong dịch sinh học phươngpháp cần có giới hạn định lượng dưới khoảng 7 - 10 ng/ml (1/20 đến 1/30

Cmax) để đảm bảo AUCt > 80% AUC∞

c Chỉ định và cách dùng [3,4,5]

 Liều thông thường: Uống 60 mg, 3 lần một ngày ngay trước khi ăn

 Ðiều trị đau thắt ngực: Uống 60 mg diltiazem, 3 lần một ngày; hoặckhởi đầu bằng liều 30 mg, 4 lần một ngày, tăng liều khi cần thiết trongkhoảng 1 - 2 ngày sau Ðối với người bệnh bị đau thắt ngực không ổn định, cóthể dựng viờn giải phóng chậm với liều từ 360 - 480 mg hàng ngày

 Ðiều trị tăng huyết áp: Dựng viờn nộn hoặc nang giải phóng chậm vớiliều ban đầu khoảng 60 - 120 mg, 2 lần một ngày; cứ 14 ngày một lần, có thểtăng liều nếu cần thiết tới liều tối đa mỗi ngày là 360 mg

d Lưu ý khác khi dùng thuốc [21]

- Tác dụng phụ : Thuốc có thể gây khó chịu ít nhiều ở một số người bệnh

Khoảng 30% người bệnh dùng thuốc được ghi nhận gặp tác dụng không mong muốn liên quan đến khả năng gây giãn mạch của diltiazem Những

1.1.3 Một số phương pháp định lượng DTZ trong dịch sinh học

Đặc thù của phân tích thuốc trong dịch sinh học là phức tạp, lẫn nhiềutap chất, nồng độ hoạt chất thấp và số lượng mẫu cần phân tích nhiều nên đòihỏi những yêu cầu cơ bản sau:

- Tính đặc hiệu cao: phân biệt được DTZ với các tạp chất lẫn trong mẫu,đặc biệt là chất chuyển hóa có công thức tương tự

- Độ nhạy cao: nồng độ thuốc trong dịch sinh học thường rất thấp, đòihỏi phương pháp phải có độ nhạy cao

 Thời gian phân tích mẫu càng ngắn càng tốt: số lượng mẫu phân tíchtrong đánh giá TĐSH rất nhiều, nếu thời gian phân tích kéo dài có thể ảnhhưởng tới kết quả phân tích

Một số phương pháp phân tích DTZ trong dịch sinh học được tổng hợp ở bảng 1.1 :

Bảng 1.1: Một số phương pháp phân tích DTZ trong huyết tương

phân tích

Thời gian phân tích mẫu (phút)

LLOQ (ng/ml)

1 [12] Kết tủa protein bằng acetonitrile LC – MS/MS

(LC/MS/MS)

5 [19]

Chiết lỏng – lỏng bằng hexane – chloroform - isopropanol

chiết bằng ethyl acetate 254 nm

10 [8] Kiềm hóa rồi chiết lỏng – lỏng

bằng ter-butyl methyl ether

để triển khai đánh giá SKD và TĐSH

- PP 2: Định lượng được DTZ bằng HPLC với detector UV ở bước sóng

215 nm, PP này có ưu điểm là thiết bị phổ biến có thể áp dụng được ở nhiềulabo phân tích Tuy nhiên, nhược điểm là thời gian phân tích mẫu dài (15phút), giới hạn định lượng 20 ng/ml > 1/10 Cmax và phương pháp xử lý mẫubằng chiết pha rắn với chi phí lớn không phù hợp để triển khai đánh giá SKD

và TĐSH

- PP 3: Định lượng đồng thời DTZ và các chất chuyển hóa chính của nó sửdụng detector UV ở bước sóng 238 nm, tuy nhiên phương pháp xử lý mẫubằng chiết pha rắn khá tốn kém, thời gian phân tích mẫu lại quá dài (15 phút)

- PP 4: Sử dụng detector khối phổ với kỹ thuật xử lý mẫu bằng chiết lỏng– lỏng, giới hạn định lượng đạt yêu cầu và thời gian phân tích ngắn Tuynhiên phương pháp này có hiệu suất chiết thấp (50.4-58.8%) và không ổnđịnh

- PP 5: Sử dụng detector UV ở bước sóng 239 nm và phương pháp xử lýmẫu đơn giản bằng chiết lỏng – lỏng, PP này có giới hạn định lượng phù hợp(3 ng/ml) nhưng nhược điểm là thời gian phân tích mẫu quá dài (12 phút)

- PP 6: Sử dụng detector UV, PP này định lượng được đồng thời DTZ và 6chất chuyển hóa của nó, giới hạn định lượng dưới phù hợp (3 ng/ml) nhưngthời gian phân tích mẫu quá dài (15 phút) và phương pháp xử lý mẫu bằngchiết lỏng – lỏng qua 2 giai đoạn gây nhiều sai số

- PP 7: Sử dụng detector huỳnh quang, PP này có giới hạn định lượng phùhợp (2 ng/ml), thời gian phân tích mẫu không quá dài (9 phỳt).Tuy nhiờn doDTZ không phát huỳnh quang trực tiếp nên phải thực hiện phản ứng tạo dẫnchất phát huỳnh quang, điều này tốn thời gian và phức tạp dễ gây sai số

