Định lượng đồng thời paracetamol, chlorpheniramine maleate và phenylephrine hydrochloride trong thuốc decolgen forte bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao và phương pháp quang phổ hấp thụ phâ

Sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử dùng phổ toàn phần kết hợp với kỹ thuật tính toán và ứng dụng phần mềm máy tính đã được nghiên cứu v

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NGUYỄN HỮU TRUNG

ĐI ̣NH LƯỢNG ĐỒNG THỜI PARACETAMOL, CHLORPHENIRAMINE MALEATE VÀ

PHENYLEPHRINE HYDROCHLORIDE TRONG THUỐC DECOLGEN FORTE BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO VÀ PHƯƠNG PHÁP

QUANG PHỔ HẤP THỤ PHÂN TỬ

Chuyên ngành: Hóa phân ti ́ch

Mã số: 60.44.01.18

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC VẬT CHẤT

Hướng dẫn khoa học: PGS.TS MAI XUÂN TRƯỜNG

THÁI NGUYÊN - NĂM 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này

là trung thực và chưa hề được sử dụng trong bất cứ mô ̣t công trình nào Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm

ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc

Thái Nguyên, tháng 06 năm 2016

Tác giả luận văn

NGUYỄN HỮU TRUNG

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và thực hiện luận văn tác giả đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, động viên và giúp đỡ của các thầy giáo, cô giáo, bạn bè và gia đình

Tác giả bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: Khoa Hóa ho ̣c, Phòng Đào tạo - Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên, các thầy cô giáo tham gia giảng dạy đã cung cấp những kiến thức giúp tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Tác giả xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo PGS.TS Mai Xuân Trường người đã tận tình hướng dẫn chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu, thực hiện và hoàn thành luận văn

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè và đồng nghiệp những người đã luôn bên tôi, động viên và khuyến khích tôi trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu của mình

Với khối lượng công việc lớn, thời gian nghiên cứu có hạn, khả năng nghiên cứ u còn ha ̣n chế, chắc chắn luận văn không thể tránh khỏi những thiếu sót Tác giả rất mong nhận được các ý kiến đóng góp từ thầy giáo, cô giáo và bạn đọc

Xin chân thành cảm ơn !

Thái Nguyên, tháng 6 năm 2016

Tác giả

Nguyễn Hữu Trung

MỤC LỤC

Trang

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục các từ viết tắt của luận văn iv

Danh mục các bảng của luận văn v

Danh mục các hình của luận văn vi

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 2

1.1.1 Khái niệm và nguyên tắc của phương pháp HPLC 2

1.1.2 Một số đại lượng đặc trưng trong phân tích sắc ký 3

1.1.3 Hệ thống máy HPLC 6

1.1.4 Pha tĩnh 7

1.1.5 Pha động 7

1.2 Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử 8

1.2.1 Định luật Bughe - Lămbe – Bia 8

1.2.2 Định luật cộng tính 9

1.2.3 Phương pháp lọc Kalman ……… 10

1.3 Tổng quan về các chất phân tích trong thuốc Decolgen forte 11

1.3.1 Paracetamol 11

1.3.2 Phenylephrine hydrochloride 12

1.3.3 Chlorpheniramine maleate 12

1.4 Kết quả xác định một số chất theo phương pháp HPLC và theo phương pháp UV-Vis 13

1.4.1 Một số kết quả xác định thành phần theo phương pháp quang phổ

hấp thụ phân tử 13

1.4.2 Một số kết quả xác định thành phần theo phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 16

Chương 2 THỰC NGHIỆM 23

2.1 Đối tượng nghiên cứu 23

2.2 Phương pháp nghiên cứu 23

2.2.1 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 23

2.2.2 Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử 24

2.3 Phương pháp xử lý số liệu 25

2.3.1 Các phương pháp để xử lý kết quả phân tích 25

2.3.2 Các đại lượng đặc trưng để xử lý kết quả phân tích 25

2.4 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 27

2.4.1 Thiết bị 27

2.4.2 Dụng cụ 27

2.4.3 Hóa chất 27

2.4.4 Chế phẩm thuốc Decolgen forte 28

2.5 Chuẩn bị các dung môi để hòa tan mẫu 28

2.6 Chuẩn bị các dung dịch chuẩn cho phương pháp HPLC 28

2.7 Chuẩn bị dung dịch thuốc Decolgen forte cho phương pháp HPLC 30

2.8 Chuẩn bị các dung dịch chuẩn cho phương pháp UV-Vis 30

2.9 Chuẩn bị dung dịch thuốc Decolgen forte cho phương pháp UV-Vis 31 Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 31

3.1 Phương pháp HPLC 32

3.1.1 Xây dựng điều kiện để xác định đồng thời 3 chất PRC, CPM và PNH 32

3.1.2 Đánh giá phương pháp định lượng 36

3.2 Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử 43

3.2.1 Khảo sát phổ hấp thụ phân tử của paracetamol, chlorpheniramine maleate và phenylephrine Hydrochloride 44

3.2.2 Khảo sát sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của PRC, CPM và PNH vào môi trường các axit ở giá tri ̣ pH khác nhau……… 46

3.2.3 Khảo sát sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của PRC, CPM và PNH theo thời gian 47

3.2.4 Khảo sát sự phụ thuộc độ hấp thụ quang của PRC, CPM và PNH theo nhiệt độ 48

3.2.5 Khảo sát khoảng tuyến tính tuân theo định luật Bughe – Lambe – Bia của PRC, CPM và PNH Xác định chỉ số LOD và LOQ 50

3.2.6 Khảo sát và đánh giá độ tin cậy của phương pháp nghiên cứu trên các mẫu tự pha 57

3.2.7 Xác định hàm lượng PRC, CPM và PNH trong thuốc Decolgen forte và đánh giá độ đúng của phép phân tích theo phương pháp thêm chuẩn 64

