2.2.1. Khảo sát quá trình chiết:
Xử lý cột (luyện cột) : lần lượt cho qua cột 3ml methanol, 3ml nước, 5ml
methanol- nước (50:50).
Khảo sát điều kiện chiết:
- Pha dung dịch mẫu: tiến hành pha một dung dịch chuẩn có công thức cho mỗi 5 ml như sau:
Vitamin BI 2 mg Vitamin B2 1 mg Vitamin B6 1 mg Nicotinamid 5 mg Vitamin A 1.000 UI Vitamin D 1.000 UI
Cân chính xác khoảng 20mg Bl, lOmg B2, lOmg B6, lOmg dầu Vitamin D (1000.000 Ul/g), lOmg dầu Vitamin A (1000.000 Ul/g). Cho vào bình định mức 50 ml, hoà tan bằng methanol tuyệt đối rồi thêm methanol đến vạch.
Hút Iml dung dịch trên cho qua cột SPE đã được xử lý - Pha dung dịch vitamin D chuẩn.
- Pha dung dịch vitamin A chuẩn
Khảo sát điều kiện rửa:
Mục đích của chúng ta là làm sạch mẫu trứơc khi sắc ký. Vậy phải chọn loại dung môi và thể tích dung môi phù hcfp để rửa hết các vitamin tan trong nước (Bl, B2, B6, PP) trong khi không rửa trôi vitamin D.
Trong mẫu có một lượng lớn các vitamin tan trong nước gồm Bl, B2, B6, PP. Để rửa sạch các vitamin này ta lựa chọn nước, sau đó là methanol-nước (50:50).Tiến hành khảo sát thể tích nước và methanol- nước để loại hết các vitamin tan trong nước mà không mất vitamin D:
Rửa cột bằng lOml nước tinh khiết chia làm 5 phân đoạn, mỗi phân đoạn 2 ml. Hứng 5 phân đoạn này vào 5 cốc đánh số từ 1 đến 5, sau đó đem sắc ký. Kết quả: các vitamin Bl, B2, B6, pp đã được rửa sạch khỏi cột trong 4ml đầu (cốc số 1 và 2). Các vitamin A, D không bị rửa ra trong lOml nước, Kết quả được trình bày ở bảng 2.1 và hình 2.1, 2.2, 2.3
Bảng 2.1: Kết quả rửa cột bằng nước:
MI nước thứ Vitamin Bl, B2, B6, pp Vitamin A Vitamin D 1-2 + - - 3-4 + - - 5-6 - - - 7-8 - - - 9-10 - - -
Tiếp theo rửa cột bằng 5ml hỗn hợp methanol-nước (50:50), chia làm 5 phân đoạn, mỗi phân đoạn Iml, hứng vào 5 cốc khác nhau, sau đó đem sắc ký ở các bước sóng cực đại của A và D. Kết quả: vitamin A và D không bị rửa ra bằng 5ml methanol-nước (50:50) và không còn các vitamin tan trong nước trên cột.
Bảng 2.2: Rửa cột bằng methanol- nước (50:50)
Thể tích methanol-nước Vitamin A Vitamin D
5ml - -
Kết luận: Sau khi rửa bằng lOml nước và 5ml methanol-nước (50:50), các vitamin Bl, B2, B6, pp đã bị rửa sạch, vitamin D không bị mất mát và vitamin A vẫn còn trên côt.
-Khảo sát điêu kiện rửa giải:
Trên cột còn vitamin A và D. Phải chọn được dung môi và thể tích thích hợp để rửa giải được hết vitamin D mà không bị lẫn vitamin A trong đó. Chúng tôi lần lượt khảo sát về thể tích rửa giải vói methanol và acetonitril. Tiến hành rửa giải với từng ml dung môi, hứng vào các cốc khác nhau, sau đó đem sắc ký lần lượt ở hai bước sóng 265nm (cực đại hấp thu của vitamin D) và 330nm (cực đại hấp thu của vitamin A) để xác định thể tích rửa giải để rửa hết vitamin D. Kết quả được trình bày ở bảng 2.3.