- PP 8: Sử dụng detector khối phổ, PP này định lượng được đồng thờiDTZ và các chất chuyển hóa, giới hạn định lượng dưới thấp (1 ng/ml), thờigian phân tích mẫu không quá dài (3 phút) Tuy nhiên phương pháp xử lýmẫu bằng chiết pha rắn tốn kém nờn khú ứng dụng thực tế

- PP 9: Sử dụng detector UV ở bước sóng 254 nm với phương pháp xử lýmẫu bằng chiết lỏng – lỏng, nhược điểm của PP này là giới hạn định lượngkhông phù hợp (10 ng/ml) và thời gian phân tích mẫu quá dài (14 phút)

- PP10: Sử dụng detector UV ở bước sóng 240 nm với phương pháp xử lýmẫu đơn giản bằng chiết lỏng – lỏng, PP này có giới hạn định lượng phù hợp(1 ng/ml) nhưng thời gian phân tích mẫu lại quá dài (15 phút)

1.2 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP LC/MS [10,11]

1.2.1 Khái niệm

Sắc ký lỏng khối phổ là kỹ thuật phân tích có sự kết hợp khả năngphân tách các chất trong hỗn hợp của bộ phận sắc ký lỏng hiệu năng cao

(High performance liquid chromatography - HPLC) và khả năng phân tích

số khối (m/z) của bộ phận khối phổ (Mass spectrometry - MS)

1.2.2 Phân loại

Dựa vào máy phân tích khối phổ (Mass analyser), hệ thống LC/MS có 3

loại cơ bản:

- Tứ cực (Quadrupole): có 4 thanh tích điện đặt song song, 2 thanh đối nhau

có điện tích bằng nhau Các ion phù hợp với tần số quét sẽ đi thẳng tớidetector, những ion khác bị phá hủy do bị va đập vào tứ cực

- Bẫy ion (Ion trap): tất cả các ion di chuyển theo hình xoắn ốc, khi tần số

quét RF thay đổi thì lựa chọn được ion phù hợp đi vào các lỗ nhỏ (bẫy

ion)

- Ống đo thời gian bay (Time-of-flight tube): các ion có số khối khác nhau

sẽ có thời gian bay khác nhau, các ion được phân tách theo thời gian bay.Việc kết hợp 2 hay nhiều loại trên với nhau tạo thành hệ thống MS/MSnhư: triple-quadrupole hoặc tandem mass spectrometer, Q-Tof,… Hệ thốngMS/MS phân tích được các ion phân mảnh, rất có ý nghĩa trong định danhchất để xác định cấu trúc nâng cao khả năng phân tích định tính, định lượng

1.2.3 Cấu tạo

Thành phần cơ bản của hệ thống LC/MS (Hình 1.1) gồm: hệ thốngHPLC, máy MS và mặt phân giới ion hóa (trung gian gữa LC và MS)

1.2.3.1 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Tương tự như hệ thống HPLC thông thường, có vai trò phân tách các chất dựavào tính chất lý hóa của chúng Hệ thống HPLC bao gồm: Bình chứa phađộng, bơm cao áp, tiêm mẫu, cột phân tích và detector, tuy nhiên hệ thốngHPLC của thiết bị LC – MS có một số đặc điểm khác:

- Pha động có thể là dung môi hữu cơ hoặc đệm Nếu pha động là đệmthì thường là đệm có khả năng bay hơi như amoniacetat, formic…

- Pha động khi ra khỏi cột phân tích thường qua bộ phận chia dòng đểchỉ có một lượng nhất định (< 50 àl/phỳt) vào MS, tránh lượng dung môiquá nhiều vào MS gây bẩn và hỏng máy

- Detector: có thể coi MS là một detector, tuy nhiên có thể nối thờm cỏcdetector khác như UV, FR… để hỗ trợ trong phân tích

1.2.3.2 Mặt phân giới ion hóa (Ionization Interface)

Mặt phân giới ion hóa nằm giữa HPLC và MS có vai trò:

- Loại bỏ dung môi pha động không cho vào MS: các chất không ionhoá bị làm chệch hướng ra ngoài không qua được lỗ nhỏ vào MS, hoặc

sử dụng khí chắn để đuổi dung môi

Hình 1.1 Mô hình hệ thống LC/MS

âm để đi vào MS Có 2 kiểu tạo ion phổ biến:

+ Ion hóa bằng dòng điện tử (electron spray ionization – ESI): ápdụng cho chất các phân cực mạnh hoặc các chất tồn tại ở dạng ion.+ Ion hóa bằng dòng ion (ion spray ionaziation – ISI) còn được gọivới tờn khỏc ion hóa hóa học (atmospheric-pressure chemicalionization - APCI): áp dụng cho các chất ít phân cực hơn

1.2.3.3 Khối phổ (MS)

* Bơm chân không

Các ion được tạo ra ở mặt phân giới khi vào trong máy phân tích MS

sẽ không thể tồn tại được nếu va đập với các phân tử không khí Vì vậy yêucầu đầu tiên để vận hành máy MS là phải đạt môi trường chân không cao