KẾT LUẬN 67

TÀI LIỆU THAM KHẢO 69

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CỦA LUẬN VĂN

Clopheninamin maleat Chlorpheniramine maleate CPM Phenylephin hidrocloric Phenylephrine hydrochloride PNH

Sắc ký lỏng hiệu năng cao High Performance Liquid

DANH MỤC CÁC BẢNG CỦA LUẬN VĂN

Bảng 3.1 Giá trị các đại lượng đặc trưng 36

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát thời gian lưu 36

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát diện tích pic 37

Bảng 3.4 Mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của PRC, CPM và PNH 38

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát độ lặp lại 41

Bảng 3.6 Kết quả phân tích thuốc Decolgen forte 43

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát độ đúng 42

Bảng 3.8 Kết quả đô ̣ hấp thu ̣ quang tại thời điểm 30 phút sau khi pha của PRC, CPM và PNH ở các giá tri ̣ pH 46

Bảng 3.9 Sự phu ̣ thuô ̣c độ hấp thụ quang theo thời gian 47

Bảng 3.10 Sự phu ̣ thuô ̣c độ hấp thụ quang theo nhiệt độ 49

Bảng 3.11 Đô ̣ hấp thu ̣ quang của dung dịch PRC ở các giá tri ̣ nồng độ 50

Bảng 3.12 Kết quả xác đi ̣nh LOD và LOQ của PRC 52

Bảng 3.13 Sự phu ̣ thuô ̣c đô ̣ hấp thu ̣ quang của CPM theo nồng độ 53

Bảng 3.14 Kết quả tính LOD và LOQ của CPM 54

Bảng 3.15 Sự phu ̣ thuô ̣c đô ̣ hấp thu ̣ quang của PNH theo nồng độ 55

Bảng 3.16 Kết quả tính LOD và LOQ của PNH 57

Bảng 3.17 Pha chế các dung di ̣ch hỗn hợp PRC và CPM 57

Bảng 3.18 Kết quả tính nồng đô ̣, sai số của PRC và CPM trong hỗn hợp 58

Bảng 3.19 Pha chế các dung di ̣ch hỗn hợp PRC và PNH 59

Bảng 3.20 Kết quả tính nồng đô ̣, sai số của PRC và PNH trong hỗn hợp 60

Bảng 3.21 Pha chế các dung di ̣ch hỗn hợp CPM và PNH 61

Bảng 3.22 Kết quả tính nồng đô ̣, sai số của CPM và PNH trong hỗn hợp 62

Bảng 3.23 Pha các dung dịch chuẩn PRC, CPM, PNH và hỗn hợp 63

Bảng 3.24 Kết quả tính nồng đô ̣, sai số của PRC, CPM và PNH 63

Bảng 3.25 Kết quả tính nồng độ, sai số PRC, CPM và PNH trong mẫu thuốc Decolgen forte 65

Bảng 3.26 Kết quả xác định độ thu hồi của PRC, CPM và PNH trong mẫu thuốc Decolgen forte 66

DANH MỤC CÁC HÌNH CỦA LUẬN VĂN

Hình 1.1.Thờig ian lưu của cấu tử phân tích 3

Hình 1.2 Sơ đồ hệ thống máy HPLC 6

Hình 1.3 Hình ảnh máy HPLC trong phòng thí nghiệm 6

Hình 1.4 Mô hình hoạt động của bộ lọc Kalman 10

Hình 2.1 Chế phẩm thuốc Decolgen forte 28

Hình 3.1 Sắc kí đồ của PRC (500 µg/mL) 34

Hình 3.2 Sắc kí đồ của CPM (4 µg/mL) 34

Hình 3.3 Sắc kí đồ của PNH (10 µg/mL) 35

Hình 3.4 Sắc kí đồ của PRC (3), CPM (2) và PNH (1) 35

Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của PRC 39

Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của CPM 39

Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của PNH 40

Hình 3.8 Phổ hấp thụ quang của các dung dịch chuẩn PRC(1), CPM(2) và PNH(3) 45

Hình 3.9 Sự phụ thuộc độ hấp thụ quang theo thời gian 48

Hình 3.10 Sự phu ̣ thuô ̣c đô ̣ hấp thu ̣ quang theo nhiê ̣t đô ̣ 49

Hình 3.11 Phổ hấp thụ quang của PRC ở các nồng độ 1,0 50,0 g/mL 50

Hình 3.12 Đường hồi quy tuyến tính biểu diễn sự phu ̣ thuô ̣c của đô ̣ hấp thu ̣ quang vào nồng đô ̣ của PRC 51

Hình 3.13 Phổ hấp thụ quang của CPM ở các nồng độ 150 g/mL 52

Hình 3.14 Đường hồi quy tuyến tính biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ quang vào nồng độ CPM 53

Hình 3.15 Phổ hấp thụ quang của PNH ở các nồng độ 1,0 50,0 g/mL 55

Hình 3.16 Đường hồi quy tuyến tính biểu diễn sự phu ̣ thuô ̣c của đô ̣ hấp thu ̣ quang vào nồng đô ̣ PNH 56

MỞ ĐẦU

Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của khoa học kỹ thuật, ngành công nghệ dược phẩm cũng phát triển một cách nhanh chóng Các nhà sản xuất dược phẩm đã áp dụng nhiều phương thức sản xuất và chế biến tiên tiến để tổng hợp ra nhiều loại dược phẩm có tính năng vượt trội Nhiều loại thuốc hỗn hợp như cảm cúm, hạ sốt, nhức đầu, ho… Với những thành phần khác nhau ngày càng được sản xuất và sử dụng rộng rãi ở nước ta Việc định lượng các hoạt chất trong các loại thuốc hỗn hợp theo tiêu chuẩn của nhà sản xuất là rất quan trọng vì chỉ cần thay đổi một lượng nhỏ thành phần hoạt tính của thuốc cũng có thể ảnh hưởng đến sức khỏe của hàng nghìn, hàng triệu người Do đó