Bảng 2.3: Khảo sát điều kiện rửa giải.
Mililit thứ Methanol Acetonitril D A D A LI L2 L3 Ll,2,3 LI L2 L3 Ll,2,3 1 + + + - + + + - 2 + + + - + + + - 3 4 + + + - _ + 5 6 ; - - - - - - - Kết luận:
Từ kết quả trên chúng tôi chọn methanol làm dung môi rửa giải và thể tích dùng là 3 ml. Với 3 ml methanol, toàn bộ lượng vitamin D đã được rửa giải trong khi đó vitamin A vẫn còn trong cột. Như vậy chúng tôi đã chiết riêng được vitamin D từ hỗn hợp ban đầu. Dịch rửa giải sẽ được cô cạn để làm giàu mẫu nếu cần thiết.
Rửa sạch vitamin A để phục hồi cột: rửa cột bằng 5 ml n-hexan, sau đó
Tóm lại: Từ những số liệu trên, chúng tôi đưa ra quy trình chiết cụ thể cho mẫu chứa vitamin D và hỗn hợp các vitamin khác có thành phần trên:
-X ửlý cột
- Qio mẫu qua cột
- Rửa cột bằng 10 ml nước
- Rửa cột bằng 5 ml hỗn hợp methanol- nước (50:50) - Rửa giải bằng 3 ml methanol
- Rửa phục hồi cột bằng 5 ml n-hexan và 10 ml methanol
Hình 2.3. Sắc ký đồ mẫu rửa bằng 2 ml nước thứ năm
Hình 2.4: sắc ký đồ mẫu chuẩn vitamin D (100 Ul.ml), Cột C18 (250 mm X
Hình 2.5: sắc ký đồ mẫu thử vitamin D (100 Ul.ml), Cột C18 (250 mm X 4 mm, 10 /Jm), tốc độ 1,5 ml/phút
2.2.2. Khảo sát hiệu suất chiết:
- Pha dung dịch chuẩn: cân chúứi xác khoảng 10 mg dầu vitamin D (1.000.000 Ul/g) tưcmg ứng với 10.000 UI, cho vào bình định mức 50.0 ml, hoà tan bằng methanol tuyệt đối đến vừa đủ thể tích. Hút chính xác 5ml cho vào bình định mức lOml rồi thêm methanol vừa đến vạch. Ta có dung dịch chuẩn với nồng độ vitamin D: 100 Ul/ml
- Hút chính xác 1 ml dung dịch chuẩn cho qua cột SPE đã được chuẩn bị rồi chiết theo quy trình đã đưa ra ở trên ta được 3 ml dịch rửa giải. Cô cạn dung môi bằng khí nitơ ở 40-60 c°. Hoà tan cắn trong 1 ml methanol ta được mẫu thử.
Đem cả mẫu chuẩn và mẫu thử tiêm sắc ký. Hiệu xuất chiết được tính dựa vào diện tích pic của mẫu chuẩn và mẫu thử. Làm 3 lần như trên rồi lấy kết quả trung bình.
Mẫu chuẩn Mẫu thử
Lần Diện tích pic Hiệu suất
Nồng độ; 100 Ul/ml 1 132,121 97,7%
Diện tích pic: 135,15 2 131,435 97,0%
3 129,825 96,8%
TB 97,2%
2.2.3 Lựa chọn điều kiện sắc ký
- Viamin D là chất không phân cực, qua tham khảo một số tài liệu chúng tôi chọn kiểu sắc ký pha đảo.
- Lựa chọn pha động: qua tham khảo tài liệu và bằng thực nghiệm chúng tôi lựa chọn pha động là methanol- ethyl acetat- nước tỷ lệ (90: 7: 3).
- Lựa chọn c ộ t: trong các loại cột pha đảo, chúng tôi chọn cột C18-loại cột dùng phổ biến ở nước ta.
- Lựa chọn bước sóng: chúng tôi lựa chọn bước sóng 265 nm là cực đại hấp thu của vitamin D.