Có 2 loại bơm tạo chân không:

- Bơm dầu: tạo áp suất chân không ban đầu 1,4 torr ở mặt phângiới và 10-4 torr ở bộ phận dẫn đường ion Trong trường hợp máy đang chạy

mà mất điện đột ngột thì dầu có thể tràn vào buồng chân không gây bẩn,hỏng thiết bị

- Bơm tua – bin: gồm hệ thống nhiều bơm phân tử tua - bin đượckết nối để tạo ra mức chân không cao hơn 10-6 Các bơm tua - bin có nhiềuvan được đặt trên một trục quay ở tốc độ cao Các van này loại bỏ khôngkhí từ buồng chân không và hút không khí ra khỏi bơm Bơm này có ưuđiểm là không làm bẩn máy, nhưng tuổi thọ kém

* Máy phân tích khối và detector ion.

Mẫu sau khi bị ion hoá được hướng tới máy phân tích MS, các kiểu iontương tự nhau được tập trung lại thành dũng (Hỡnh 1.2)

Bề mặt tích điện trực tiếp (The direct-current dc) của máy phân tíchđược quét với các tần số tín hiệu (radio-frequency RF), mỗi tần số quét lựachọn những ion có số khối khác nhau, cho phép chúng đi theo đường ổn địnhtới detector Các ion ổn định tại mỗi tần số được tống ra để đập vào detectorion, ở đây các ion được đếm về số lượng tạo ra tín hiệu rồi chuyển đến máytính Những ion không được lựa chọn sẽ bị loại bỏ trong quá trình di chuyển.

Khi hạt mang điện đập vào bề mặt màng detector làm cho mặt bên kiacủa detector giải phóng electron Các electron này tới đập vào thành củadetector làm giải phóng nhiều electron hơn sau mỗi lần va đập Từng đợt vađập electron làm tăng cường tín hiệu rồi được chuyển về hệ thống dữ liệu(Hình 1.3)

Hình 1.3 Bộ phận phát hiện ion

Hình 1.2 Dòng ion

Máy phân tích MS/MS thường kết hợp 2 máy phân tích MS có tế bào

va đập (a collision cell) Ion đích được lựa chọn từ máy phân tích MS đầu tiênđược phép va đập với phân tử khí trơ để kích thích phân mảnh Sau đó các ionmảnh đi vào trong máy phân tích MS thứ 2 để phân tách và xác định (Hình1.4)

* Dữ liệu và hệ thống kiểm soát

Hệ thống dữ liệu ghi nhận tất cả các thông tin về phổ từ sắc ký đồ chạy ởdạng khối dữ liệu 3 chiều (Hình 1.5)

Hệ thống dữ liệu cho ta 2 loại sắc ký đồ:

+ Sắc ký đồ chiều ion, hoặc sắc ký đồ ion tổng (TIC; Hình 1.6 a) là

đồ thị tổng của cường độ tất cả các ion đối với thời gian

+ Sắc ký đồ biểu diễn cường độ tín hiệu – m/z tại một thời điểm đã

Hình 1.4: Hệ thống MS/MS Triple-quadrupole

Hình 1.5 Hệ thống ghi dữ liệu

cho (Hình 1.6 b) Với hệ thống phân giới IS, đây sẽ là khối lượng đơn lẻ

của ion phân tử

Để chạy sắc ký đồ một mẫu chưa biết ta đặt máy đo MS theo phươngthức quét để thu nhận được dữ liệu từ dải tần số dc/RF đủ rộng để baophủ toàn bộ dải giá trị m/z mong muốn đồng thời loại bỏ được khí vàdung môi

1.2.4 Ứng dụng

LC/MS được ứng dụng trong các lĩnh vực:

- Nghiên cứu hợp chất mới, đặc biệt nghiên cứu phát triển thuốc

- Nghiên cứu xác định hợp chất sinh học phức tạp, định danhprotein

- Nghiên cứu tồn dư chất bảo vệ thực vật và hormon tăng trưởng

- Phân tích thuốc trong dịch sinh học: dược động học, sinh khảdụng, tương đương sinh học, theo dõi điều trị…

Hình 1.6: Sắc ký đồ tổng ion (a) và phổ m/z (b)

(a)

(b)

1.3 PHÂN TÍCH THUỐC TRONG DỊCH SINH HỌC [17]

1.3.1 Các phương pháp chiết tách thuốc trong huyết tương[1,17]:

Mẫu thuốc trong huyết tương phải được chiết tách trước khi đưa vàothiết bị phân tích Có 3 phương pháp chính được dùng để chiết tách hoạt chất

ra khỏi dịch sinh học:

a Phương pháp chiết pha rắn (SPE) :

- Nguyên tắc: Là phương pháp tách riêng chất cần phân tích ra khỏi cáctạp có trong nền mẫu, dựa trên sự khác nhau về ái lực của chất cần phân tích

và các tạp chất đối với pha động (dạng lỏng) và pha tĩnh (dạng rắn) Mẫuđược đưa vào pha tĩnh, dùng dung môI thích hợp để rửa giải tạp chất ra trướctrong khi chất cần phân tích vẫn còn được lưu giữ trên cột hoặc ngược lại Sau