để đánh giá đúng chất lượng sản phẩm một cách nhanh chóng, chính xác, an toàn và hiệu quả thì công tác kiểm nghiệm để xác định các thành phần của thuốc bằng các phương pháp hiện đại có độ chính xác cao ngày càng được quan tâm Nhiều phương pháp có độ lặp và độ chính xác cao đã được ứng dụng Sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, phương pháp quang phổ hấp thụ

phân tử dùng phổ toàn phần kết hợp với kỹ thuật tính toán và ứng dụng phần

mềm máy tính đã được nghiên cứu và cho nhiều ưu điểm như độ nhạy, độ lặp,

độ chính xác, độ tin cậy của phép phân tích cao, phân tích nhanh, tiện lợi

Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi chọn đề tài: "Định lượng đồng thời paracetamol, Chlorpheniramine maleate và Phenylephrine hydrochloride trong thuốc Decolgen forte bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao và phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử "

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

HPLC là chữ viết tắt của 04 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography) trước kia gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography) Phương pháp này ra đời từ năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển Hiện nay phương pháp HPLC ngày càng phát triển và hiện đại hoá cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích Hiện nay nó được áp dụng rất lớn trong nhiều ngành kiểm nghiệm đặc biệt là ứng dụng cho ngành kiểm nghiệm thuốc Máy HPLC hiện là công cụ đắc lực trong phân tích các thuốc đa thành phần cho phép định tính và định lượng

1.1.1 Khái niệm và nguyên tắc của phương pháp HPLC

1.1.1.1 Khái niệm

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hoá học với các nhóm chức hữu cơ Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay phân loại theo kích cỡ (Rây phân tử)

1.1.2 Một số đại lượng đặc trưng trong phân tích sắc ký

1.1.2.1 Hệ số phân bố

Trong quá trình sắc ký luôn có sự phân bố của chất tan giữa pha động

và pha tĩnh Sự phân bố này đặc trưng bởi cân bằng phân bố với hệ số phân bố được tính theo công thức sau:

K = (1.1)

trong đó: K là hệ số phân bố

là nồng độ của chất phân tích tương ứng trong pha tĩnh

và pha động ở thời điểm cân bằng

1.1.2.2 Thời gian lưu và thể tích lưu

Thời gian lưu của một chất là thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi chất đó ra khỏi cột đạt giá trị nồng độ cực đại và cho ra pic trên sắc ký đồ

Nếu gọi tRlà thời gian lưu trữ của một

chất thì:tR, = tR - t0

trong đó: tR, là thời gian lưu thực

(thời gian lưu hiệu chỉnh)

t o là thời gian chết (thời gian không lưu

trữ)

Trong cùng một điều kiện sắc ký đã chọn, thời gian lưu của mỗi chất là hằng định và các chất khác nhau thì thời gian lưu khác nhau tùy thuộc vào bản chất, cấu tạo vào tính chất của chất đó Vì vậy thời gian lưu là đại lượng định tính các chất Khi pha động chảy qua cột với một tốc độ không đổi thì thời gian lưu có thể thay thế bằng thể tích lưu Thể tích lưu là thể tích pha động thu được sau cột trong khoảng thời gian tương ứng với thời gian lưu

Hình 1.1 Thời gian lưu của cấu tử phân tích

1.1.2.3 Thừa số dung lượng

k’ = K S

M

V

V = (1.2)

trong đó :V S , V M là thể tích của pha tĩnh và pha động lúc cân bằng

k’ là thừa số dung lượng Nếu k’→ 0 thì t R → t 0 chất ra rất nhanh và cột không có khả năng giữ chất lại Nếu k’ lớn thì t R lớn chất ở trong cột lâu thời gian phân tích lâu mũi pic có khả năng tù và k’ lý tưởng là từ 2 - 5

1.1.2.5 Số đĩa lý thuyết và chiều cao đĩa lý thuyết

Hiệu lực cột thường biểu thị qua hai thông số: Số đĩa lý thuyết (N) hoặc chiều cao đĩa lý thuyết (H) Cột sắc ký được coi như có N tầng lý thuyết, ở mỗi tầng sự phân bố chất tan vào 2 pha lại đạt đến một trạng thái cân bằng mới Mỗi tầng được giả định như một lớp pha tĩnh có chiều cao H Đĩa lý thuyết được định nghĩa như một khu vực của hệ thống phân tách mà trong

đó thiết lập một cân bằng nhiệt động giữa nồng độ trung bình của chất tan trong pha tĩnh và trong pha động

- Số đĩa lý thuyết N được tính theo các công thức:

N = 16× hoặc 5,54×

(1.4) trong đó: W là chiều rộng pic ở đáy pic

là chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của pic

- Chiều cao của đĩa lý thuyết được tính theo công thức:

H=

N

L (1.5)

trong đó: L là chiều cao cột sắc kí

H là chiều cao đĩa lý thuyết

Với một điều kiện sắc ký nhất định, chiều cao đĩa lý thuyết (H) và số đĩa lý thuyết (N) là hằng định đối với mỗi chất phân tích

1.1.2.6 Độ phân giải ( R S )

