Nghiên cứu ứng dụng chiết pha rắn để định lượng vitamin d trong syro thuốc patarvit bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

Nghiên cứu ứng dụng chiết pha rắn để định lượng vitamin d trong syro thuốc patarvit bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu ứng dụng chiết pha rắn để định lượng vitamin d trong syro thuốc patarvit bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu ứng dụng chiết pha rắn để định lượng vitamin d trong syro thuốc patarvit bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu ứng dụng chiết pha rắn để định lượng vitamin d trong syro thuốc patarvit bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu ứng dụng chiết pha rắn để định lượng vitamin d trong syro thuốc patarvit bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu ứng dụng chiết pha rắn để định lượng vitamin d trong syro thuốc patarvit bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu ứng dụng chiết pha rắn để định lượng vitamin d trong syro thuốc patarvit bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu ứng dụng chiết pha rắn để định lượng vitamin d trong syro thuốc patarvit bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu ứng dụng chiết pha rắn để định lượng vitamin d trong syro thuốc patarvit bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu ứng dụng chiết pha rắn để định lượng vitamin d trong syro thuốc patarvit bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu ứng dụng chiết pha rắn để định lượng vitamin d trong syro thuốc patarvit bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu ứng dụng chiết pha rắn để định lượng vitamin d trong syro thuốc patarvit bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu ứng dụng chiết pha rắn để định lượng vitamin d trong syro thuốc patarvit bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu ứng dụng chiết pha rắn để định lượng vitamin d trong syro thuốc patarvit bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu ứng dụng chiết pha rắn để định lượng vitamin d trong syro thuốc patarvit bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu ứng dụng chiết pha rắn để định lượng vitamin d trong syro thuốc patarvit bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu ứng dụng chiết pha rắn để định lượng vitamin d trong syro thuốc patarvit bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu ứng dụng chiết pha rắn để định lượng vitamin d trong syro thuốc patarvit bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu ứng dụng chiết pha rắn để định lượng vitamin d trong syro thuốc patarvit bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu ứng dụng chiết pha rắn để định lượng vitamin d trong syro thuốc patarvit bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu ứng dụng chiết pha rắn để định lượng vitamin d trong syro thuốc patarvit bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu ứng dụng chiết pha rắn để định lượng vitamin d trong syro thuốc patarvit bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu ứng dụng chiết pha rắn để định lượng vitamin d trong syro thuốc patarvit bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu ứng dụng chiết pha rắn để định lượng vitamin d trong syro thuốc patarvit bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu ứng dụng chiết pha rắn để định lượng vitamin d trong syro thuốc patarvit bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu ứng dụng chiết pha rắn để định lượng vitamin d trong syro thuốc patarvit bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