đó rửa giải chất phân tích còn lưu giữ trên cột bằng dung môi thích hợp

- Phương pháp này có ưu điểm là hoạt chất chiết được tinh khiết, chọnlọc, thuận lợi cho các thiết bị phân tích sau đó, tuy nhiên phương pháp này cónhược điểm là tốn kém, khó áp dụng ở quy mô rộng

b Phương pháp kết tủa protein

- Nguyên tắc: sử dụng các tác nhân gây tủa protein (TFA, acidtricloroacetic, acid percloric, MeOH, MeCN) để làm đụng vún protein trongmẫu huyết tương Một số chất phân tích dễ hỏng bởi acid có thể sử dụng kỹthuật chiết kết tủa protein bằng dung môi hữu cơ

- Phương pháp này có ưu điểm là đơn giản dễ tiến hành và chi phí thấp,tuy nhiên nhược điểm của phương pháp này là hoạt chất chiết được có độ tinhkhiết không cao

c Chiết lỏng – lỏng:

- Nguyên tắc sử dụng dung môi hữu cơ không phân cực, không đồng tan vớihuyết tương (ethyl acetat, diethyl ether, cloroform, diclormethan, n-hexan,

cyclohexan…) để chiết tách chất phân tích Khi sử dụng kỹ thuật này cầnchuyển chất phân tích sang dạng tan tốt trong dung môi hữu cơ.

- Phương pháp này có ưu điểm là đơn giản dễ tiến hành và chi phí thấp, tuynhiên nhược điểm của phương pháp này là hiệu suất chiết thấp và hoạt chấtchiết được có độ tinh khiết không cao

Trong thực tế, người ta có thể kết hợp 2 hay nhiều kỹ thuật trên để xử

lý mẫu, đặc biệt với những mẫu mà khi xử lý bằng 1 kỹ thuật không thu đượckết quả mong muốn

1.3.2 Định lượng thuốc trong huyết tương bằng sắc ký lỏng với các loại

detector [10]:

Thuốc sau khi được tách loại tạp khỏi các thành phần của dịch sich học,được tiến hành định lượng bằng các kỹ thuật khác nhau, trong đó một kỹ thuậthay được dùng phổ biến hiện nay là sắc ký lỏng hiệu năng cao Hoạt chất saukhi đi qua cột sắc ký lỏng được đưa đến bộ phận phát hiện, gọi là detector Cónhiều loại detector được ghép nối với thiết bị sắc ký lỏng

1.3.3 Thẩm định phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học [29]:

Với các ứng dụng của phép định lượng thuốc trong dịch sinh học như đó nờu

ở trên, phương pháp phân tích bao gồm quy trình xử lý mẫu và kỹ thuật phântích phải được tiến hành thẩm định đầy đủ trờn cỏc tiêu chí sau:

- Tính chọn lọc, đặc hiệu của phương pháp

PHẦN 2 NGUYÊN VẬT LIỆU - ĐỐI TƯỢNG – NỘI DUNG

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU

2.1.1 Nguyên liệu, hóa chất, dung môi

- Chất chuẩn và nội chuẩn:

+ Diltiazem (DTZ): Chuẩn phòng thí nghiệm – SKS: 060909, hàm lượng99,9%, tính theo nguyên trạng

+ Felodipine (Felo): Chuẩn phòng thí nghiệm; hàm lượng 99,5%(nguyên trạng) Sử dụng làm chất nội chuẩn (IS) trong phương phápphân tích

- Dung môi, hóa chất:

+ MeCN, MeOH, isopropanol, nước cất đạt tiêu chuẩn tinh khiết dùngcho HPLC và LC/MS

+ Các dung môi hóa chất khác như diethylether, cloroform, cyclohexan,dicloromethan, n-hexan, đạt tiêu chuẩn PA

- Huyết tương trắng không có DTZ:

Cung cấp bởi Viện Huyết học và truyền máu trung ương, 06 lô bao gồm:P0906153170 - 3075, P0906113085 - 3082, P0906183211 – 3091

+ Cân phân tích sartorius (d = 0,1mg; e = 0,1mg)

+ Máy ly tâm lạnh Sartorius Sigma 2 – 16K

+ Thiết bị bay hơi dung môi bằng khí ni tơ có gia nhiệt Reacti-Therm III(Thermo scientific).

+ Buret tự động 725 Dosmat (d = 0,001 ml) của Metrohm (Thụy Sỹ).+ Máy lắc xoáy Vortex ZX3 VELP scientifica (3000 vũng/phỳt)

+ Máy lắc GPL 3006 – Đức (300 vũng/phỳt)

+ Tủ lạnh sâu (– 40 0C), Sanyo MDF – 236

+ Micropipet eppendorf 1 – 10 l, 10 – 100 l, 100 – 1000 l

+ Bình định mức, dụng cụ thuỷ tinh (class A) dùng trong phân tích

2.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

- Mẫu trắng: Huyết tương trắng – Viện Huyết học và Truyền máu TW.

- Mẫu chuẩn hay mẫu thử tự tạo: Hoà tan DTZ chuẩn trong huyết tương

trắng với các nồng độ thích hợp

- Mẫu thử: Huyết tương của NTN sau khi uống thuốc DTZ chứng hoặc thử.