Độ phân giải là đại lượng biểu thị độ tách của các chất ra khỏi nhau trong điều kiện sắc ký đã cho Độ phân giải của hai pic cạnh tranh được tính theo công thức sau:

trong đó: , là thời gian lưu tương ứng của chất A, chất B

, là chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao pic của chất A, chất B , là chiều rộng pic ở đáy pic

trong đó: WX là độ rộng đáy pic đo ở 1/20 chiều cao của pic

A là khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ cực đại của pic đến chân đường cong phía trước ở tại 1/20 chiều cao của pic

1.1.2.8 Phương trình Van – Deemter

- Bơm cao áp: đẩy pha động qua cột sắc ký

- Bộ tiêm mẫu: tiêm vào cột một thể tích mẫu nhất định

1.1.4 Pha tĩnh

1.1.4.1 Khái niệm

Pha tĩnh là chất nhồi cột để làm nhiệm vụ tách 1 hỗn hợp chất phân tích Nó là những chất rắn, xốp, kích thước hạt rất nhỏ, đường kính cỡ hạt từ 3-10m, diện tích bề mặt thường từ 50-500 2

1.1.4.2 Phân loại

Căn cứ theo bản chất chính của quá trình sắc ký trong cột tách, người ta chia nó thành nhiều loại như hấp phụ, phân bố, trao đổi ion và rây phân tử Tương ứng với loại chất nhồi như thế người ta có một loại sắc ký riêng trong

kĩ thuật HPLC Căn cứ theo trạng thái rắn lỏng của pha tĩnh, người ta chia nó thành hai loại, nếu pha tĩnh là chất rắn ta có sắc ký lỏng rắn (LSC), nếu pha tĩnh là chất lỏng ta có sắc ký lỏng-lỏng (LLC) Căn cứ theo độ phân cực của pha tĩnh và pha động, có các loại: Sắc ký pha thuận (pha tĩnh phân cực còn pha động ít phân cực), sắc ký pha đảo (pha tĩnh ít phân cực còn pha động thì phân cực), sắc ký pha đảo tạo cặp ion và sắc ký trao đổi ion Căn cứ theo cấu trúc xốp của pha tĩnh là các hạt rắn, người ta chia nó thành 2 loại là xốp toàn phần hạt và xốp bề mặt hạt (xốp chỉ lớp vỏ ngoài)

1.1.4.3 Điều kiện đối với một pha tĩnh

Phải trơ và bền vững với các điều kiện của môi trường sắc ký Có khả năng tách chọn lọc một hỗn hợp chất tan nhất định trong điều kiện sắc ký nhất định Tính chất bề mặt phải ổn định (đặc biệt là đặc trưng xốp của nó) Cân bằng động học của sự tách phải xảy ra nhanh và lặp lại tốt Cỡ hạt phải tương đối đồng nhất

1.1.5.2 Quá trình rửa giải

Rửa giải đẳng dòng pha động không thay đổi trong suốt quá trình rửa giải Rửa giải gradient pha động liên tục thay đổi (do tỉ lệ tạo nên các thành phần pha động thay đổi) trong suốt quá trình rửa giải Lúc này độ phân cực của pha động cũng sẽ bị biến đổi và thường là tăng hiệu quả tách

1.1.5.3 Các yếu tố chính cần chú ý trong lựa chọn pha động

Bản chất của dung môi lựa chọn làm pha động, thành phần các chất tạo

ra pha động, tốc độ dòng pha động và pH của pha động (đặc biệt chú ý ở sắc

ký trao đổi ion và sắc ký cặp ion)

1.1.5.4 Điều kiện đối với một pha động

Phải trơ đối với pha tĩnh, hòa tan được chất cần phân tích, bền vững theo thời gian Có độ tinh khiết cao, phải nhanh đạt các cân bằng trong sắc ký Phù hợp với các loại detector dùng để phát hiện các chất phân tích Có tính kinh tế và không khan hiếm Pha động là một trong những yếu tố quyết định hiệu suất tách sắc ký của một hỗn hợp mẫu Nó quyết định thời gian lưu giữ các chất mẫu và hiệu quả sự tách sắc ký Pha động có thể ảnh hưởng đến:

- Độ chọn lọc của hệ pha, thời gian lưu giữ của chất tan

- Độ phân giải các chất trong một pha tĩnh

- Độ rộng và sự cân đối của sắc ký đồ Tất cả các dung môi dùng trong HPLC (kể cả pha động) đều được đuổi khí bằng cách đun nóng, hút chân không, lắc siêu âm Vì không khí hòa tan trong dung môi sẽ tạo bọt khí trong detector và gây nhiễu tín hiệu

1.2 Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử

1.2.1 Định luật Bughe - Lămbe – Bia

Khi chiếu một chùm tia sáng có năng lượng nhất định vào mô ̣t dung dịch chứa cấu tử hấp thụ ánh sáng thì cấu tử đó sẽ hấp thụ chọn lọc một số tia sáng Độ hấp thụ quang của cấu tử tỷ lệ thuận với nồng độ của chất trong dung dịch và bề dày lớp dung dịch mà ánh sáng truyền qua

Phương trình toán học biểu diễn định luật Bughe - Lămbe - Bia :

độ của hệ trắc quang nhiều cấu tử

Bản chất của định luật cộng tính là sự độc lập của đại lượng độ hấp thụ quang của một chất riêng biệt khi có mặt của các chất khác có sự hấp thụ ánh sáng riêng

Biểu diễn tính cộng tính về độ hấp thụ quang của dung dịch hỗn hợp chứa n cấu tử tại bước sóng  bằng phương trình toán học:

độ hấp thụ quang của một hỗn hợp các cấu tử không tương tác hóa học với nhau và bằng tổng độ hấp thụ quang của các cấu tử riêng biệt ở cùng bước sóng này”

