Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng cefuroxim trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

Để thực hiện được các nghiên cứu đánh giá SKD và TĐSH, một trong những nội dung quan trọng là xây dựng qui trình kỹ thuật chiết tách, xử lý mẫu và phân tích định lượng thuốc trong dịch s

B ộ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI • • • •

NGUYỄN THỊ LAN

NGHIÊN CỨU XÂY DựNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CEFUROXIM TRONG HUYÉT TƯƠNG BẰNG

SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

(KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP D ư ợ c SỸ KHÓA 2002

% ' X ^ W ' Y

Người hướng dẫn: PGS TS TRẦN TỬ

TS PHÙNG THỊ VINH "

Nơi thực hiện: TRƯNG TÂM ĐÁNH GIÁ TƯƠNG

ĐƯƠNG SINH HỌC - VIỆN KIÉM NGHIỆM THUỐC TRƯNG ƯƠNG

Thời gian thực hiện: 03/2007 - 05/2007

HÀ NỘI 05 / 2007

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới các thầy

cô và toàn thể cán bộ, nhân viên trong trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu

Đe hoàn thành luận văn này tôi xin chân thành bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Trần Tử An đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn này

Tôi xin tỏ lòng biêt ơn chân thành tới ban giám đốc Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương, TS Phùng Thị Vinh - Giám đốc trung tâm đánh giá tương đương sinh học Viện kiểm nghiệm thuốc và toàn thể cán bộ nhân viên trung tâm đã tận tình hướng dẫn, quan tâm tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài để hoàn thành luận văn này

Tôi xin tỏ lòng biết ơn tới những người thân trong gia đình, toàn thể bạn

bè động viên giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu

Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2007

Nguyễn Thị Lan

ĐẶT VẤN Đ Ê 1

PHẦN 1: TỎNG Q U A N 3

1.1: ĐẠI CƯƠNG VỀ CEFUROXIM 3

1.1.1: Cấu trúc hóa h ọ c 3

1.1.2: Tính chất vật l ý 3

1.1.3: Tác dụng dược lý 3

1.1.4: Dược động học 4

1.2: YÊU CẦU CỦA PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG THUỐC TRONG HUYẾT TƯƠNG .5

1.2.1: Yêu cầu chung 5

1.2.2: Các chỉ tiêu cần thẩm định 5

1.2.3 : Các phương pháp chiết tách thường dùng cho định lượng thuốc 8

trong huyết tương 8

1.3: ĐỊNH LƯỢNG CEFUROXIM TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG HPLC 11

1.3.1: Chương trình H P L C 11

1.3.2: Nhận xét và lựa chọn: 15

PHẦN 2: THựC NGHIỆM VÀ KÉT QUẢ 16

2.1: NGUYÊN - VẬT LIỆU DÙNG TRONG NGHIÊN c ứ u 16

2.1.1: Nguyên liệu, hóa chất, dung m ôi 16

2.1.2: Dụng cụ thiết b ị 16

2.1.3: Đối tượng nghiên cứu trong xây dựng và thấm định phương pháp phân tích 17

2.2: KẾT QUẢ THựC NGHIỆM VÀ NHẬN X É T 17

2.2.1: Nghiên cứu, xây dựng qui trình kỹ thuật 17

2.2.2 Thẩm định phương pháp phân tíc h 19

2.3 BÀN LUẬN 30

PHẦN 3: KÉT LUẬN VÀ ĐÈ X UẤT 32

3.1 KẾT LU Ậ N 32

3.2 ĐỀ XUẤT 33

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG, s ơ ĐỒ

Sơ đồ 1: Các bước xử lý mẫu bằng phương pháp chiết pha rắ n 9

Sơ đồ 2: Các bước xử lý mẫu bằng phương pháp chiết lỏng-lỏng 10

Sơ đồ 3: Các bước xử lý mẫu bằng phương pháp tạo tủ a 11

Bảng 1: Chương trình HPLC định lượng cefuroxim acetyl trong huyết tương 14

Bảng 2: Sự phụ thuộc giữa tỷ lệ diện tích pic chuẩn/chuẩn nội và nồng độ Cefuroxim chuẩn pha trong huyết tương 24

