nghiên cứu ứng dụng chiết pha rắn để định lượng vitamin d trong syro thuốc patarvit bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

Đặt vấn đề Vitamin là nhóm chất thiết yếu đối với sự sống mà cơ thể con ngời không thể tự tổng hợp đợc hoặc tổng hợp ở lợng rất ít không đủ đáp ứng với nhu cầu. Các vitamin cần phải đợc cung cấp từ nguồn ngoại sinh. Vì vậy phối hợp các vitamin nhằm cung cấp một số vitamin cần thiết cho nhu cầu sinh lý và bệnh lý không thể thiếu đợc của cơ thể đã trở thành cách sử dụng thuốc quen thuộc. Hiện nay trên thị trờng, có một số lợng lớn rất đa dạng và phong phú các chế phẩm hỗn hợp vitamin (multivitamin). Việc đảm bảo chất lợng của nhóm chất này đã trở thành nhu cầu cấp thiết. Việc phân tích các vitamin tan trong dầu và trong nớc đã đợc thực hiện thành công bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Tuy nhiên đối với vitamin D thì việc phân tích vẫn là một vấn đề khó khăn. Vitamin D có hoạt lực sinh học mạnh nên có hàm lợng rất nhỏ, ở mức tạp so với các vitamin khác trong các chế phẩm hỗn hợp. ở nồng độ phân tích đợc vitamin D thì hàm lợng của các tá dợc và tạp phân huỷ của các vitamin khác rất nhiều và tơng đơng với vitamin D. Thực tế chỉ có thể định lợng đợc các chế phẩm vitamin D đơn có hàm lợng cao còn với các chế phẩm hỗn hợp với hàm lợng vitamin D thấp thì chỉ có thể định tính. Vì thế để định lợng đợc các chế phẩm hỗn hợp với hàm lợng thấp đòi hỏi phải có giai đoạn xử lý đặc biệt để làm sạch và làm giàu mẫu. Trong luận văn này chúng tôi đề cập đến việc ứng dụng kỹ thuật chiết pha rắn (solid phase extraction) để làm sạch và làm giàu mẫu trớc khi tiến hành định lợng bằng ph- ơng pháp HPLC. Syro Patarvit là một ví dụ về sự phối hợp của các vitamin tan trong dầu với các vitamin tan trong nớc ở dạng bào chế syro thuốc. Công thức cho 5 ml : Vitamin B1 2mg Vitamin B2 1mg Vitamin B6 1mg Nicotinamid 5mg Vitamin A 1.000 UI Vitamin D3 200UI Lysine 100mg Trong tiêu chuẩn cơ sở của sản phẩm chỉ quy định định tính chứ không định lợng đợc vitamin D. Vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài "Nghiên cứu ứng 1 dụng chiết pha rắn để định lợng vitamin D trong syro thuốc Patarvit bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao" với các mục tiêu sau: Nghiên cứu kỹ thuật chiết pha rắn để làm sạch và làm giàu vitamin D trong syro thuốc. Xây dựng quy trình HPLC để định lợng vitamin D áp dụng định lợng vitamin D trong syro thuốc Patarvit Phần 1 Tổng quan 1.1 Vitamin D [1, 2, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 16 ] 1.1.1 Công thức cấu tạo - Vitamin D 2 . C 27 H 44 O (M= 384,6) Tên khoa học : ergocalciferol - Vitamin D 3 . 