BỘ Y TÊ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI Ệ Á u ‘ Títư-vrÊNÌ \ a\ ^ ' ; / NGHIÊN CỨU ỨN(Ì4í6 S ^ H I Ế T p h a r ắ n đ ể ĐỊNH LƯỢNG VITAMIN D TRONG SYRO THUỐC PATARVIT BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NÀNG CAO (KHOÁ LUẬN TỐT NGHỆP Dược sĩ KHOÁ 2000-2005) Ngưòi hướng dẫn: TS. Thái Duy Thìn PGS.TS. Thái Phan Quỳnh Như Nơi thực hiện: - Phòng Hoá Lý 1- Viện Kiểm nghiệm - Bộ môn Hoá dược- Trường đại học Dược Hà Nội Thời gian thực hiện: Tháng 10/2004 -5/2005 Hà Nội- 5/2005 LỜI CẢM ƠN Khoá luận này được thực hiện và hoàn thành tại phòng Hoá lý 1 - Viện kiểm nghiệm và Bộ môn Hoá dược - Truờng đại học Dược Hà Nội trong thời gian từ tháng 10/2004 đến tháng 5/2005. Trong quá trình thực hiện khoá luận tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô hướng dẫn, các thầy cô giáo trong bộ môn hoá dược và các cán bộ của phòng hoá lý 1- Viện kiểm nghiệm. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đối với các thầy cô giáo trường đại học Dược Hà Nội đã trang bị cho tôi những kiến thức cơ bản và cơ sở hoá phân tích, hoá dược để tôi áp dụng trong quá trình thực nghiệm và hoàn thành khoá luận tốt nhiệp. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết on sâu sắc đối vói: - TS. Thái Duy Thìn (Phó chủ nhiệm bộ môn Hoá dược-Trường đại học Dược Hà Nội) - PGS.TS. Thái Phan Quỳnh Như (Trưởng phòng Hoá lý 1- Viện kiểm nghiệm) đã trực tiếp hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện khoá luận. Xin chân thành cảm ơn NCS Trần Việt Hùng, các thầy cô giáo trong bộ môn hoá dược và các cán bộ của phòng Hoá lý 1- Viện kiểm nghiệm đã giúp tôi hoàn thành khoá luận này. Hà Nội, tháng 5/2005 Sinh viên Bùi Đình Sơn MỤC LỤC Trang Đặt vấn đề 1 Phần 1: Tổng quan 3 1.1. Vitamin D 3 1.1.1. Công thức cấu tạo 3 1.1.2. Nguồn gốc 3 1.1.3. Tính chất 4 1.1.4. Tác dụng dược lý 1.1.5. Chỉ định 4 1.1.6. Các chế phẩm vitamin D 4 1.1.7. Các phương pháp định lượng vitamin D . 5 1.2. Kỹ thuật chiết pha rắn . 6 1.2.1. Phân loại 6 1.2.2. Thực hành 7 1.2.3. ưu nhược điểm 8 1.3. Kỹ thuật HPLC 9 1.3.1. Khái niệm cơ bản 9 1.3.2. Các đại lượng đặc trưng 11 1.3.3. Hệ thống HPLC 13 1.3.4. Pha tĩnh . 13 1.3.5. Pha động 14 1.3.6. Cách đánh giá pic 15 1.3.7. Các phưofng pháp định lượng 16 Phần 2: Thực nghiệm và kết quả 17 2.1. Nguyên liệu, thiết bị và phương pháp nghiên cứu 17 2.1.1. Nguyên liệu và thiết bị 17 2.1.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu 18 2.2. Kết quả thực nghiệm 19 2.2.1. Khảo sát quá trình chiết 20 2.2.2. Khảo sát hiệu suất chiết 25 2.2.3. Lựa chọn điều kiện sắc ký 26 2.2.4. Khảo sát tính thích họrp của hệ thống HPLC 27 2.2.5. Khảo sát khoảng tuyến tính . 