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Xây dựng phương pháp phân tích

2.3.1.1 Xây dựng điều kiện khối phổ xác định DTZ và chuẩn nội

* Khảo sát lựa chọn chất chuẩn nội:

Dựa vào công thức hóa học, tính chất lý hóa của các chất để lựa chọn nộichuẩn, để đảm bảo IS được lựa chọn, bền vững, có thể được chiết tỏch cựngchuẩn, đồng thời tạo được mảnh phổ phù hợp khi phân tích cùng DTZ Cácchất dự kiến làm chuẩn nội được pha trong MeOH (500 àg/ml) sau đó phaloãng với MeOH thành dung dịch có nồng độ khoảng 1 àg/ml và bơm trực tiếpvào máy khối phổ TSQ Quantum Ultra để xác định mảnh phổ, tối ưu hóa cùngvới DTZ

* Tối ưu hoá điều kiện khối phổ xác định DTZ và nội chuẩn:

Tối ưu hóa điều kiện khối phổ sử dụng nguồn ion hóa kiểu phun điện tử (ESI – Electrospray ions) với các nội dung:

- Tối ưu hóa quá trình chuyển dòng dung môi pha động sang trạng tháikhí.

- Tối ưu điều kiện ion hóa chất cần phân tích để có được lượng ion nhiều

và ổn định

- Tối ưu hóa điện thế của các điện cực trong dectector khối phổ để cóđược dòng ion của chất cần phân tích đi đến bộ phận phát hiện nhiều nhất vàsạch nhất

- Lựa chọn mảnh phổ thích hợp cho cho chuẩn và nội chuẩn để địnhlượng

2.3.1.2 Xây dựng điều kiện sắc ký

Qua nghiên cứu tài liệu tham khảo, tiến hành khảo sát điều kiện sắc ký trên

thiết bị LC-MS/MS (TSQ Quantum Ultra – Thermo Scientific) sử dụng cột

pha đảo C18 (50 x 3 mm; 2,1 àm) và pha động chứa các thành phần MeOH,đệm amoni acetat 2 mM với các tỷ lệ khác nhau

Từ kết quả khảo sát, lựa chọn những điều kiện sắc ký thích hợp để có thể tiếnhành định lượng DTZ trong huyết tương NTN bằng phương pháp HPLC vớidetector MS

2.3.1.3 Khảo sát qui trình xử lý mẫu, đánh giá ảnh hưởng của nền mẫu

Dựa vào các tài liệu tham khảo, tiến hành khảo sát phương pháp xử lý mẫu,chiết tách DTZ từ huyết tương trờn cỏc mẫu chuẩn DTZ hoà tan trong phađộng; mẫu huyết tương trắng và các mẫu chuẩn DTZ hoà tan trong huyếttương trắng có nồng độ khoảng 100 ng/ml xấp xỉ bằng nồng độ cực đại tronghuyết tương (Cmax), khi sử dụng liều đơn Diltiazem 60 mg, bằng các phươngpháp như:

- Tủa protein với các tác nhân gây tủa có thể là acid (percloric,tricloracetic, trifluoracetic), hoặc dung môi (MeOH, MeCN)

- Kiềm hóa huyết tương để chuyển DTZ sang dạng base, sau đó tiếnhành chiết lỏng - lỏng bằng các dung môi như diethyl ether, cloroform hayhỗn hợp diethyl ether – cloroform.

Từ kết quả thực nghiệm, lựa chọn phương pháp xử lý mẫu phù hợp vừa đơngiản, dễ thực hiện vừa có tỷ lệ thu hồi hoạt chất và nội chuẩn cao đồng thờinền mẫu không ảnh hưởng hoặc ảnh hưởng < 15% đến tín hiệu cường độ ionhoạt chất và nội chuẩn của detector khối phổ

2.3.2 Thẩm định phương pháp phân tích

Thẩm định phương pháp phân tích đã lựa chọn sau khi tiến hành khảo sát,theo các chỉ tiêu qui định của dược điển và hướng dẫn về thẩm định phươngpháp phân tích trong dịch sinh học để đảm bảo phương pháp nghiên cứu làphù hợp

Tiến hành thẩm định trên mẫu huyết tương trắng, mẫu chuẩn và mẫu kiểm tra

(quality control sample - QC) tự tạo.

* Chuẩn bị mẫu chuẩn tự tạo:

- Hòa tan chất chuẩn DTZ trong MeOH để thu được dung dịch chuẩn gốc cónồng độ DTZ chính xác khoảng 250 g/mL Từ đó pha thành các nồng độ dựkiến 5 – 500 ng/ml trong huyết tương

- Pha loãng 1 thể tích xác định dung dịch chuõ̉n gụ́c với một lượng nước cấtvừa đủ để thu được dung dịch chuẩn làm việc (S-W8) có nồng độ DTZ chínhxác khoảng 5000 ng/mL

Bảng 2.1. Chuẩn bị các dung dịch chuẩn làm việc DTZ trong nước (S-W)

- Từ các dung dịch chuẩn làm việc, pha các mẫu chuẩn DTZ trong huyếttương bằng cách phối hợp các dung dịch chuẩn làm việc trong nước (S-W)tương ứng với huyết tương trắng theo bảng 2.2