Bảng 3: Ket quả xác định giới hạn định lượng dưới 26

Bảng 4: Ket quả khảo sát độ đúng, độ lặp lại trong ngày 27

Bảng 5: Kết quả khảo sát độ đúng, độ lặp lại giữa các ngày 28

Bảng 6 : Kết quả khảo sát độ ổn định của Cefuroxim trong huyết tương 29

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1: sắc ký đồ mẫu huyết tương trắn g 20

Hình 2: sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng có chuẩn nội Acetanilid.21Hình 3: sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng có pha chuẩn nội và chuẩn

Cefuroxim (nồng độ 5 Ị4,g/mL) 21

Hình 4: sắc ký đồ huyết tương trước khi uống thuốc 22

Hình 5: sắc ký đồ huyết tương người sau khi uống viên Haginat 250 mg

1,5 giờ 22

Hình 6 Thông tin của pic Cefuroxim của mẫu chuẩn tự tạo pha trong

huyết tương 23

Hình 7: Đường biểu diễn sự phụ thuộc của tỷ lệ diện tích pic

chuẩn/chuẩn nội theo nồng độ Cefuroxim chuẩn pha trong huyết

tương 25

BẢNG VIỂT TẮT

HPLC High Performance Liquid Chromatography - Sac ký lỏng

hiệu năng cao

ĐẶT VẤN ĐÈ

Song song với sự phát triển của khoa học kỹ thuật và ngành công nghệ dược phẩm, lĩnh vực phân tích phục vụ cho công tác đảm bảo chất lượng thuốc cũng không ngừng lớn mạnh Nhu cầu về nghiên cứu sinh khả dụng (SKD), tương đương sinh học (TĐSH) cũng như tương đương điều trị ở Việt Nam ngày một tăng thêm Ket quả đánh giá SKD và TĐSH giúp các nhà sản xuất lựa chọn được công thức, kỹ thuật bào chế tối ưu tạo ra các sản phẩm thuốc chất lượng tốt, giúp các bác sỹ có thêm cơ sở để chọn thuốc thay thế hay hiệu chỉnh liều dùng cho phù hợp với từng bệnh nhân

Để thực hiện được các nghiên cứu đánh giá SKD và TĐSH, một trong những nội dung quan trọng là xây dựng qui trình kỹ thuật chiết tách, xử

lý mẫu và phân tích định lượng thuốc trong dịch sinh học ( máu, huyết tương, nước tiểu, ) Qúa trình phân tích thuốc trong dịch sinh học thường gặp nhiều khó khăn do khi thuốc sau khi vào cơ thể thường bị chuyển hóa tạo thành nhiều dẫn chất khác nhau, hơn nữa nồng độ thuốc trong các dịch sinh học thường rất thấp, môi trường dịch sinh học phức tạp Chính vì vậy, phương pháp phân tích phải được thẩm định rất chặt chẽ theo những qui định riêng để đảm bảo kết quả thực nghiệm đúng và chính xác

Hiện nay ở Việt Nam chưa có văn bản chính thức đánh giá tác dụng sinh học đối với các chế phẩm sản xuất trong nước, trong hồ sơ đăng ký thuốc chưa có yêu cầu cung cấp kết quả nghiên cứu về TĐSH Để ngành dược Việt Nam phát triển và hội nhập với các nước trên thế giới việc triển khai nghiên cứu TĐSH của thuốc có ý nghĩa về mặt khoa học và thực tế quản lý thuốc ở nước ta hiện nay nhằm nâng cao hiệu quả điều trị và khả năng cạnh tranh Trước nhu cầu đó chúng tôi lựa chọn đề tài:

“ Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng cefuroxim trong

huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao”

Đe tài nhằm giải quyết các mục tiêu:

❖ Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng cefuroxim trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao

♦> ứ n g dụng được phương pháp đã xây dựng để định lượng cefuroxim trong huyết tương người phục vụ cho nghiên cứu dược động học và đánh giá tương đương sinh học của chế phấm

Chúng tôi hy vọng rằng kết quả nghiên cứu này sẽ có giá trị thực tiễn cao, góp phần vào việc thúc đẩy ứng dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao

để định lượng các chất trong dịch sinh học nhằm phục vụ cho đánh giá tương đương sinh học của thuốc

cả vi khuan Gram dương và Gram âm.