2 C 27 H 44 O (M= 384,6) Tên khoa học : Cholecalciferol 1.1.2. Nguồn gốc Vitamin D có chủ yếu trong thức ăn từ động vật nh trứng, sữa, thịt Trong cơ thể vitamin D đợc tổng hợp ở các tế bào dới da nhờ ánh sáng tử ngoại Vitamin D còn có nguồn gốc tổng hợp. 1.1.3. Tính chất Tinh thể hình kim, không màu, không mùi, không tan trong nớc, dễ tan trong các dung môi hữu cơ nh ethanol, cloroform, ether và các chất béo. Không bền với nhiệt độ, không khí, ánh sáng. 1.1.4. Tác dụng dợc lý và cơ chế tác dụng Tham gia vào quá trình tạo xơng: làm tăng hấp thu calci và phosphat ở ruột, tăng tái hấp thu calci ở ống lợn gần, tham gia vào quá trình calci hoá sụn tăng trởng. Vì vậy vitamin D rất cần thiết cho sự phát triển bình thờng của trẻ em. Điều hoà nồng độ calci trong máu: Nếu các quá trình trên không cung cấp đủ calci, làm nồng độ calci máu giảm thì vitamin D (kết hợp với hormon tuyến cận giáp) sẽ huy động calci từ xơng ra. Ngoài ra vitamin D còn tham gia biệt hoá tế bào biểu mô và gần đây đang nghiên cứu tác dụng ức chế tăng sinh tế bào ung th. Vì thế khi thiếu vitamin D, ruột không hấp thu đủ calci và phospho làm giảm calci huyết, khi đó calci bị huy động từ xơng nên hậu quả là trẻ em chậm 3 lớn, còi xơng, chậm biết đi, chậm kín thóp. Ngời lớn sẽ bị loãng xơng, xốp x- ơng. 1.1.5. Chỉ định Phòng và điều trị còi xơng do thiếu vitamin D Phòng và điều trị loãng xơng, dễ gãy xơng. Chống co giật do suy tuyến cận giáp Hạ calci huyết Một số bệnh ngoài da nh chứng xơ cứng bì 1.1.6. Vitamin D và các chế phẩm multivitamin Vitamin D thờng đợc phối hợp với các vitamin tan trong dầu và các vitamin tan trong nớc. Một số chế phẩm phối hợp đợc liệt kê trong bảng 1.1 Bảng 1.1: Một số chế phẩm phối hợp của vitamin D Tên sản phẩm Dạng bào chế Thành phần Hàm lợng D (U.I) Nhà sản xuất Enpovid Nang mềm A, D 400 Cty TNHH SPM Vitamin A-D Nang mềm A, D 500 XNLHD Hậu Giang Hydrosol Hỗn dịch A, D, B1, B2, E, B6, PP, B5 500 UI/ml Roche Patarvit Syro B1, B2, B6, PP, A, D, B12 40 UI/ml Patar Lab LTD Homtamin Viên nang mềm A, D, B1, B2 400 UI Hàn Quốc 1.1.7. Các phơng pháp định lợng vitamin D - Phơng pháp hóa học [2, 7, 12, 13] + Nguyên tắc: Vitamin D tạo màu vàng với thuốc thử antimon clorid. Đem đo quang ở 500 và 550nm, tiến hành song song với mẫu chuẩn. + Nhận xét: Quy trình thực hiện rất phức tạp, bao gồm các giai đoạn xà phòng hóa trong điều kiện tránh oxi hóa, chiết tách và tinh chế qua các cột sắc ký bán điều chế sử dụng các chất nhồi là đất tẩy màu dùng cho sắc ký và đất silic dùng cho sắc ký, sau đó tạo màu và đo quang. Do tiến hành qua nhiều giai đoạn nên làm giảm độ chính xác. - Phơng pháp sinh học [2, 7, 12, 13] 4 + Nguyên tắc: Hoạt lực vitamin D đợc đánh giá thông qua xác định mức độ vôi hóa xơng trên thỏ hoặc chuột. + Nhận xét: Phơng pháp này tiến hành khá phức tạp. Kết quả phụ thuộc nhiều vào các cá thể và đòi hỏi ngời thử nghiệm phải đợc đào tạo kỹ lỡng. - Phơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao [1, 2, 7, 11, 12, 16] + Nguyên tắc: Dựa trên sự phân bố khác nhau của vitamin D giữa pha động và pha tĩnh so với các thành phần hoạt chất khác. + Nhận xét: Đây là phơng pháp hiện đại, ngày càng đợc áp dụng phổ biến. Tuy nhiên cũng chỉ có thể áp dụng trực tiếp với các chế phẩm đơn hoặc đa thành phần trong đó vitamin