1.2.3 Phương pháp lọc Kalman

Thuật toán lọc Kalman đầu tiên được nghiên cứu trong vật lý vô tuyến nhằm loại bỏ các tín hiệu "nhiễu" và sau đó được ứng dụng vào hoá học trắc quang Thuật toán lọc Kalman hoạt động trên cơ sở các file dữ liệu phổ ghi được của từng cấu tử riêng rẽ và của hỗn hợp các cấu tử, xác định sự đóng góp về phổ của từng cấu tử trong hỗn hợp tại các bước sóng Khi chương trình chạy, những kết quả tính toán liên tiếp sẽ càng tiến gần đến giá trị thực Trong thực tế, người

ta sử dụng phương pháp bình phương tối thiểu để giảm sai số giữa phổ của hỗn hợp với phổ nhân tạo được dự đoán bởi phương pháp lọc Kalman Kết quả tính toán là lý tưởng khi phổ của hỗn hợp trừ đi phổ nhân tạo được tính bởi lọc Kalman sẽ tạo ra một đường thẳng có độ lệch không đáng kể Độ đúng của phép xác định phụ thuộc vào độ nhiễu của nền, vào việc tách các đỉnh phổ hấp thụ của các cấu tử và sự tương tác giữa các cấu tử Hỗn hợp có càng ít cấu tử, các đỉnh hấp thụ càng cách xa nhau thì sai số của phép tính toán sẽ càng nhỏ

Việc tính toán sẽ được thực hiện trên toàn bộ khoảng bước sóng được chọn Nếu kết thúc quá trình tính toán, độ lệch chuẩn tương đối của giá trị nồng độ các cấu tử trong hỗn hợp vẫn lớn hơn giá trị sai số cho phép thì nồng

độ của cấu tử đó sẽ phải xác định lại Khi đó, cần phải tăng giá trị sai số mặc định hoặc giảm số giá trị nồng độ mặc định để tính giá trị nồng độ trung bình

Hi ̀nh 1.4 Mô hình hoạt động của bộ lọc Kalman

Tín hiệu cần đo

Các nguồn

nhiễu

Bộ phận tiếp nhận tín hiệu

Bộ lọc

Giá trị

đo được

1.3 Tổng quan về các chất phân tích trong thuốc Decolgen forte

1.3.1 Paracetamol

1.3.1.1 Giới thiệu chung[2]

- Công thức phân tử: C8H9O2N khối lượng mol phân tử: 151,17 (g/mol)

- Tên quốc tế: Paracetamol (tên khác là Acetaminophen)

Công thức cấu tạo

- Tên IUPAC công thức cấu tạo là:

N-(4-hydroxyphenyl) acetamit hoặc p-hydroxy acetanilit hoặc 4-hydroxy acetanilit

Sự liên kết giữa nhóm axetamit, hydroxyl với vòng benzen làm giảm tính bazơ của nhóm amit và làm tăng tính axit của nhóm hydroxyl Nhóm - OH làm cho chế phẩm có tính axit và khi tác du ̣ng với dung dịch muối sắt (III) cho màu tím Đun nóng với dung dịch HCl thì bi ̣ thủy phân, thêm nước thì không có kết tủa vì p-aminophenol tạo thành tan trong axit Thêm thuốc thử kali đicromat thì có kết tủa màu tím khác với phenacetin là không chuyển sang

đỏ Quá trình xảy ra chủ yếu là:

1.3.2 Phenylephrine hydrochloride

1.3.2.1 Giới thiệu chung[2]

- Công thức phân tử: C9 H13NO2 HCl

- Khối lượng mol phân tử: 203,67(g/mol)

- Công thứ c cấu tạo:

- Tên hóa học: (-) - m -Hydroxy-á-[(methyl-amino) metyl] benzyl

alcohol hydrochloride hay còn gọi là phenylephrine hydrochloride

1.3.2.2 Tính chất [8]

Phenylephrine hydrochloride là một loại thuốc giảm sung huyết trong điều trị bệnh viêm mũi dị ứng theo mùa và cảm Phenylephrine hydrochloride có tác dụng giãn phế quản và có trong một số thuốc dùng trong điều trị bệnh hen phế quản và viêm phế quản mạn Thuốc kích thích chọn lo ̣c trên alph1-adrenner gây

co mạch tăng huyết áp và có tác du ̣ng kéo dài hơn adrennergic do ít bi ̣ phân hủy Trong dạng thuốc nhỏ mắt, phenylephrine hydrochloride được dùng để làm giãn đồng tử lúc khám (soi đáy mắt) hay phẫu thuật mắt

1.3.3 Chlorpheniramine maleate

1.3.3.1 Giới thiệu chung[2]

- Công thức phân tử là:C16H19ClN2.C4H4O4

- Khối lượng mol phân tử: 390,87 (g/mol)

- Công thức cấu tạo

- Tên IUPAC: 3-(4-clorophenyl)- N , N -dimethyl- 3 - (4-clorophenyl)

- N, N-dimethyl- 3-pyridin-2-yl-propan-1-amine amin

3-pyridin-2-YL-propan-1-1.3.3.2 Tính chất [8]

Là bột tinh thể trắng, không mùi, tan trong nước (pH = 4-5); etanol 96 %, cloroform; ít tan trong ete, benzen Nhiệt độ nóng chảy là 132-1350C và độ tan trong nước: 0,55 g/100 mL ở 200C Chlorpheniramine maleate chuyển hóa nhanh và nhiều Các chất chuyển hóa gồm có desmethyl - didesmethyl- chlorpheniramine và một số chất chưa được xác định, một hoặc nhiều chất trong số đó có hoạt tính