Bảng 2.2. Cách chuẩn bị các mẫu chuẩn DTZ trong huyết tương

Ký hiệu Nồng độ

(ng/mL)

Dung dịch S-W trong nước Thể tích huyết

tương trắng (L)

Ký hiệu

Nồng độ (ng/mL)

Thể tích (L)

* Chuẩn bị mẫu kiểm tra (QC):

- Hòa tan chất chuẩn DTZ trong MeOH để thu được dung dịch chuẩn gốc cónồng độ DTZ chính xác khoảng 250 g/mL

- Pha loãng 1 thể tích xác định dung dịch chuõ̉n gụ́c với một lượng nước cấtvừa đủ để thu được dung dịch chuẩn làm việc (WS) có nồng độ DTZ chínhxác khoảng 5000 ng/mL

- Pha các dung dịch chuẩn trong nước QC-W, từ dung dịch WS theo bảng 2.3

- Từ các dung dịch chuẩn trong nước, pha các mẫu QC chứa chuẩn DTZ tronghuyết tương bằng cách phối hợp các dung dịch chuẩn làm việc trong nước(QC-W) tương ứng với huyết tương trắng theo bảng 2.4

Bảng 2.3 Chuẩn bị các dung dịch trong nước (QC-W) để pha mẫu QC:

Ký hiệu Nồng độ

(ng/mL)

Thể tích (L)

Qui trình phân tích phải đảm bảo có khả năng nhận diện, phân biệt được DTZ

và không bị ảnh hưởng bởi các tạp chất có trong mẫu Đáp ứng của mẫu trắngtại thời điểm trùng với thời gian lưu của DTZ phải không vượt quá 20% đápứng của mẫu chuẩn Đáp ứng của mẫu trắng tại thời điểm trùng với thời gianlưu của nội chuẩn phải không được vượt quá 5% đáp ứng của nội chuẩn

2.3.2.2 Xây dựng đường chuẩn và khoảng tuyến tính

Tiến hành phân tích các mẫu chuẩn DTZ trong huyết tương có nồng độ tươngứng từ 5 – 500 ng/ml như ở trên Từ đáp ứng pic của DTZ và IS tại các nồng

độ tương ứng, xây dựng phương trình hồi qui giữa tỷ lệ đáp ứng pic của DTZ/

IS và nồng độ DTZ có trong mẫu Đường chuẩn phải có hệ số tương quan >0,98 và ít nhất 75% số điểm của đường chuẩn, bao gồm cả mẫu có nồng độthấp nhất và mẫu có nồng độ cao nhất phải có độ đúng nằm trong khoảng từ85% đến 115%, riêng điểm thấp nhất của đường chuẩn cho phép sai số khôngquá 20%, đồng thời 4/6 điểm QC phải nằm trên đường chuẩn

2.3.2.3 Xác định giới hạn định lượng dưới (LLOQ)

Tiến hành sắc ký các mẫu trắng và mẫu chuẩn có nồng độ 5 ng/mL huyếttương với 6 mẫu độc lập Ghi lại đáp ứng pic của mẫu trắng và mẫu chuẩn.Xác định đáp ứng pic của mẫu chuẩn, mẫu trắng Xác định độ đúng củaphương pháp bằng cách so sánh giá trị định lượng được (tính từ đường chuẩn)với giá trị thực có trong mẫu Nồng độ được coi là giới hạn định lượng dướicủa phương pháp nếu trên sắc ký đồ mẫu chuẩn ở nồng độ đó cho pic DTZtách biệt với các pic tạp, có độ đúng từ 80 – 120 %; độ chớnh xỏcvới giá trịRSD ≤ 20% và đáp ứng pic DTZ ≥ 5 lần đáp ứng của mẫu trắng.

2.3.2.4 Thẩm định độ đúng – độ chính xác trong ngày và khác ngày

Tiến hành sắc ký cỏc lụ mẫu QC bao gồm LQC, MQC và HQC, mỗi lô mẫugồm ít nhất 5 mẫu độc lập cú cựng nồng độ Xác định kết quả định luợng cácmẫu QC theo đường chuẩn pha trong huyết tương trắng, tiến hành trongcùng điều kiện Xác định độ đúng trong ngày bằng cách tính tỷ lệ % giá trịtìm thấy so với giá trị thực của các mẫu trong cùng 1 ngày Độ đúng củaphương pháp tại mỗi nồng độ phải nằm trong khoảng từ 85% đến 115%

Độ chính xác trong ngày thể hiện qua độ lệch chuẩn tương đối (RSD) giữagiá trị các lần định lượng của mỗi nồng độ được phân tích trong cùng mộtngày Yêu cầu giá trị RSD phải ≤ 15%

Độ độ đúng và độ chính xác khác ngày: Tiến hành tương tự như xác định độđúng và độ chính xác trong ngày Tính giá trị tỷ lệ tìm thấy và RSD của kếtquả định lượng cho mỗi nồng độ trong ít nhất 3 ngày phân tích khác nhau Giátrị RSD phải ≤ 15%, độ đúng nằm trong khoảng 85 – 115%