- Lựa chọn tốc độ dòng: qua khảo sát chúng tôi lựa chọn tốc độ dòng: 1,5 ml/phút là phù hợp nhất để thu được pic có thời gian lưu vừa phải
Tóm lại:
Sau quá trình thực nghiệm, chúng tôi đã lựa chọn được các điều kiện sắc ký để định lượng vitamin D như sau:
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao
- Cột Lichrosorb RP18 (250x4 mm; 5 và lOịim) - Detector uv đặt ở bước sóng 265 nm.
- Pha động: methanol- ethyl acetat- nước (90: 7: 3). - Tốc độ dòng 1,5 ml/phút.
- Nhiệt độ phòng.
2.2.4. Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc kỷ
Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký bằng cách sử dụng dung dịch chuẩn, tiến hành tiêm lặp lại 6 lần. Kết luận về túứi thích hợp của hệ thống sắc ký dựa trên các giá trị sai số tưcmg đối về thòi gian lưu, diện tích pic, số đĩa lý thuyết và độ cân xứng của píc.
Pha dung dịch chuẩn; Cân chính xác khoảng 10 mg dầu vitamin D (1.0 0 0 .0 0 0 Ul/g) cho vào bình định mức 50 ml, hoà tan bằng methanol vừa đến vạch. Hút chính xác 5 ml dung dịch này cho vào bình định mức 10 ml rồi thêm methanol đến vạch. Ta được dung dịch chuẩn có nồng độ 100 Ul/ml. Lọc qua màng lọc 0,45 |0,m.
Tiến hành tiêm sắc ký lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn trên trong điều kiện đã chọn, ghi lại các giá trị về thời gian lưu, diện tích pic, số đĩa lý thuyết, hệ số đối xứng.
Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống được trình bày trorig các bảng 2.5, 2.6, 2.7.
Bảng 2.5: Giá trị trung bình của một sô'đại lượng đặc trưng
Sô đĩa lý thuyết Hê số cân xứng
Lần tiêm Thòi gian ỉưu (phút) Số liệu thống kê 1 4,873 jc = 4,802 5 -0 ,0 2 7 8% = 0,59% n=6 a-0,05 2 4,864 3 4,798 4 4,832 5 4,784 6 4,855
Bảng 2 J : Giá trị diện tích pic của vitamin D
Lần tiêm Diện tích pic Số liệu thống kê
1 135,624 x= 136,417 2 137,143 5 = 0,699 3 136,803 8% = 0,53% 4 135,820 n=6 5 136,043 a=0,05 6 137,221
Nhận xét: Từ kết quả cho thấy:
- Sai số tương đối của giá trị thời gian lưu và diện tích pic rất nhỏ. Giá trị các đại lượng đặc trưng như số đĩa lý thuyết, hệ số cân xứng đều trong giới hạn cho phép. Điều đó chứng tỏ hệ thống có tính thích hợp cao.
2.2.5. Khảo sát khoảng tuyến tính của phương pháp.
Chúng tôi tiến hành khảo sát sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ vói diện tích pic của vitamin D trên chuẩn vitamin D. Pha một dãy các dung dịch chuẩn vitamin D có nồng độ biến thiên từ: 40-240 Ul/ml
Tiến hành: Cân chính xác khoảng 0,lg dầu vitamin D (1000.000 Ul/g) cho vào bình định mức 50 ml, hoà tan bằng methanol đến vạch ta được dung dịch chuẩn gốc nồng độ 2 0 0 0 Ul/ml.