1.4 Kết quả xác định một số chất theo phương pháp HPLC và theo phương pháp UV- Vis

Ở trên thế giới và nước ta, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và theo phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử (UV- Vis) được ứng dụng nhiều trong phân tích các chế phẩm về dược cũng như hỗn hợp các chất

vô cơ, hữu cơ Các kết quả đều cho thấy phương pháp có độ tin cậy cao

1.4.1 Một số kết quả xác định thành phần theo phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử

Năm 2005, Thái Duy Thìn và cộng sự [11] đã định lượng đồng thời paracetamol và Ibuprofen trong viên nén Dibulaxan bằng phương pháp trắc

quang trong dung dịch đệm photphat có pH= 7, khoảng bước sóng quét phổ từ

200 – 300 nm Ibuprofen hấp thụ cực đại ở 222nm với độ hấp thụ quang cực đại paracetamol tại λmax=243 nm Độ đúng của phương pháp được chấp nhận với cả hai chất Tỷ lệ tìm thấy của ibuprofen từ 97,2% đến 99,2% và paracetamol từ 100,1% đến 101,2 %

Năm 2011, tác giả Lê Ngọc Anh [1] đã xác định thành công paracetamol, loratadin và dextromethophan HBr trong thuốc viên nén hapacol-CF bằng phương pháp trắc quang Điều kiện tối ưu để xác định đồng thời paracetamol, loratadin và detromethophan HBr trong hỗn hợp: Khoảng bước sóng thích hợp để quét phổ từ 210-285 nm, bước sóng ứng với độ hấp

thụ quang cực đại của dung dịch paracetamol λmax=244 nm, loratadin

λmax=273 nm và dextromethophan HBr λmax=278nm; trong môi trường axit HCl 0,1M độ hấp thụ quang của paracetamol, loratadin và dextromethophan HBr ổn định và đạt cực đại; khoảng thời gian tối ưu để tiến hành thí nghiệm

đo quang là 30 đến 60 phút sau khi pha và tại nhiệt độ 250C Kết quả thu được: xác định được LOD, LOQ và khoảng tuyến tính của paracetamol: 1,3÷25 μg/mL, loratadin: 1,3÷80 μg/mL, dextromethophan HBr: 0,6÷100 μg/mL Độ thu hồi của paracetamol từ 101,08% đến 102,08%, loratadin từ 92,9% đến 99,45%, dextromethophan HBr từ 99,78% đến 102,24%

Năm 2012, Siladitya Behera và các cộng sự [22] xác định thành công paracetamol trong thuốc viên nén sử dụng phương pháp UV-Vis Điều kiện tối ưu để xác định paracetamol: Khoảng bước sóng thích hợp để quét phổ từ 200-400 nm, bước sóng ứng với độ hấp thụ quang cực đại của dung dịch paracetamol λmax = 243 nm Khoảng thời gian tố i ưu để tiến hành thí nghiệm

đo quang là trong khoảng 8 giờ ở nhiê ̣t đô ̣ phòng Kết quả thu được: khoảng tuyến tính độ hấp thụ quang của paracetamol là 0,0 đến 150,0 μg/mL, độ thu hồi của paracetamol từ 98,54% đến 99,13%

Năm 2013, tác giả Mai Xuân Trường [14] đã xác định thành công dextromethophan HBr, clopheninamin maleat và guaifenesin trong thuốc viên methophan bằng phương pháp trắc quang Điều kiện tối ưu để xác định đồng thời dextromethophan HBr, clopheninamin maleat và guaifenesin trong hỗn hợp: Khoảng bước sóng thích hợp để quét phổ từ 210 - 285 nm, bước sóng ứng với độ hấp thụ quang cực đại của dung dịch dextromethophan HBr λmax = 278nm, clopheninamin maleat λmax = 264nm và guaifenesin λmax = 273nm; trong môi trường axit HCl 0,1M độ hấp thụ quang của dextromethophan HBr, clopheninamin maleat và guaifenesin ổn định và đạt cực đại; khoảng thời gian tối ưu để tiến hành thí nghiệm đo quang là 30 đến 60 phút sau khi pha và tại

nhiệt độ phòng Kết quả thu được: xác định được LOD, LOQ và khoảng tuyến tính của dextromethophan HBr: 0,5÷100μg/mL, clopheninamin maleat: 0,2÷50μg/mL, guaifenesin: 0,1÷50μg/mL độ thu hồi của dextromethophan HBr từ 96,60% đến 101,08%, clopheninamin maleat từ 98,70% đến 102,03%, guaifenesin từ 99,01% đến 103,00%

Năm 2014, tác giả Vũ Duy Long [8] xác định thành công đồng thời paracetamol, clopheninamin maleat và phenylephin hydroclorit trong thuốc TIFFY Điều kiện tối ưu để xác định đồng thời paracetamol, clopheninamin maleat và phenylephin hydroclorit trong hỗn hợp: Khoảng bước sóng thích hợp để quét phổ từ 210-290 nm, bước sóng ứng với độ hấp thụ quang cực đại của dung dịch paracetamol λmax = 244 nm, clopheninamin maleat λmax = 264

nm và phenylephin hydroclorit λmax = 273 nm trong môi trườ ng axit HCl 0,1M Khoảng thời gian tố i ưu để tiến hành thí nghiệm đo quang là từ 20 đến

90 phút sau khi pha và có thể tiến hành thí nghiê ̣m ở nhiê ̣t đô ̣ phòng Kết quả thu được: khoảng tuyến tính độ hấp thụ quang của paracetamol là 0,2 đến 30,0 μg/mL, clopheninamin maleat là từ 0,2 đến 40,0 μg/mL và phenylephin hydroclorit là từ 1,0 đến 40,0 μg/mL, độ thu hồi của paracetamol từ 99,8% đến 100,2%, của phenylephin hydroclorit là từ 99,1% đến 99,6% và của clopheninamin maleat là từ 98,1% đến 100,7%