1.1.4: Dược động học [3][11 ]

Sau khi uống, cefuroxim acetyl được hấp thu qua đường tiêu hóa và nhanh chóng bị thủy phân ở niêm mạc ruột và trong máu để giải phóng cefuroxim vào hệ tuần hoàn, gốc acetyl được chuyển hóa thành acetaldehyd

và acid acetic Thuốc được hấp thu tốt nhất trong bữa ăn Nồng độ đỉnh của cefuroxim trong huyết tương thay đổi tùy theo dạng viên hay dạng hỗn dịch Nồng độ đỉnh trong huyết tương của hỗn dịch uống đạt 71% nồng độ đỉnh trong huyết tương của thuốc viên Diện tích dưới đường cong (AUC) của hỗn dịch uống đạt 91% AƯC của thuốc viên Do đó thuốc viên và hỗn dịch uống cefuroxim acetyl không thể thay thế nhau theo tương quan mg/mg Ở người trưởng thành khi uống cefuroxim dạng viên nén 125mg, 250mg, 500 mg, lg ngay sau khi ăn thì đạt nồng độ đỉnh trong huyết tương sau 2 - 3 giờ lần lượt

là 2,1; 4,7; 7; 13,6 |ug/mL Sau 6 giờ giảm xuống còn 0,3; 0,7; 2,2; 3,4 |ig/mL.Muối natri được dùng theo đường tiêm bắp hoặc tiêm tĩnh mạch, ở người khỏe mạnh khi tiêm bắp liều 500mg, 750mg, lg thì sau 1 5 - 6 0 phút nồng độ đỉnh trong huyết tương đạt lần ỉượt 20,8 - 25,7; 26 - 34,9; 32 - 40|ug/mL Khi tiêm tĩnh mạch liều 500mg, lg nồng độ đỉnh trong huyết tương lần lượt là 2,1

và 3,6 |Lig/mL sau 4 giờ Khi tiêm tĩnh mạch liều 750mg nồng độ đỉnh trong huyết tương đạt 24|ig/mL sau 1 giờ tiêm và đạt 3,5|.Lg/mL sau 4 giờ tiêm

Có từ 33-50% cefuroxim trong hệ tuần hoàn liên kết với protein huyết tương Cefuroxim phân bố rộng khắp cơ thể kể cả dịch màng phổi, đờm, xương, hoạt dịch và thủy dịch Thể tích phân bố biểu kiến ở người lớn khỏe mạnh nằm trong khoảng từ 9,3-15,8 lít/l,73m2

Cefuroxim đi qua hàng rào máu não khi màng não bị viêm Thuốc qua nhau thai và có bài tiết qua sữa mẹ

ở người trưởng thành nửa đời thuốc trong huyết tương từ 1,2-1,6 giờ và kéo dài ở trẻ sơ sinh và người suy thận Cefuroxim không bị chuyển hóa và

được thải trừ ở dạng không biến đổi, khoảng 50% qua lọc cầu thận và 50% qua bài tiết ở ống thận Thuốc đạt nồng độ cao trong nước tiểu.

Sau khi tiêm, hầu hết liều sử dụng thải trừ trong vòng 24 giờ Probenecid

ức chế thải trừ cefiiroxim qua ống thận làm nồng độ trong huyết tương tăng cao và kéo dài hơn Cefuroxim chỉ thải trừ qua mật với lượng rất nhỏ

Nồng độ cefuroxim giảm khi bị thẩm tách

1.2: Yêu cầu của phương pháp định lượng thuốc trong huyết tương [4] [7] [20]

1.2.1: Yêu cầu chung

Đe đánh giá sinh khả dụng của thuốc, cần xác định được nồng độ của thuốc trong máu sau khi uống Do đó phương pháp lựa chọn phải được thẩm định và đánh giá về tính đặc hiệu, độ chính xác, độ đúng, giới hạn phát hiện

và giới hạn định lượng đối với từng hoạt chất do nồng độ của thuốc trong huyết tương thường rất thấp cỡ ng/mL hoặc |ig/mL

1.2.2: Các chỉ tiêu cần thẩm định

Đánh giá phương pháp phân tích theo các chỉ tiêu qui định của Dược điến

áp dụng cho các phép phân tích trong dịch sinh học Những chỉ tiêu bao gồm:

❖ Tính đặc hiệu của phương pháp

♦> Đường chuẩn và khoảng tuyến tính

Độ đúng, độ lặp lại trong ngày và giữa các ngày

❖ Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

❖ Độ ổn định của mẫu phân tích

> Tính đặc hiệu của phương pháp:

Tính đặc hiệu của phương pháp là khả năng đánh giá chất cần phân tích khi có mặt các chất khác có thể là tạp chất, hoặc các thành phần cản trở khác Phương pháp phân tích có khả năng nhận diện chất cần phân tích và không bị nhầm lẫn bởi các chất khác

Trong phân tích dịch sinh học, phương pháp phải chứng minh được chất xác định là dược chất hay chất chuyển hóa có tác dụng Phân tích mẫu không

bị ảnh hưởng bởi các chất nội sinh và chất chuyển hóa liên quan

Bằng thực nghiệm, điều chỉnh và lựa chọn các điều kiện xử lý mẫu, định lượng sao cho pic của cefuroxim trên sắc đồ thu được phải nằm riêng rẽ, tách riêng với các pic tạp khác có trong mẫu huyết tương

Báo cáo kết quả phải bao gồm cả sắc kí đồ của mẫu trắng (dịch sinh học), mẫu chất chuẩn pha trong dịch sinh học và mẫu thử thu được sau khi dùng thuốc

'r Đường chuẩn và khoảng tuyến tỉnh:

Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa đáp ứng của phương pháp đo (diện tích hay chiều cao pic trong sắc ký, mật độ quang trong quang phổ ) với nồng độ của chất phân tích trong dịch sinh học Mối quan hệ này phải được đánh giá bằng phương trình hồi qui, thu được bằng phương pháp phân tích hồi qui ( phương pháp bình phương nhỏ nhất)

Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ từ thấp nhất đến cao nhất trong một đường chuẩn có đáp ứng tuyến tính Trong khoảng này, phép phân tích phải thỏa mãn các yêu cầu về độ đúng và độ chính xác theo qui định

Đường chuẩn nên có ít nhất 5 nồng độ của chất chuẩn pha trong cùng một mẫu sinh học Khoảng tuyến tính phải bao gồm toàn bộ nồng độ của các mẫu cần phân tích Không xác định nồng độ mẫu thử dựa trên điểm ngoại suy của khoảng tuyến tính Nồng độ thấp nhất là giới hạn định lượng, thông thường phải bằng 1/20- 1/10 giá trị c max Trong khoảng nồng độ cần khảo sát, đường chuẩn phải tuyến tính và có hệ số tuyến tính R2 > 0,98

Đường chuấn phải đáp ứng các điều kiện sau:

S Độ lệnỊ) so với giá trị thực của các nồng độ phải <15%, trừ điểm X

gần LLOQ được chấp nhận < 20%

s Có ít nhất 4/6 điểm chuẩn đạt được tiêu chuẩn trên, bao gồm cả LLOQ và nồng độ cao nhất.

Gía trị đánh giá sự phù hợp của kết quả phân tích với giá trị thực của mẫu

đã biết Điều đó có thể được biểu thị bằng hệ số thu hồi, thường cho phép trong khoảng 85-115%, nhưng có thể chấp nhận 80-120% đối với điểm gần giới hạn định lượng

Độ đúng cũng cần xác định ít nhất ở 2 khoảng nồng độ thấp nhất và cao nhất

Đánh giá mức độ phân tán của các phép thử song song Độ chính xác được xác định cùng lúc bằng cách sử dụng 3 nồng độ của mẫu cần kiểm tra, một nồng độ gần với giới hạn nhỏ nhất của phương pháp định lượng (LOQ), một nồng độ gần với điểm giới hạn trên của đường chuẩn và một nồng độ ở gần điểm giữa đường chuẩn Mỗi nồng độ phải được xác định trên ít nhất 5 mẫu

Độ chính xác có thể được biểu thị là độ lệch chuẩn tương đối (RSD)trong ngày và giữa các ngày, được xác định trên mẫu đối chứng RSD khoảng15%, riêng điểm gần giới hạn định lượng cho phép không vượt quá 20%

'r Giới hạn định lượng dưới (LLOQ):

Là nồng độ thấp nhất của chất phân tích có thể xác định được với độ đúng

và độ chính xác cho phép

Mầu chuẩn có nồng độ thấp nhất trên đường chuẩn được chấp nhận là LLOQ nếu thỏa mãn:

s Đáp ứng ở LLOQ ít nhất phải bằng 5 lần đáp ứng của mẫu trắng

s Pic của chất cần phân tích có thể nhận biết, nằm tách riêng và có

thể tái lập với độ chính xác từ 8 0 - 120 %.