D có hàm lợng cao (>500 UI/1 đơn vị phân liều) còn với các chế phẩm có hàm lợng D thấp thì đòi hỏi phải có biện pháp xử lý mẫu phù hợp để làm sạch và làm giàu mẫu. 1.2 Kỹ thuật Chiết pha rắn [5, 14, 15] Đây là kỹ thuật chiết đợc ứng dụng ngày càng nhiều. Ngày nay, trong thực hành phân tích, nó đã dần thay thế các phơng pháp chiết lỏng-lỏng cổ điển. Phơng pháp chiết pha rắn sử dụng các cột đợc nhồi các chất rắn khác nhau, có cơ chế tơng tác giữa các chất phân tích với dung môi và pha rắn giống nh trong sắc ký lỏng. Do cơ chế chiết tách trên mà các chất pha rắn đợc sử dụng cũng giống nh pha tĩnh trong sắc ký lỏng. 1.2.1 Phân loại các kiểu chiết - Kiểu hấp phụ: Không cần pha liên kết mà sử dụng ngay các nhóm chức trên bề mặt nguyên liệu hấp phụ. Về cơ bản, sử dụng điều kiện sắc ký pha thuận. Chất hấp phụ hay đợc dùng nhất là silicagel, magnesi silicat, nhôm oxyd. - Kiểu phân bố trên pha liên kết: Bề mặt chất hấp phụ đã đợc thay đổi, gắn thêm nhóm chức hoá học đóng vai trò chính trong kiểu tơng tác phân bố, bao gồm các kiểu điều kiện sắc ký sau: Pha thuận: pha tĩnh phân cực sẽ giữ lại các chất phân cực và cho phép các chất không phân cực đi qua cột. Thông thờng kiểu này sử dụng các dung môi ít hoặc không phân cực. Pha đảo: pha tĩnh không phân cực, kiểu này ngợc lại kiểu pha thuận. Pha đảo tạo cặp ion: pha tĩnh không phân cực, mẫu phân cực có chứa các phân tử cần phân tích ở dạng ion kết hợp với ion trái dấu đợc thêm vào 5 trong mẫu, trở thành phân tử trung hoà đợc lu giữ lại trên cột và rửa giải theo cơ chế pha đảo. Trao đổi ion: bề mặt chất hấp phụ đã đợc thay đổi, gắn với các nhóm chức có thể ion hoá. Cơ chế tách chiết của kỹ thuật này cũng giống nh sắc ký trao đổi ion. Các nhóm chức gồm nhóm trao đổi anion mạnh hoặc yếu và nhóm trao đổi cation mạnh hoặc yếu. 1.2.2. Thực hành chiết, làm sạch và làm giàu mẫu qua 5 bớc Bớc 1: Chọn loại cột pha rắn. Có thể sử dụng các cột 1ml, 2ml hoặc 5ml phụ thuộc vào: thể tích mẫu, mức độ tạp chất, tính phức tạp của nền mẫu, lợng chất phân tích quan tâm, tính chất dung môi mẫu và tính chất tơng tác giữa chất phân tích với pha rắn. Bớc 2: Luyện cột. Luyện cột nhằm hoạt hoá cột chuẩn bị tiếp nhận mẫu cần chiết và loại một số tạp chất còn ở trên cột. Thông thờng sau khi luyện cột phải rửa tiếp cột bằng một dung môi giống nh dung môi dùng để chuẩn bị mẫu. Bớc 3: Chuyển mẫu vào cột chiết. Chuyển chính xác lợng mẫu cần chiết vào cột, sử dụng pipet hoặc micropipet. Cần lu ý, để tránh tắc cột, cần phải ly tâm hoặc lọc mẫu trớc khi chiết. Sau khi chuyển toàn bộ mẫu, sử dụng máy hút chân không hoặc áp lực đẩy. Bớc 4: Rửa. Nếu nh hợp chất cần quan tâm lu trên cột, rửa để loại bỏ các chất không mong muốn, các tạp chất không lu trên cột bằng dung dịch đã dùng để chuẩn bị mẫu hoặc một dung dịch khác mà nó không rửa giải hợp chất cần quan tâm. Bớc 5: Rửa giải các hợp chất cần thiết. Sử dụng lợng nhỏ thể tích dung môi hữu cơ mà nó chỉ rửa giải hay chiết các hợp chất quan tâm