2.3.2.5 Xác định tỷ lệ thu hồi hoạt chất và nội chuẩn

Chuẩn bị các mẫu LQC, MQC, HQC và mẫu chuẩn nồng độ tương ứng là 15;

250 và 450 ng/mL có chứa nội chuẩn pha trong nền mẫu huyết tương đã được

xử lý (mẫu spike)

% 100

Tiến hành phân tích theo phương pháp đã được xây dựng, xác định diện tích

pic DTZ, FELO có trong các mẫu QC và các mẫu spike

Xác định tỷ lệ thu hồi DTZ, FELO bằng cách so sánh diện tích pic của mẫu

có qua chiết tách – với mẫu pha trong nền mẫu huyết tương đã được xử lý có

nồng độ tương ứng (mẫu spike) theo công thức sau:

2.3.2.6 Nghiên cứu độ ổn định của diltiazem

Xác định độ ổn định của DTZ trong huyết tương sau ba chu kỳ đông – rãđông; trong quá trình xử lý mẫu và trong quá trình bảo quản dài ngày và sau

xử lý mẫu trờn cỏc mẫu LQC và HQC Ở mỗi nồng độ, tiến hành xử lý tốithiểu 5 mẫu Tính nồng độ của các mẫu dựa vào đường chuẩn

– Độ ổn định sau ba chu kỳ đông – rã đông:

Khảo sát độ ổn định sau ba chu kỳ đụng - ró thực hiện trên 2 nồng độ LQC vàHQC Bảo quản mẫu ở nhiệt độ -400C và để rã đông ở nhiệt độ phòng Saukhi đã tan chảy hoàn toàn, để mẫu trở lại đông lạnh trong 12 – 24giờ Sau 3chu kỳ đông – rã, tiến hành phân tích xác định nồng độ DTZ có trong mẫu Sosánh với kết quả xác định nồng độ DTZ có trong các mẫu tiến hành phân tích

ngay sau khi pha (nồng độ ban đầu) Kết quả lượng DTZ có trong mẫu sau 3chu kỳ đông – rã đông phải tương đương với lượng DTZ có trong mẫu phântích ngay sau khi để rã đông.

– Độ ổn định ở nhiệt độ phòng trong thời gian ngắn:

So sánh lượng DTZ có trong mẫu được chiết tách ngay sau khi rã đông vàmẫu có nồng độ tương ứng chỉ được chiết tách sau khi đã rã đông và để ởnhiệt độ phòng 6 giờ Kết quả phải sai khác không có ý nghĩa thống kê

– Độ ổn định dài ngày:

Bảo quản mẫu trong điều kiện –40 oC Phân tích xác định nồng độ DTZtrong các mẫu sau từng khoảng thời gian: bắt đầu và sau 14 đến 29 ngày Sosánh kết quả định lượng của các mẫu tại từng thời điểm trong quá trình theodõi với giá trị định lượng ban đầu Mẫu phải ổn định tại điều kiện bảo quảntrong khoảng thời gian tối thiếu phải đủ để tiến hành lấy mẫu máu và phântích hết số mẫu huyết tương của NTN (khoảng 4 tuần)

- Độ ổn định của mẫu sau xử lý (trong auto-sampler):

Tiến hành chuẩn bị mẫu huyết tương ở nồng độ LQC và HQ, rồi xử lý mẫutheo qui trình đã xây dựng Số mẫu sau xử lý được chia làm 2 phần: phần 1tiêm sắc ký ngay sau khi xử lý; phần 2 để trong autosampler chờ 12 giờ sau

xử lý rồi tiêm sắc ký So sánh nồng độ DTZ của mẫu tiêm sắc ký ngay và mẫutiêm sắc ký 12 giờ sau xử lý

2.3.3 Đánh giá khả năng phù hợp của phương pháp:

Để đánh giá khả năng phù hợp của phương pháp đã xây dựng chúng tôitiến hành định lượng xác định nồng độ DTZ trong các mẫu huyết tương của 3NTN sử dụng DTZ

Cho NTN uống một liều đơn duy nhất 1 viờn nộn chứa 60 mg DTZ sau khinhịn đói qua đêm Lấy mẫu từ tĩnh mạch cẳng tay NTN vào các thời điểm

ngay trước khi uống thuốc và sau khi uống thuốc 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 10; 12;24; và 36 giờ Các mẫu máu sau khi lấy vào các ống nghiệm có chứa EDTAđược ly tâm tách riêng lấy phần huyết tương bảo quản ở -400C cho tới khiphân tích

Định lượng DTZ trong các mẫu huyết tương NTN bằng phương pháp LC-MS/

MS đã được thẩm định Từ kết quả định lượng xác định các thông số dượcđộng học như nồng độ cực đại trong huyết tương (Cmax), thời gian bán thải(t1/2) của DTZ trên NTN qua đó đánh giá khả năng ứng dụng của phương phápphân tích đã được xây dựng trong các nghiên cứu sinh khả dụng (SKD) vàtương đương sinh học (TĐSH) các chế phẩm chứa hoạt chất DTZ đang lưuhành trên thị trường

PHẦN 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU3.1 KẾT QUẢ XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