> Độ ổn định của mẫu thử

Độ ổn định của mẫu phân tích trong dịch sinh học cần được đánh giátrong lúc lấy mẫu, xử lý và bảo quản

Trong thấm định phương pháp phân tích cần xác định các loại độ on định sau

- Độ ổn định của dung dịch chuẩn gốc, nội chuẩn gốc bao gồm: độ ổn định ở điều kiện nhiệt độ phòng, độ ổn định ở điều kiện bảo quản dài ngày, độ

ổn định của dung dịch pha loãng (nếu cần)

- Độ ổn định của mẫu huyết tương bao gồm:

+ Độ ổn định sau 3 chu kỳ để đông - rã đông

+ Độ ổn định thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng

+ Độ ổn định thời gian dài để đông lạnh trong khoảng thời gian dự định

1.2.3: Các phương pháp chiết tách thường dùng cho định lượng thuốc trong huyết tương (6)

Có 3 phương pháp xử lý mẫu hay được sử dụng với các mẫu dịch sinh học: tủa protein với dung môi hữu cơ hoặc acid, chiết lỏng - lỏng và chiết pha rắn, tùy thuộc vào điều kiện của từng phòng thí nghiệm và đặc điểm của chất phân tích để lựa chọn phương pháp phù họp

’> Phương pháp chiết pha rắn (rắn-lỏng): Đây là một kỹ thuật

chiết xuất theo cơ chế liên kết - rửa giải hoặc hấp phụ - giải hấp Lựa chọn cột (chất liên kết) thích hợp, dung môi rửa giải, dung môi loại tạp phù hợp để áp dụng vào qui trình chiết, phương pháp này ít được dùng phần lớn do giá thành, nhưng mức độ tinh khiết của dịch chiết cao

Mau thử (1- 2mL)

Cột chiết thích hợp

Loại tạp băng dung môi thích hợp

ị

Làm khô (hút chân không 5 phút)

Rửa giải bằng dung môi thích hợp

ị

Bốc hơi dịch rửa giải ( Nhiệt độ/ khí trơ)

ị

Hòa tan cắn / pha động, lọc, tiêm sắc ký

Sơ đồ 1: Các bước xử lỷ mẫu bằng phương pháp chiết pha rắn

> Phương pháp chiết xuất lỏng-lỏng:

Chiết lỏng - lỏng trong phân tích dịch sinh học thường dùng một dung môi ít tan trong nước để chiết chất phân tích từ mẫu huyết tương Kỹ thuật này tuy phải dùng nhiều dung môi nhưng gía thành thấp nên được dùng nhiều ở nước ta

Hòa tan cắn trong pha động, lọc, tiêm sắc ký

Sơ đồ2:Các bước xử lý mẫu bằng phương pháp chiết lỏng-lỏng

đây là phương pháp đơn giản, không đòi hỏi trang thiết bị hiện đại, thời gian chiết nhanh nên được chọn để xử lý mẫu trong giai đoạn thăm dò phương pháp phân tích Các tác nhân gây tủa protien thường được sử dụng trong quá trình xử lý mẫu bao gồm: acid, dung môi hữu cơ hoặc muối:

> Tủa bằng acid: Đơn giản, phù hợp với các dược chất bền

trong môi trường acid, dễ tan trong nước, khó chiết bằng dung môi hữu

cơ Tác nhân gây tủa thường được sử dụng là acid tricloracetic, trifloracetic, acid percloric với nồng độ thông thường khoảng 5 - 10%

'> Tủa bằng dung môi hữu cơ: Khảo sát với 2 loại dung môi:

methanol, acetonitril với các tỷ lệ khác nhau

> Tủa bằng muối: amoni sulfat khan

> Phương pháp loại protein: Khảo sát tỷ lệ các chất tạo tủa,

Mầu thử (lmL)

Ly tâm Ly tâm Ly tâm

Ỷ

Sơ đô 3: Các bước xử lỷ mâu băng phương pháp tạo tủa

1.3: Định lượng cefuroxim trong huyết tương bằng HPLC

1.3.1: Chương trình HPLC (9) (6) (4)