Từ dung dịch chuẩn gốc trên pha loãng bằng methanol để được các dung dịch chuẩn có nồng độ vitamin D từ 40-240 Ul/ml
Tiến hành chạy sắc ký lần lượt các dung dịch trên trong điều kiện sắc ký đã chọn ở trên. Kết quả khảo sát độ tuyến tính của vitamin D được trình bày ở bảng 2 .8
Bảng 2.8:Kết quả khảo sát độ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pỉc của vitamin D
Nồng độ vitamin D Diện tích pic
(Ul/ml) Khoảng nồng độ khảo sát:
40 52,814 4 0 -2 4 0 UI
80 108,742 Phương trình hồi quy:
1 2 0 162,224 y = l,359x - 0.8982
160 216,518 Hệ số tương quan: r = 0.9996
Hình 2.6: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích píc của vitamin D
- Nhận xét:
Trong khoảng biến thiên nồng độ từ 40-240 ưl/ml, diện tích pic thu được trên sắc ký đồ tỷ lệ thuận với nồng độ vitamin D với hệ số tưofng quan rất gần
1 (0,9996) chứng tỏ sự tương quan tuyến tính rất chặt chẽ giữa nồng độ và diện tích pic
2.2.6. Định lượng vitamin D trong syro Patarvit.
♦ Mẫu chuẩn:
Cân chính xác khoảng 10 mg dầu vitamin D (1000.000 Ul/g) cho vào bình định mức 50 ml. Hoà tan bằng methanol vừa đến vạch. Hút chính xác 5 ml cho vào bình định mức 10 ml rồi pha loãng bằng methanol vừa đến vạch ta được dung dịch chuẩn nồng độ 100 U.I/ml
♦ Mẫu thử:
- Hút chính xác 2 ml syro, pha loãng vói 3 ml methanol và 2 ml nước. Cho tất cả qua cột SPE C18 (200 mg X 2 ml) dưới áp suất hút chân không.
- Thổi khí nitơ để bốc hơi dung môi ở nhiệt độ 40-60 °c. Vì trong dịch rửa giải vẫn còn một it nước nên khi gần cạn thì thêm 1 ml aceton rồi tiếp tục bốc hơi hoàn toàn.
- Hoà tan cắn trong 0,5 ml methanol ta được mẫu thử đã được làm sạch và làm giàu 4 lần so với ban đầu.
Chuẩn bị và cho hệ thống sắc ký chạy ổn định với pha động trong khoảng 30 phút. Tiêm mẫu thử và mẫu chuẩn vào hệ thống sắc ký và tiến hành sắc ký trong điều kiện đã chọn . Hàm lượng vitamin D trong syro đựơc tính toán dựa vào diện tích pic của mẫu chuẩn và mẫu thử theo công thức:
^ _ St.Cc t i = ---
ScA
Trong đó:
H : Hàm lượng vitamin D (Ul/ml) Sc : Diện tích pic dung dịch chuẩn S t: Diện tích pic dung dịch thử
Cc : Nồng độ dung dịch chuẩn (Ul/ml) Làm 3 lần để lấy giá trị trung bình
Bảng 2.8. Kết quả định lượng syro Patarvit.
Mẫu chuẩn Mẫu thử Hàm lượng vitamin D trong syro Patarvit (Ul/ml)
Diện tích píc: Lần spic
135,126 1 197,117 36,50
2 193,224 35,78
3 197,612 36,96
VW1 «;v%velength=265 nm (HUNGXE^03003$i( tĩìAU - 1 2 - 10 - 8 - 6 - 4 - 1 2 - J L _ . ^ 0 - ■ ' 1 • ' • 1 ’ ’ ■ I 6 8 10 ... 1 ... 1 . ■. 1 .., 1 .,. ... 12 14 16 18 tnln
Hình 2 J. Sắc ký đồ mẫu chuẩn vitamin D (100 UI.ml), Cột C18
(250 mm X 4 mm, 5 ụm), tốc độ 1,5 ml/phút
Hình 2.8. Sắc ký đồ mẫu thử- Cột C18 (250 mm X 4 mm, 5 ụm),
tốc độ 1,5 ml/phút
2.2.7. Đánh giá độ chính xác
- Mẫu chuẩn: tiến hành tương tự cách pha dung dịch chuẩn trong định lượng ở trên. Dung dịch chuẩn có nồng độ 100 Ul/ml.
- Mẫu thử: tiến hành tương tự như phần định lượng. Làm 6 mẫu như vậy. Đem tiêm sắc ký mẫu chuẩn và các mẫu thử trong cùng điều kiện. Ghi lại diện tích các pic và tính hàm lượng vitamin D trong syro theo công thức:
St.Cc ScA
Bảng 2.9. Kết quả đánh giá độ chính xác của kết quả phân tích.