3.1.1 Tối ưu hóa điều kiện khối phổ xác định DTZ và chuẩn nội

3.1.1.1 Tối ưu hoá điều kiện khối phổ xác định DTZ:

Pha dung dịch chuẩn DTZ trong MeOH nồng độ khoảng 1 àg/ml Bơm dungdịch chuẩn DTZ với tốc độ 5 àl/phỳt cùng với dòng dung môi sắc ký (tốc độdòng sắc ký khoảng 500 àl/phỳt) qua bộ trộn hình chữ T (Mixing tee) vào hệ

thống khối phổ thông qua nguồn ion hóa phun điện tích dương - Possitive Electro Spray Ions (ESI +) như hình 3.1

Hình 3.1 Cơ chế hoạt động của thiết bị LC/MS trong quá trình tối ưu hóa

điều kiện khối phổ: - Infusion pump: Bơm dung dịch chuẩn DTZ;

-LC: Bơm dung môi sắc ký.

Lựa chọn chế độ quét toàn phổ (Full scan MS) với nguụn; xác định đượcmảnh ion mẹ (parent ion) của DTZ có số khối m/z là 415 Da, tương ứng vớicấu trúc [DTZ-H]+ (hình 3.2)

Hình 3.2 Phổ khối của DTZ

Sau khi xác định được mảnh ion mẹ m/z = 415 Da, chúng tôi tiến hành tối ưuđiện thế nguồn ion hóa, tốc độ thổi khí nitrogen sương mù húa dũng dung môisắc ký để lượng ion mẹ đi vào detector khối phổ là lớn nhất và ổn định Kếtquả thực nghiệm cho thấy:

- Điện thế của nguồn ion hóa ảnh hưởng đến số lượng tiểu phân mangđiện tích tạo thành: Khi điện thế tăng lên, lượng ion có m/z = 415 đi vàodector khối phổ tăng lên đồng thời các số lượng ion khác đi vào detector cũngtăng lên và ngược lại Khi điện thế tăng quá cao thỡ cú hiện tượng phóng hồquang điện ở đầu phun ion làm giảm tuổi thọ của đầu phun và khi điện thếgiảm quá thấp thì lượng ion đi vào detector thấp làm giảm độ nhạy củaphương pháp

- Tốc độ thổi khí nitrogen để sương mù húa dũng dung môi sắc ký ảnhhưởng đến hiệu năng tích điện của các tiểu phân DTZ: Khi tốc độ dũng khớquỏ lớn, số lượng ion m/z = 415 đi vào detector khối phổ giảm đi và dòng ion

đi vào detector khối phổ cũng không ổn định (do phần lớn ion bị thổi quađường thải cùng với dung môi pha động) Khi tốc độ dũng khớ quỏ thấp thìquá trình sương mù hóa không đạt hiệu suất cao, có hiện tượng ngưng tụ hơinước và hơi dung môi trong buồng ion hóa, làm cho số lượng ion m/z tạothành giảm đi rõ rệt, nên số lượng ion đi vào detector ít đi và cũng không ổnđịnh

Từ kết quả thực nghiệm, chúng tôi xác định khi điện thế của nguồn phun ion

hóa (spray voltage) là 4000 V; nhiệt độ nguồn phun là 40 0C; áp suất khí

mang (sheath gas pressure), khí bổ trợ (auxilary gas pressure) tương ứng là

30 psi và 5 psi; nhiệt độ mao quản (capillary temperature) là 360 0C thì lượngion mẹ có m/z = 415 Da đi vào detector khối phổ là lớn nhất và ổn định

Sau khi tối ưu húa cỏc điều kiện của nguồn ion hóa, chúng tôi tiếp tục tối ưu

hóa điện thế của bộ phận thấu kính hội tụ ion (tube lens offset) để lượng ion

được tạo thành ở nguồn ion hóa đi vào detector khối phổ với lượng tối ưu Kếtquả xây dựng giản đồ điện thế của bộ phận thấu kính hội tụ cho thấy, khi điệnthế là 108 V thì lượng ion có m/z = 415 Da đi vào detector khối phổ ở mức tốtnhất (cường độ tín hiệu detector đo được là lớn nhất) – hình 3.3

Hình 3.3 Giản đồ điện thế của bộ phận thấu kính hội tụ

Để giảm độ nhiễu của nền mẫu, tăng độ đặc hiệu và giới hạn phát hiện củaphương pháp phân tích, chúng tôi lựa chọn kiểu khối phổ 2 lần (MS/MS), sửdụng năng lượng phân mảnh ion mẹ (m/z = 415 Da) tạo ra các ion con đặchiệu Kết quả thực nghiệm cho thấy, trong số các ion con được tạo thành khiphân mảnh ion mẹ, ion có m/z = 178 Da cho tín hiệu lớn và ổn định nhất(hình 3.4) Năng lượng tối ưu để để phân mảnh ion mẹ tạo ra ion con có m/z =

178 Da là 22 V (hình 3.5) Cơ chế phân mảnh ion được trình bày ở hình 3.4

Hình 3.4: Phổ khối lần 2 (MS/MS) của DTZ và cơ chế phân mảnh ion mẹ (m/z = 415 Da)