Năm 2015, tác giả Nguyễn Thị Thuỳ Thương [12] đã xác định thành công đồng thời paracetamol, clopheninamin maleat trong thuốc Coldamin và Pacemin Điều kiện tối ưu để xác định đồng thời paracetamol, clopheninamin maleat trong hỗn hợp: Khoảng bước sóng thích hợp để quét phổ từ 210-290

nm, bước sóng ứng với độ hấp thụ quang cực đại của dung dịch paracetamol

λmax = 243 nm, clopheninamin maleat λmax = 273 nm trong môi trườ ng axit HCl 0,1M Khoảng thời gian tố i ưu để tiến hành thí nghiệm đo quang là từ 30 đến 40 phút sau khi pha và có thể tiến hành thí nghiê ̣m ở nhiê ̣t đô ̣ phòng Kết

quả thu được: khoảng tuyến tính độ hấp thụ quang của paracetamol là 0,2 đến 30,0 μg/mL, cafein 0,2 đến 30,0 μg/mL, độ thu hồi của paracetamol từ 96,3% đến 99,1%, của clopheninamin maleat là từ 95,5% đến 98,3%

Năm 2015, tác giả Trần Quốc Chính [4] đã xác định thành công đồng thời paracetamol, codein phot phat trong thuốc Actadol codein Điều kiện tối

ưu để xác định đồng thời paracetamol, codein phot phat trong hỗn hợp: Khoảng bước sóng thích hợp để quét phổ từ 210-290 nm, bước sóng ứng với

độ hấp thụ quang cực đại của dung dịch paracetamol λmax = 243 nm, codein

λmax = 210 nm trong môi trườ ng axit HCl 0,1M Khoảng thời gian tố i ưu để tiến hành thí nghiệm đo quang là từ 30 đến 40 phút sau khi pha và có thể tiến

hành thí nghiê ̣m ở nhiê ̣t đô ̣ phòng Kết quả thu được: khoảng tuyến tính độ hấp thụ quang của paracetamol là 0,2 đến 30,0 μg/mL, cafein 0,2 đến 30,0 μg/mL, độ thu hồi của paracetamol từ 99,3% đến 101,1%, của codein là từ 98,5% đến 100,3%

1.4.2 Một số kết quả xác định thành phần theo phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Năm 2005, bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), tác giả Thái Duy Thìn [11] và cộng sự đã sử dụng phương pháp HPLC: Nghiên cứu định lượng paracetamol, bromhexin hydroclorit, pseudoephedrine hydroclorid, clorpheniramin maleat bằng phương pháp HPLC với điều kiện: Cột Lichrosorb Si 60 (5μm, 250mm x 4mm), pha động là hỗn hợp metanol - dung dịch đệm amoninirat pH=9,5 (45 : 55), tốc độ dòng là 1,5 và 1 mL/phút, detector UV đặt ở bước sóng 257nm, thể tích tiêm mẫu 20 μL Kết quả thu được: sai số tương đối của ibuprofen và paracetamol là 0,23% và 2,07%; độ thu hồi của ibuprofen và paracetamol là 98,4% và 99,1% Định lượng paracetamol, axit mefenamic bằng phương pháp HPLC với điều kiện: Cột Lichrosorb RP18 (10 μm, 250 mm x 4,6 mm) Pha động là hỗn hợp

axetonitril- nước- tetrahydrofuran (tỉ lệ 3:8:9 về thể tích) Tốc độ dòng là 1 mL/phút Detector UV đặt ở bước sóng 279 nm Thể tích tiêm mẫu 20 μL Kết quả thu được: sai số tương đối của paracetamol, axit mefenamic là 0,51%

và 1,42%; độ thu hồi của paracetamol, axit mefenamic là 98,16% và 99,16% Định lượng paracetamol, cafein bằng phương pháp HPLC với điều kiện: Cột Lichrosorb RP18 (10μm, 250mm x 4,6mm) Pha động là hỗn hợp metanol- nước (tỉ lệ 35:65 về thể tích) Tốc độ dòng là 1 mL/phút Detector UV đặt ở bước sóng 279 nm Thể tích tiêm mẫu 20 μL Kết quả thu được: sai số tương đối của paracetamol, cafein là 0,54% và 1,07%; độ thu hồi của paracetamol, cafein là 98,8% và 99,5% Nghiên cứu định lượng paracetamol, ibuprofen bằng phương pháp HPLC với điều kiện: Cột Richrosorb RP18(10μm, 250mm

x 4mm), pha động là hỗn hợp axetonitril và dung dịch axit photphoric 0,1% (tỉ lệ 60: 40 về thể tích), tốc độ dòng là 1 mL/phút, detector UV đặt ở bước sóng 214 nm, thể tích tiêm mẫu 20 μL Kết quả thu được: sai số tương đối của ibuprofen và paracetamol là 0,81% và 1,03%; độ thu hồi của ibuprofen và paracetamol là 98,4% và 98% Định lượng paracetamol, quinine sunfat bằng phương pháp HPLC với điều kiện: Cột Lichrosorb RP18 (5μm, 250mm x 4,6mm) Pha động là hỗn hợp metanol- axit axetic- dietylamin (tỉ lệ 650:350:1

về thể tích) Tốc độ dòng là 1 mL/phút Detector UV đặt ở bước sóng 235 nm Thể tích tiêm mẫu 20 μL Kết quả thu được: sai số tương đối của paracetamol, quinine sunfat là 1,16% và 1,887%; độ thu hồi của paracetamol, quinine sunfat là 99,0% và 99,3% Định lượng paracetamol, phenylpropaolamin HCl, clorphenylamin maleat bằng phương pháp HPLC với điều kiện: Cột C18 (5μm, 250mm x 4,6mm) Pha động là hỗn hợp nước- axetonitril- trietylamin (tỉ lệ 968:30:2 về thể tích) Tốc độ dòng là 1,2 mL/phút Detector UV đặt ở bước sóng 216 nm đo phenylpropanolamin HCl và clorphenylamin maleat