và để lại các tạp chất không đợc loại trong quá trình rửa. Dịch rửa giải đợc thu hồi để tiếp tục phân tích. 1.2.3. Ưu nhợc điểm và ứng dụng của chiết pha rắn. Chiết pha rắn là một phơng pháp chiết thuận tiện, không đắt, tiết kiệm thời gian và có thể thay thế cho chiết lỏng-lỏng. Kỹ thuật này đợc dùng để làm sạch và làm giàu mẫu phân tích. Thêm vào đó, nó giảm đáng kể lợng dung môi hữu cơ sử dụng. 6 Hình 1.1: Sơ đồ miêu tả kỹ thuật chiết pha rắn trong phân tích 1.3. Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao [3, 4, 6, 16] 1.3.1. Khái niệm cơ bản - Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một phơng pháp tách hoá lý dựa vào ái lực khác nhau của các chất khác nhau với hai pha luôn tiếp xúc và không đồng tan với nhau, một pha động và một pha tĩnh. Pha động là chất lỏng chảy qua cột với một tốc độ nhất định còn pha tĩnh chứa trong cột là một 7 chất rắn đã đợc phân chia dới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn hay một chất mang đã đợc biến đổi bằng liên kết hoá học với các nhóm hữu cơ. Quá trình sắc ký xẩy ra do các cơ chế : hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hoặc rây phân tử. - Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột: Pha tĩnh là yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc ký và loại sắc ký. Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ ta có sắc ký hấp phụ, nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion ta có sắc ký trao đổi ion, pha tĩnh là chất đã đợc gắn pha liên kết ta có sắc ký phân bố, nếu pha tĩnh là gel ta có sắc ký gel hay sắc ký rây phân tử. Quyết định hiệu quả sự tách ở đây là tổng hợp các tơng tác: Pha tĩnh Pha động F 2 1 3 F F Chất phân tích (A+ B+C) Tổng của 3 tơng tác này sẽ quyết định chất nào đợc rửa giải ra trớc tiên khi lực lu giữ là nhỏ nhất và ngợc lại. 1.3.2. Các đại lợng đặc trng. Thời gian lu và thể tích lu Thời gian lu của một chất là thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị cực đại và cho pic trên sắc ký đồ: 8 Hình 1.2: Sắc ký đồ của hai chất và các thông số đặc trng Nếu gọi t R là thời gian lu giữ của một chất Thì : t R = t R t 0 Trong đó: t R là thời gian lu thực (thời gian lu hiệu chỉnh). t 0 là thời gian chết (thời gian không lu giữ). Khi pha động chảy qua cột với một tốc độ không đổi thì thời gian lu có thể thay thế bằng thể tích lu. Thể tích lu là thể tích pha động thu đợc sau cột trong khoảng thời gian tơng ứng với thời gian lu. Hệ số phân bố Trong quá trình sắc ký luôn có sự phân bố của chất tan giữa pha động và pha tĩnh. Sự phân bố này đợc đặc trng bởi cân bằng phân bố với hệ số phân bố đợc tính theo công thức : M C Cs K = Trong đó C S , C M là nồng độ chất phân tích trong pha động và pha tĩnh ở thời điểm cân bằng. Thừa số dung lợng 9 Thừa số dung lợng là đại lợng biểu thị khả năng phân bố của chất tan trong hai pha cộng với sức chứa của cột, tức là tỷ số giữa lợng chất tan trong pha tĩnh và lợng chất tan trong pha động ở thời điểm cân bằng. M