28 2.2.6. Định lượng vitamin D trong syro Patarvit 30 2.2.7. Đánh giá độ chính xác 32 2.2.8. Đánh giá độ đúng 34 2.2.9. Khảo sát LOD và LOQ 35 2.3. Bàn luận 36 Phần 3: Kết luận và đề x u ất 38 3.1. Kết luận 38 3.2. Đề xuất 38 Tài liệu tham khảo CHÚ GIẢI CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao LOD Giới hạn phát hiện LOQ Giới hạn định lượng LI Lần 1 STl Số thứ tự SPE Chiết pha rắn spíc Diện tích píc IB Trung bình ĐẶT VẤN ĐỂ Vitamin là nhóm chất thiết yếu đối với sự sống mà cơ thể con người không thể tự tổng hợp được hoặc tổng hợp ở lượng rất ít không đủ đáp ứng vói nhu cầu. Các vitamin cần phải được cung cấp từ nguồn ngoại sinh. Vì vậy phối hợp các vitamin nhằm cung cấp một số vitamin cần thiết cho nhu cầu sinh lý và bệnh lý không thể thiếu được của cơ thể đã trở thành cách sử dụng thuốc quen thuộc. Hiện nay trên thị tnrofng, có một số lượng lớn rất đa dạng và phong phú các chế phẩm hỗn hợp vitamin (multivitamin). Việc đảm bảo chất lượng của nhóm chất này đã trở thành nhu cầu cấp thiết. Việc phân tích các vitamin tan trong dầu và trong nước đã được thực hiện thành công bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Tuy nhiên đối với vitamin D thì việc phân tích vẫn là một vấn đề khó khăn. Vitamin D có hoạt lực sinh học mạnh nên có hàm lượng rất nhỏ, ở mức tạp so với các vitamin khác trong các chế phẩm hỗn hợp. ở nồng độ phân tích được vitamin D thì hàm lượng của các tá dược và tạp phân huỷ của các vitamin khác rất nhiều và tương đương với vitamin D. Thực tế chỉ cổ thể định lượng được các chế phẩm vitamin D đơn có hàm lượng cao còn với các chế phẩm hỗn hợp với hàm lượng vitamin D thấp thì chỉ có thể định tính. Vì thế để định lượng được các chế phẩm hỗn hợp với hàm lượng thấp đòi hỏi phải có giai đoạn xử lý đặc biệt để làm sạch và làm giàu mẫu. Trong luận văn này chúng tôi đế cập đến việc ứng dụng kỹ thuật chiết pha rắn (solid phase extraction) để làm sạch và làm giàu mẫu trước khi tiến hành định lượng bằng phương pháp HPLC. Syro Patarvit là một ví dụ về sự phối hợp của các vitamin tan trong dầu với các vitamin tan trong nước ở dạng bào chế syro thuốc. Công thức cho 5ml: Vitamin BI 2 mg Vitamin B2 Img Vitamin B6 Img Nicotinamid 5mg Vitamin A 1.000 UI Vitamin D3 200UI Lysine lOOmg Trong tiêu chuẩn cơ sở của sản phẩm chỉ quy định định tính chứ không định lượng được vitamin D. Vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài "Nghiên cứu ứng dụng chiết pha rắn để định lượng vitamin D trong syro thuốc Patarvit bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao " vói các mục tiêu sau: • Nghiên cứu kỹ thuật chiết pha rắn để làm sạch và làm giàu vitamin D trong syro thuốc. • Xây dựng quy trình HPLC để định lượng vitamin D • Áp dụng định lượng vitamin D trong syro thuốc Patarvit PH ẦNl TỔNG QUAN 1.1. VITAMIN D [1,2,7,8 ,9,11,12,13,16 ] 1.1.1. Công thức cấu tạo - Vitamin Dị. C27H44O (M= 384,6) Tên khoa học : ergocalciferol - Vitamin D, C27H44O (M= 384,6) Tên khoa học : Qiolecalciferol 1.1.2. Nguồn gốc Vitamin D có chủ yếu trong thức ăn từ động vật như trứng, sữa, thịt Trong cơ thể vitamin D được tổng hợp ở các tế bào dưói da nhờ ánh sáng tử ngoại Vitamin D còn có nguồn gốc tổng hcfp. 1.1.3. Tính chất Tinh thể hình kim, không màu, không mùi, không tan trong nước, dễ tan trong các dung môi hữu cơ như ethanol, cloroform, ether và các chất béo. Không bền với nhiệt độ, không khí, ánh sáng. 1.1.4. Tác dụng dược lý và cơ chế tác dụng Tham gia vào quá trình tạo xương: làm tăng hấp thu calci và phosphat ở ruột, tăng tái hấp thu calci ở ống lượn gần, tham gia vào quá trình calci hoá sụn tăng trưởng. Vì vậy vitamin D rất cần thiết cho sự phát triển bình thường của trẻ em. Điều hoà nồng độ calci trong máu: Nếu các quá trình trên không cung cấp đủ calci, làm nồng độ calci máu giảm thì vitamin D (kết hợp với hormon tuyến cận giáp) sẽ huy động calci từ xương ra. Ngoài ra vitamin D còn tham gia biệt hoá tế bào biểu mô và gần đây đang nghiên cứu tác dụng ức chế tăng sinh tế bào ung thư. Vì thế khi thiếu vitamin D, ruột không hấp thu đủ calci và phospho làm giảm calci huyết, khi đó calci bị huy động từ xưofng nên hậu quả là trẻ em chậm lớn, còi xương, chậm biết đi, chậm kín thóp. Người lớn sẽ bị loãng xương, xốp xương. 