Đe định lượng các chất trong dịch sinh học (huyết tương, mô, nước tiểu), thường sử dụng các phương pháp phân tích hóa lý ( điện di mao quản, sắc ký khí, sắc ký lỏng, ) Đối với một số hoạt chất có tác dụng dược lý đặc hiệu có thể định lượng bằng phương pháp vi sinh ( một số chất kháng sinh/kháng khuẩn) hoặc phương pháp miễn dịch đặc hiệu So với các phương pháp vi sinh, miễn dịch; phương pháp phân tích hóa lý có phạm vi ứng dụng rộng hơn

và thường cho kết quả ổn định và dễ triển khai hơn Trong các phương pháp phân tích hóa lý, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) thường được sử dụng trong nghiên cứu SKD và TĐSH Các phương pháp thường được lựa chọn giới thiệu: sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector tử ngoại, huỳnh quang, điện hóa, khối phổ Tuy nhiên việc ứng dụng các phuơng pháp này còn tùy thuộc vào trang thiết bị hiện có của phòng thí nghiệm Việt Nam Phương pháp HPLC dùng để tách và định lượng các thành phần trong hỗn hợp dựa trên ái lực khác nhau giữa các chất với 2 pha luôn tiếp xúc nhưng không hòa lẫn vào nhau: pha tĩnh và pha động Khi dung dịch của hỗn hợp các chất cần phân tích được tiêm vào cột sắc ký, chúng sẽ được hấp phụ hoặc liên kết với pha tĩnh

tùy thuộc bản chất hạt nhồi và chất cần phân tích Khi bơm dung môi pha động qua cột thì tùy thuộc vào ái lực của các chất với 2 pha, chúng sẽ di chuyển qua cột với vận tốc khác nhau dẫn đến sự phân tách Các chất sau khi

đi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bởi detector và được chuyển qua bộ phận xử

lý kết quả Sau đây là một số chương trình HPLC định lượng cefuroxim trong huyết tương

STT Côt • Pha động

Toe do •dòng(ml/phút)

Giới han •ĐL

Thời gian lưu (phút)

DetectorUV(nm)

Chuẩn nôi •

1(16) LC-18DB 150x4.6 mm,

5|im

Acetonitril 10% trong hệ đệm phosphat(pH=3)

2(15) BeckmanUltrasphere ODS

150x4.6 mm, 5|im

MeCN:đệm phosphat 50mM 10:90

150x4.7mm, 5|im

MeOH:Tetrabutylamonium 20mM và KH2P 0 4 23:77

1.3.2: Nhận xét và lựa chọn:• • •

Mục tiêu của đề tài là xây dựng qui trình định lượng cefuroxim trong huyết tương người bằng phương pháp HPLC nên các chỉ tiêu được ưu tiên lựa chọn là:

❖ Môi trường thử: Máu người

❖ Detector: Lựa chọn detector ƯV, áp dụng khi phân tích các chất có giới hạn định lượng cỡ Ịig /m L phù hợp với trường hợp cefuroxim

❖ Giới hạn định lượng: Càng nhỏ càng tốt vì nồng độ thuốc trong dịch thường rất thấp, lượng mẫu thử ít (l-2mL)

♦> Thời gian lưu: càng ngắn càng tốt

♦> Pha động: yêu cầu hóa chất phải thông dụng dễ pha, thích hợp với pha tĩnh

❖ Cột: Ưu tiên sử dụng cột pha đảo, thích họp với phòng thí nghiệm ở nước ta

PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

2.1: NGUYÊN - VẬT LIỆU DÙNG TRONG NGHIÊN c ứ u

2.1.1: Nguyên liệu, hóa chất, dung môi

> Chất chuẩn và nội chuẩn (IS):

+ Cefuroxim (CFX) - Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương; hàm

lượng: 95,15 (tính theo khan), độ ẩm: 2,51%, SKS: 0105175, bảo quản 5°c

tránh ánh sáng

+Acetanilid (ACE) - Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương; chất chuẩn

làm việc, hàm lượng 100%

> Dung môi, hóa chất

Hóa chất, dung môi đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích (PA) dùng

trong chiết tách và chạy sắc ký

s Methanol, acetonitril loại chạy sắc ký

s Acid percloric, acid phosphoric