S M S V V K Q Q k ì==' Trong đó Q S , Q M là lợng chất tan có trong pha tĩnh và pha động V S , V M là thể tích pha tĩnh và pha động. Có thể tính k theo một công thức khác : O OR t tt k =' Hệ số chọn lọc Hai chất chỉ đợc tách ra khi chúng có các giá trị k khác nhau, hệ số chọn lọc cho biết hiệu quả tách của hệ thống sắc ký. RA RB ORA ORB A B A B t t tt tt k k K K ' ' ' ' = === ở đây ta quy ớc chất B bị lu giữ mạnh hơn chất A, nh vậy luôn lớn hơn 1, càng lớn thì khả năng tách của hai chất càng rõ. Thờng phân tích trong điều kiện trong khoảng 1,5 đến 2. Số đĩa lý thuyết và chiều cao đĩa lý thuyết Hiệu lực cột thờng đợc biểu thị qua hai thông số : Số đĩa lý thuyết (N) hoặc chiều cao đĩa lý thuyết (H). Số đĩa lý thuyết N đợc tính theo các công thức : 2 16 ì= W t N R hoặc 2 2/1 54,5 ì W t R Trong đó W : Là chiều rộng pic ở đáy pic 2/1 W : Là chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao pic. Chiều cao của đĩa lý thuyết đợc tính theo công thức : N L H = Trong đó L là chiều cao của cột sắc ký. Với một điều kiện sắc ký nhất định, chiều cao đĩa lý thuyết (H) và số đĩa lý thuyết (N) là hằng định đối với mỗi chất phân tích. Độ phân giải (R S ) 10 [...]... một đề tài nghiên cứu khoa học - Rèn luyện tác phong và phơng pháp nghiên cứu khoa học - Xây d ng đợc quy trình chiết vitamin D cho mẫu syro thuốc - Hiểu đợc cơ sở lý thuyết của sắc ký lỏng hiệu năng cao và chiết pha rắn - Biết vận hành và sử d ng một số thiết bị hiện đại trong kiểm nghiệm thuốc - Xây d ng đợc chơng trình sắc ký để định lợng vitamin D nh sau: + Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao + Cột Lichrosorb... cận và thực hành nhiều hơn với những máy móc hiện đại nh máy đo quang phổ, sắc ký lỏng hiệu năng cao - Tiếp tục nghiên cứu ứng d ng chiết pha rắn để định lợng vitamin D trong một số d ng bào chế khác của thuốc multivitamin và trong thực phẩm có bổ xung vitamin D - ứng d ng chiết pha rắn để tinh chế các chất có hàm lợng rất nhỏ trong một hỗn hợp phức tạp 33 34 35 ... trình chiết và quy trình sắc ký đã xây d ng ở trên để định lợng vitamin D trong syro Patarvit + Khảo sát tính chính xác của kết quả phân tích + Khảo sát tính đúng của kết quả phân tích Phơng pháp nghiên cứu: Phơng pháp nhiên cứu sử d ng trong khoá luận là sắc ký lỏng hiệu năng cao và chiết pha rắn (SPE) Tiến hành thực nghiệm để xây d ng quy trình chiết tối u và chơng trình sắc ký phù hợp nhất Sau đó... + Kiểu sắc ký áp d ng + Cột tách sử d ng + Các điều kiện về pha động (thành phần, tỉ lệ, tốc độ d ng) + Bớc sóng - Đánh giá chơng trình sắc ký vừa xây d ng + Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký + Khảo sát sự tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của vitamin D + Khảo sát giới hạn phát hiện và giới hạn định lợng - áp d ng định lợng vitamin D trong syro Patarvit + Sử d ng quy trình chiết và... pha tĩnh, ngời ta chia nó thành hai loại, nếu pha tĩnh là chất rắn ta có sắc ký lỏng -rắn (LSC), nếu pha tĩnh là chất lỏng ta có