STT Hàm lượng (Ul/ml) Thống kê
1 36,45 a: =36,31 2 35,11 5=0,41 3 35,98 8% =1,18% 4 37,06 n=6 5 35,95 a=0,05 6 36,30 Nhận xét:
Ta thấy kết quả phân tích có sai số tương đối rất nhỏ chứng tỏ phương pháp có độ chính xác cao.
2.2.8. Đánh giá độ đúng bằng phương pháp thêm.
Thêm vào mẫu thử đã được xác định hàm lượng một lượng chính xác chất chuẩn sao cho tổng nồng độ của chúng vẫn nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát. Độ đúng của phương pháp được xác định từ tỉ lệ thu hồi của chất chuẩn thu được từ kết quả định lượng so vói lượng chất chuẩn thêm vào.
- Dung dịch chuẩn : Tiến hành tưcỉng tự như phần định lượng. Dung dịch chuẩn có nồng độ 100 Ul/ml
- Mẫu thử: Hút chính xác 2 ml syro, pha loãng với 3 ml methanol và 2 ml nước rồi thêm chính xác 0,5 ml dung dịch chuẩn. Khuấy đồng nhất rồi cho
qua cột SPE. Chiết theo quy trình đã nêu trên. Cô cạn dung môi rồi hoà tan cắn trong 1 ml methanol ta có mẫu thử. Làm 6 lần như vậy.
Đem tiêm sắc ký cả mẫu chuẩn và các mẫu thử trong cùng điều kiện. Tỉ lệ thu hồi của chất chuẩn được tính dựa trên diện tích píc và hàm lượng của mẫu chuẩn và mẫu thử theo công thức:
St.Cc T = - Sc - 2 . H 50 -.100 Trong đó: T : Tỷ lệ thu hồi (%) S t: Diện tích píc dung dịch thử Sc : Diện tích píc dung dịch chuẩn Cc : Nồng độ dung dịch chuẩn
H : Hàm lượng vitamin D trong syro Patarvit
Bảng 2.10: Kết quả đánh giá độ đúng bằng phương pháp thêm
STT Chuẩn thêm vào Chuẩn tìm thấy Tỷ lệ thu hồi (%) 1 50 48.6 97,2 2 50 48,8 97,6 3 50 47,9 95,8 4 50 48.5 97,0 5 50 48,3 96,6 6 50 48,7 97,4 x=96,8 8% = 0,71 % Nhận xét:
Từ kết quả ở bảng cho ta thấy tỷ lệ tìm lại của vitamin D đạt trung bình 96,8%. Như vậy phương pháp này có độ đúng cao.
2.2.9. Khảo sát giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng
Tiến hành thí nghiệm vói điều kiện HPLC đã chọn để định lượng vitamin D. Tiêm dung môi pha mẫu là methanol thu được sắc đồ của mẫu trắng (Hình 2.9), lấy độ lớn của nhiễu lớn nhất tại thời gian lưu của vitamin D là khoảng 10 phút (lấy từ 9 đến 11 phút) có pic nhiễu lớn nhất với diện tích khoảng 0,5
Thay giá trị Y = 0,5 vào phương trình hồi quy Y = 1,539X -0,898
Ta tính được Xo = (0,5 + 0,898)/l,539 = 2,59 Ul/ml Hiệu suất chiết đã khảo sát là 97,2 %, nên X sẽ là
X = 2,59/97,2x100 = 2,66 Ul/ml
- Giới hạn phát hiện được tính bằng 3 lần độ lớn của nhiễu
LOD = 2,66x3 = 7,99 Ul/ml;
- Giới hạn định lượng được tính bằng 10 lần độ lớn của nhiễu
LOQ = 2,66x10 = 26,6 uưm l
Sau đó tiến hành thí nghiệm tiếp tục: Pha dung dịch vitamin D chuẩn trong methanol có nồng độ bằng giới hạn định lượng, tiến hành đo diện tích