- Hòa tan Lọc 0,45µm
3.2.2. đặc hiệu – chọn lọc của phương pháp
Tiến hành phân tích các mẫu huyết tương theo phương pháp đã xây dựng ở phần 3.1, bao gồm:
a. 06 mẫu huyết tương trắng có nguồn gốc khác nhau;
b. 06 mẫu LLOQ (mẫu huyết tương trắng có chứa chuẩn DTZ ở nồng độ 5 ng/mL và nội chuẩn FELO).
Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng, mẫu huyết tương chứa DTZ và FELO được trình bày ở cỏc hỡnh 3.14 và 3.15. Đáp ứng pớc của mẫu trắng so với pic DTZ và FELO được trình bày ở bảng 3.5.
Hình 3.14: Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng
Hình 3.15: Sắc ký đồ mẫu huyết tương chứa chuẩn DTZ (5 ng/ml) và FELO
(250 ng/ml)
Kết quả thực nghiệm cho thấy:
+ Trên sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng (hình 3.14) tại thời điểm 1,7 – 1,8 phút (trùng với thời gian lưu của DTZ và FELO trong mẫu chuẩn – hình 3.15) không xuất hiện các pic cú cỏc mảnh phổ khối m/z = 414,5 → 177,8 (đặc trưng cho DTZ) và mảnh phổ khối m/z = 383,4 → 338,1 (đặc trưng cho FELO).
+ Diện tớch pớc của mẫu trắng tại các thời điểm trùng với thời gian lưu của DTZ và FELO đều là 0% (bảng 3.5). Các pic DTZ và FELO ở các mẫu LLOQ đều có tỷ lệ S/N (signal/noise) > 500 (hình 3.15).
Do vậy, phương pháp phân tích DTZ mà chúng tôi xây dựng đáp ứng được yêu cầu về độ đặc hiệu – chọn lọc theo hướng dẫn của FDA – Mỹ năm 2001.
3.2.3. Xây dựng đường chuẩn và khoảng tuyến tính
Phân tích các mẫu chuẩn DTZ trong huyết tương có nồng độ 5; 10; 25; 50; 100; 200; 400 và 500 ng/ml được chuẩn bị như mục 2.3.2.2, theo qui trình đã
xây dựng. Xác định sự tương quan giữa nồng độ TMZ trong huyết tương và tỷ lệ diện tích pic DTZ/FELO đo được bằng phương pháp hồi quy tuyến tính với hệ số tỷ trọng 1/nồng độ2. Kết quả xác định mối tương quan tuyến tính và độ đúng của các mẫu chuẩn (tỷ lệ nồng độ DTZ xác định từ đường chuẩn so với nồng độ DTZ lý thuyết có trong mẫu chuẩn khi pha) được trình bày ở bảng 3.3 và 3.4.
Bảng 3.3. Độ tuyến tính của phương pháp thu được sau khi phân tích hồi quy
STT Hệ số a Hệ số b r 1 0,0060 0,0027 0,9994 2 0,0061 0,0017 0,9992 3 0,0075 0,0031 0,9996 4 0,0075 0,0027 0,9994 5 0,0078 0,0035 0,9996 Trung bình 0,0070 0,0027 0,9994 S.D 0,0009 0,0007 0,0002
Bảng 3.4: Độ đúng, chính xác của các mẫu chuẩn.
Nồng độ lý thuyết (ng/ml) Nồng độ xác định từ đường chuẩn (ng/ml; Trung bình ± S.D; n=5) Độ đúng (%) Độ chính xác (CV %) 5,1 4,8 ± 0,4 94,1 7,5 10,2 10,5 ± 0,6 102,9 5,4 25,5 29,3 ± 1,6 114,9 6,2 51,0 56,3 ± 2,3 110,4 4,4 102,0 103,8 ± 2,3 101,8 2,2 204,0 208,4 ± 7,5 102,3 3,7 408,0 402,4 ± 8,6 98,6 2,1 510,0 497,7 ± 7,9 97,6 1,6
Kết quả thực nghiệm trình bày ở bảng 3.3 và 3.4 cho thấy trong khoảng nồng độ từ 5,1 ng/ml đến 510 ng/ml có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa nồng độ DTZ và tỷ lệ diện tích pic DTZ/FELO với hệ số tương quan xấp xỉ bằng 1. Nồng độ DTZ xác định được từ đường chuẩn so với giá trị lý thuyết
từ 1,6% đến 7,5% và đều nằm trong giới hạn cho phép: từ 80 đến 120 % đối với nồng độ thấp nhất và từ 85 đến 115 % cho các nồng độ còn lại. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính đã xây dựng đáp ứng các yêu cầu về phân tích thuốc trong dịch sinh học của FDA – Mỹ 2001.