sắc ký lỏng- lỏng (LLC) 11 - Căn cứ theo độ phân cực của pha tĩnh và pha động, có các loại: sắc ký pha thuận, sắc ký pha đảo, sắc ký pha đảo tạo cặp ion và sắc ký trao đổi ion - Căn cứ theo cấu trúc xốp của pha tĩnh là các hạt rắn, ngời ta chia nó thành hai loại là xốp toàn... với diện tích pic của vitamin D trên chuẩn vitamin D Pha một d y các dung d ch chuẩn vitamin D có nồng độ biến thiên từ: 40-240 UI/ml Tiến hành: Cân chính xác khoảng 0,1g d u vitamin D (1000.000 UI/g) cho vào bình định mức 50 ml, hoà tan bằng methanol đến vạch ta đợc dung d ch chuẩn gốc nồng độ 2000 UI/ml Từ dung d ch chuẩn gốc trên pha loãng bằng methanol để đợc các dung d ch chuẩn có nồng độ vitamin. .. thống sắc ký và tiến hành sắc ký trong điều kiện đã chọn Hàm lợng vitamin D trong syro đựơc tính toán d a vào diện tích pic của mẫu chuẩn và mẫu thử theo công thức: H= St.Cc Sc.4 Trong đó: H : Hàm lợng vitamin D (UI/ml) Sc : Diện tích pic dung d ch chuẩn St : Diện tích pic dung d ch thử Cc : Nồng độ dung d ch chuẩn (UI/ml) Làm 3 lần để lấy giá trị trung bình Bảng 2.8 Kết quả định lợng syro Patarvit. .. quy trình chiết + Lựa chọn dung môi để rửa sạch tạp và dung môi để rửa giải + Khảo sát thể tích dung môi để rửa sạch tạp mà vẫn không làm mất vitamin D + Khảo sát thể tích dung môi rửa giải để rửa giải hết vitamin D + Khảo sát lợng dung môi để rửa sạch các vitamin còn lại trong cột để phục hồi cột - Xây d ng quy trình HPLC để phân tích Vitamin D Để xây d ng chơng trình sắc ký thích hợp, chúng tôi tiến... syro chứa: Vitamin B1 2mg Vitamin B2 1mg Vitamin B6 1mg Nicotinamid 5mg Vitamin A 1.000 UI Vitamin D 200UI Lysine 100mg Hoá chất: - Chất đối chiếu vitamin D (d u 1000.000 UI/g) - Chất đối chiếu vitamin A (d u 1000.000 UI/g) - Chất đối chiếu vitamin B1, B2, B6, PP - Methanol tinh khiết sắc ký - Acetonitril tinh khiết sắc ký - Nớc cất - Hexan D ng cụ-thiết bị: - Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao : HP 1100,... vạch Hút 1ml dung d ch trên cho qua cột SPE đã đợc xử lý - Pha dung d ch vitamin D chuẩn - Pha dung d ch vitamin A chuẩn 16 Khảo sát điều kiện rửa: Mục đích của chúng ta là làm sạch mẫu trứơc khi sắc ký Vậy phải chọn loại dung môi và thể tích dung môi phù hợp để rửa hết các vitamin tan trong nớc (B1, B2, B6, PP) trong khi không rửa trôi vitamin D Trong mẫu có một lợng lớn các vitamin tan trong nớc gồm . " ;Nghiên cứu ứng 1 d ng chiết pha rắn để định lợng vitamin D trong syro thuốc Patarvit bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao& quot; với các mục tiêu sau: Nghiên cứu kỹ thuật chiết pha rắn để làm. sạch và làm giàu vitamin D trong syro thuốc. Xây d ng quy trình HPLC để định lợng vitamin D áp d ng định lợng vitamin D trong syro thuốc Patarvit Phần 1 Tổng quan 1.1 Vitamin D [1, 2, 7, 8,. có sắc ký lỏng -rắn (LSC), nếu pha tĩnh là chất lỏng ta có sắc ký lỏng- lỏng (LLC). 11 - Căn cứ theo độ phân cực của pha tĩnh và pha động, có các loại: sắc ký pha thuận, sắc ký pha đảo, sắc ký pha