- Hòa tan Lọc 0,45µm
PHẦN 4 BÀN LUẬN 4.1 Về phương pháp phân tích
4.1. Về phương pháp phân tích
Trước đây đó cú những nghiên cứu về phương pháp định lượng DTZ trong dịch sinh học bằng HPLC với các loại detector khác nhau. Một số phương pháp sử dụng detector UV [32,9,19,14,7,8], detector huỳnh quang [13] và detector khối phổ [12,18,22]. Một số phương pháp còn định lượng được đồng thời DTZ và các chất chuyển hóa của nó [12,9,14,22]. Hầu hết các phương pháp có giới hạn định lượng dưới không đạt yêu cầu, một số phương pháp có giới hạn định lượng dưới thấp song thời gian phân tích mẫu lại quá dài, không phù hợp để triển khai đánh giá SKD và TĐSH trong thực tế. Có phương pháp đạt về giới hạn định lượng dưới và thời gian phân tích phù hợp song quy trình xử lý mẫu lại quá phức tạp, tốn kém hoặc hiệu suất chiết thấp, không ổn định.
Phương pháp phân tích chúng tôi xây dựng có giới hạn định lượng dưới thấp (5 ng/ml), thời gian phân tích ngắn 2,75 phút. Do vậy, trong thời gian 6 – 8 giờ có thể phân tích được 120 – 150 mẫu. Một ngày, có thể phân tích xong số lượng mẫu của 4 – 6 NTN. Toàn bộ số mẫu của 12 NTN có thể phân tích xong trong 2 - 3 ngày. Điều này hoàn toàn thích hợp cho một thử nghiệm đánh giá SKD và TĐSH.
4.2. Quy trình xử lý mẫu:
Kỹ thuật LC – MS có ưu điểm là độ nhạy cao, có thể phát hiện được chất phân tích ở nồng độ rất thấp, đồng thời tạp chất với một lượng rất nhỏ cũng có thể được phát hiện hoặc gây ảnh hưởng cho quá trình phân tích. Vì vậy để phõn tích được DTZ có nồng độ rất thấp trong mẫu huyết tương của NTN có thành phần rất phức tạp, tỷ lệ tạp chất lớn thì mẫu huyết tương phải được xử lý bằng các kỹ thuật thích hợp. Xử lý mẫu giúp loại bỏ một hoặc nhiều thành phần tạp chất có trong mẫu, tạo thuận lợi cho quá trình phân tích, định lượng DTZ bằng phương pháp LC/MS-MS.
So với phương pháp SPE của N. Hughes và cộng sự [22], phương pháp xử lý mẫu sử dụng trong luận văn (chiết lỏng – lỏng bằng dung môi hữu cơ) đơn giản hơn nhiều; không đòi hỏi trang thiết bị đặc biệt; dễ dàng triển khai và mang lại hiệu quả kinh tế cao khi mà tổng số mẫu trong mỗi nghiên cứu SKD và đỏnh giá TĐSH là rất lớn (hàng nghìn mẫu).
So với phương pháp kết tủa protein bằng dung môi của Georgita C và cộng sự [12], phương pháp xử lý mẫu mà chúng tôi xây dựng chiết dược DTZ với độ tinh sạch cao hơn, ít lẫn tạp chất nên dễ phân tích sau xử lý.
Phương pháp xử lý mẫu có hiệu suất chiết DTZ xấp xỉ 90% ở cả 2 khoảng nồng độ thấp (5,0 ng/mL) và cao (450 ng/mL). Việc sử dụng hỗn hợp dung môi cloroform và diethylether với tỷ lệ 3:7 (vv/vv) giúp làm giảm thời gian bay hơi dung môi, rút ngắn thời gian xử lý mẫu.
4.3. Về kết quả thẩm định phương pháp phân tích
Đã tiến hành thẩm định phương pháp một cách đầy đủ theo hướng dẫn của US – FDA [29] với các chỉ tiêu: sự phù hợp của hệ thống phân tích, tính chọn lọc – đặc hiệu, khoảng nồng độ tuyến tính, giới hạn định lượng dưới, độ đúng, độ chính xác, tỷ lệ tìm lại của hoạt chất và độ ổn định của mẫu phân tích. Phương pháp đã khảo sát có khoảng nồng độ tuyến tính lớn (5 ng/ml – 500 ng/ml), đảm bảo nồng độ DTZ ở các thời điểm lấy máu khác nhau, khi uống liều đơn 60 mg, vẫn nằm trong khoảng nồng độ tuyến tính đó. Chúng tôi cũng đã tiến hành đánh giá độ tuyến tính trong 5 ngày khác nhau với kết quả trong cả 5 ngày phương pháp đã khảo sát đều đạt độ tuyến tính. Giới hạn định lượng dưới 5 ng/ml bằng khoảng 1/30 – 1/40 Cmax và giới hạn định lượng trên 500 ng/ml bằng khoảng 2 – 3 lần Cmax, phù hợp để định lượng DTZ trong huyết tương người sử dụng DTZ.
4.4. Về kết quả đánh giá khả năng ứng dụng của phương pháp:
Đánh giá khả năng ứng dụng trên thực tế bằng cách áp dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng DTZ trong huyết tương người tình nguyện, kết quả cho thấy:
- Nồng độ DTZ trong tất cả các mẫu huyết tương của NTN đều nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát (5 – 500 ng/ml).
- Giá trị Cmax và T1/2 phù hợp với các tài liệu đã công bố [23,24,25]. Như vậy, phương pháp phân tích DTZ trong huyết tương mà chúng tôi xây dựng là phù hợp và có thể áp dụng trong việc triển khai đánh giá SKD và TĐSH.