1.1.5. Chỉ định Phòng và điều trị còi xương do thiếu vitamin D Phòng và điều trị loãng xương, dễ gãy xương. Chống co giật do suy tuyến cận giáp Hạ calci huyết Một số bệnh ngoài da như chứng xơ cứng bì 1.1.6. Vitamin D và các chê phẩm multivitamin Vitamin D thường được phối hợp với các vitamin tan trong dầu và các vitamin tan trong nước. Một số chế phẩm phối hợp được liệt kê trong bảng 1.1 Bảng 1.1: Một số chế phẩm phối hợp của vỉtamin D Tên sản phẩm Dạng bào chế Thành phần Hàm iượng D (U.I) Nhà sản xuất Enpovid Nang mềm A,D 400 Cty TNHH SPM Vitamin A-D Nang mềm A,D 500 XNLHD Hậu Giang Hydrosol Hỗn dịch A, D, Bl, B2, E, B6 , pp, B5 500 Ul/ml Roche Patarvit Syro Bl, B2, B6 , pp, A, D, B12 40 Ul/ml Patar Lab L'l'D Homtamin Viên nang mềm A, D,B1,B2 400 UI Hàn Quốc 1.1.7. Các phương pháp định lượng YÌtamin D - Phương pháp hóa học [2, 7,12,13] + Nguyên tắc: Vitamin D tạo màu vàng với thuốc thử antimon clorid. Đem đo quang ở 500 và 550nm, tiến hành song song với mẫu chuẩn. + Nhận xét: Quy trình thực hiện rất phức tạp, bao gồm các giai đoạn xà phòng hóa trong điều kiện tránh oxi hóa, chiết tách và tinh chế qua các cột sắc ký bán điều chế sử dụng các chất nhồi là đất tẩy màu dùng cho sắc ký và đất silic dùng cho sắc ký, sau đó tạo màu và đo quang. Do tiến hành qua nhiều giai đoạn nên làm giảm độ chính xác, - Phương pháp sinh học [2, 7,12,13] [...]... trình chiết và quy trình sắc ký đã xây d ng ở trên để định lượng vitamin D trong syro Patarvit + Khảo sát tính chính xác của kết quả phân tích + Khảo sát tính đúng của kết quả phân tích Phương pháp nghiên cứu: Phương pháp nhiên cứu sử d ng trong khoá luận là sắc ký lỏng hiệu năng cao và chiết pha rắn (SPE), Tiến hành thực nghiệm để xây d ng quy trình chiết tối ưu và chương trình sắc ký phù hợp nhất Sau... tích, nó đã d n thay thế các phuofng pháp chiết lỏng- lỏng cổ điển Phương pháp chiết pha rắn sử d ng các cột được nhồi các chất rắn khác nhau, có cơ chế tưcmg tác giữa các chất phân tích với dung môi và pha rắn giống như trong sắc ký lỏng Do cơ chế chiết tách trên mà các chất pha rắn được sử d ng cũng giống như pha tĩnh trong sắc ký lỏng 1.2.1 Phân loại các kiểu chiết - Kiểu hấp phụ: Không cần pha liên... Kiểu sắc ký áp d ng + Cột tách sử d ng + Các điều kiện về pha động (thành phần, tỉ lệ, tốc độ d ng) + Bước sóng - Đánh giá chương trình sắc ký vừa xây d ng + Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký + Khảo sát sự tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của vitamin D + Khảo sát giới hạn phát hiện và giói hạn định lượng - Áp d ng định lượng vitamỉn D trong syro Patarvỉt + Sử d ng quy trình chiết. .. trạng thái rắn hay lỏng của pha tĩnh, người ta chia nó thành hai loại, nếu pha tĩnh là chất rắn ta có sắc ký lỏng -rắn (LSC), nếu pha tĩnh là chất lỏng ta có sắc ký lỏng- lỏng (LLC) - Căn cứ theo độ phân cực của pha tĩnh và pha động, có các loại: sắc ký pha thuận, sắc ký pha đảo, sắc ký pha đảo tạo cặp ion và sắc ký trao đổi ion - Căn cứ theo cấu trúc xốp của pha tĩnh là các hạt rắn, người ta chia nó thành... syro chứa: Vitamin Bl 2 mg Vitamin B2 1mg Vitamin B6 1mg Nicotinamid 5mg Vitamin A 1.000 UI Vitamin D 200UI Lysine 1 0 0 mg Hoá chất: - Chất đối chiếu vitamin D (d u 1 0 0 0 0 0 0 Ul/g) - Chất đối chiếu vitamin A (d u 1000.000 ưl/g) - Chất đối chiếu vitamin Bl, B2, B6 , pp - Methanol tinh khiết sắc ký - Acetonitril tinh khiết sắc ký - Nước cất - Hexan D ng cụ-thiết bị: - Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao. .. quy trình chiết + Lựa chọn dung môi để rửa sạch tạp và dung môi để rửa giải + Khảo sát thể tích dung môi để rửa sạch tạp mà vẫn không làm mất vitamin D + Khảo sát thể tích dung môi rửa giải để rửa giải hết vitamin D + Khảo sát lượng dung mồi để rửa sạch các vitamin còn lại trong cột để phục hồi cột - Xây d ng quy trình HPLC để phân tích Vitamin D Để xây d ng chương trình sắc ký thích họfp, chúng tôi... vạch Hút Iml dung d ch trên cho qua cột SPE đã được xử lý - Pha dung d ch vitamin D chuẩn - Pha dung d ch vitamin A chuẩn Khảo sát điều kiện rửa: Mục đích của chúng ta là làm sạch mẫu trứơc khi sắc ký Vậy phải chọn loại dung môi và thể tích dung môi phù hcfp để rửa hết các vitamin tan trong nước (Bl, B2, B6 , PP) trong khi không rửa trôi vitamin D Trong mẫu có một lượng lớn các vitamin tan trong nước... khoảng 0,lg d u vitamin D (1000.000 Ul/g) cho vào bình định mức 50 ml, hoà tan bằng methanol đến vạch ta được dung d ch chuẩn gốc nồng độ 2 0 0 0 Ul/ml Từ dung d ch chuẩn gốc trên pha loãng bằng methanol để được các dung d ch chuẩn có nồng độ vitamin D từ 40-240 Ul/ml Tiến hành chạy sắc ký lần lượt các dung d ch trên trong điều kiện sắc ký đã chọn ở trên Kết quả khảo sát độ tuyến tính của vitamin D được... trình sắc ký xẩy ra do các cơ chế : hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hoặc rây phân tử - Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột: Pha tĩnh là yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc ký và loại sắc ký Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ ta có sắc ký hấp phụ, nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion ta có sắc ký trao đổi ion, pha tĩnh là chất đã được gắn pha liên kết ta có sắc ký phân bố, nếu pha tĩnh... thử theo công thức: ^ ti St.Cc ScA _ = - Trong đó: H : Hàm lượng vitamin D (Ul/ml) Sc : Diện tích pic dung d ch chuẩn S t: Diện tích pic dung d ch thử Cc : Nồng độ dung d ch chuẩn (Ul/ml) Làm 3 lần để lấy giá trị trung bình Bảng 2.8 Kết quả định lượng syro Patarvit Mẫu chuẩn Mẫu thử Hàm lượng vitamin D trong syro Patarvit (Ul/ml) Diện tích píc: 135,126 Lần spic 1 197,117 36,50 2 193,224 35,78 . quy định định tính chứ không định lượng được vitamin D. Vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài " ;Nghiên cứu ứng d ng chiết pha rắn để định lượng vitamin D trong syro thuốc Patarvit bằng sắc ký. ký lỏng hiệu năng cao " vói các mục tiêu sau: • Nghiên cứu kỹ thuật chiết pha rắn để làm sạch và làm giàu vitamin D trong syro thuốc. • Xây d ng quy trình HPLC để định lượng vitamin D •. rắn ta có sắc ký lỏng -rắn (LSC), nếu pha tĩnh là chất lỏng ta có sắc ký lỏng- lỏng (LLC). - Căn cứ theo độ phân cực của pha tĩnh và pha động, có các loại: sắc ký pha thuận, sắc ký pha đảo, sắc