244 nm đo acetaminophen Thể tích tiêm mẫu 20 μL Nhiệt độ cột ở nhiệt độ

phòng Kết quả thu được: sai số tương đối của paracetamol, phenylpropaolamin HCl, clophenylamin maleat là 0,47% và 0,67% và 1,19%;

độ thu hồi dao động từ 99,61% đến 100,65%

Năm 2009, bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), Fegade và cộng sự [16] đã định lượng đồng thời paracetamol và piroxicam trong thuốc viên Sử dụng cột Eurosphere- 100 C18, 250 x 4,6 mm, kích thước hạt 5 μm, với pha động là hỗn hợp metanol: nước (tỉ lệ 70:30 về thể tích) Tốc độ dòng 1,0 mL/phút và bước sóng đo quang ở 227 nm Thời gian lưu của piroxicam và paracetamol tương ứng là 2,52 và 5,48 phút Phương pháp này đã có độ chính xác, độ tuyến tính, độ tin cậy, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng theo tiêu chuẩn ICH và USP Các nghiên cứu khảo nghiệm cho thấy độ thu hồi paracetamol và piroxicam trong phạm vi 99-101% thu được ở các nồng độ khác nhau Phương pháp này được áp dụng thành công với việc xác định xác định đồng thời cả hai chất trong phòng thí nghiệm cũng như trong dược phẩm thương mại

Năm 2011, Lohar V.R và các cộng sự [19] đã định lượng thành công paracetamol, cafein, pseudouphedrin hydroclorit, dextromethophan hydrobromit và loratadin trong thuốc viên bằng phương pháp RP-HPLC Phương pháp sử dụng pha động gồm dung dịch đệm natri heptan sunphonat

và axetonitril (tỷ lệ 95: 5 về thể tích), tốc độ dòng chảy là 1 mL/phút Hệ thống HPLC Shimadzu LC 2010 với cột Inertsil ODS 3V (4,6 mm x 5 cm, 3 μm), bước sóng đo quang là 205 nm Thời gian lưu của paracetamol là 3,5 phút; caffein là 5,5 phút; pseudoephedrin HCl là 8 phút, dextromethophan HBr là 14 phút; loratadin là 15 phút Độ thu hồi của paracetamol, caffein, pseudoephedrin hydrochlorit, dextromethophan hydrobromid và loratadin nằm trong khoảng 98% đến 102% Đây là phương pháp đơn giản, chính xác,

độ lặp lại cao do đó phù hợp cho phân tích thường xuyên các loại thuốc ở dạng bào chế viên nén

Năm 2011, tác giả Đỗ Thị Thu Hường [6] định lượng thành công paracetamol, dextromethophan HBr và loratadin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với cột pha đảo C18 (5 µm, 150 mm x 4,6 mm) Pha động

là hỗn hợp axetonitril: đệm kali dihydrophotphat pH=2,9 (tỷ lệ 25:75 về thể tích) Tốc độ dòng là 1,4 mL/phút Detector UV đặt ở bước sóng 215 nm Thể tích bơm mẫu là 20 µL Nhiệt độ cột đo ở nhiệt độ phòng Kết quả thu được: thời gian lưu của paracetamol, dextromethophan HBr và loratadin lần lượt là 3,5; 6,62 và 11,29 phút

Năm 2013, tác giả Nguyễn Thành Lộc [9] đã định lượng đồng thời paracetamol và ibuprofen bằng phương pháp HPLC với điều kiện: Cột RP-18 (5 µm, 220 mm x 4,4 mm) Pha động là hỗn hợp axetonitril : H3PO4 0,1 M (tỷ lệ 97:3 về thể tích) Tốc độ dòng là 0,7 mL/phút Detector UV đặt ở bước sóng 224 nm Thể tích bơm mẫu là 20 µL Kết quả thu được: độ thu hồi của paracetamol và ibuprofen là 96,03% và 94,48%

Năm 2013 tác giả Vũ Duy Long [8] đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để xác định đồng thời paracetamol, clopheniramin maleat

và phenylephrin HCl trong các dược phẩm nói chung và thuốc TIFFY nói riêng bằng cách sử dụng pha động là hỗn hợp đệm NaH2PO4 0,05 M : axetonitril (tỉ lệ 93:07 về thể tích); Thể tích bơm mẫu là 20 µL với tốc độ dòng chảy pha động là 1,5 mL/phút, sử dụng loại cột C18, bước sóng đo quang 215 nm và ở nhiệt độ là 30oC Các chất paracetamol, clopheniramine maleate và phenylephrine HCl trong thuốc TIFFY đã được xác định thành công với thời gian lưu của acetaminophen là 8,62 phút, thời gian lưu của clopheniramin maleat là 2,78 phút và thời gian lưu của phenylephrin HCl là

3,27 phút Độ thu hồi của paracetamol là 99,7%; độ thu hồi của clopheniramin maleat là 99,5% và độ thu hồi của phenylephrine HCl là 98,8%

Năm 2013, Husen Al-Akraa và cộng sự [18] bằng phương pháp HPLC

đã định lượng đồng thời paracetamol, pseudcephodrin HCl, clorpheniramin maleat trong các chế phẩm dược có chứa thuốc thông mũi, thuốc ho an thần

và thuốc kháng histamin như paracetamol, pseudoephedrin hydrochlorit, clorpheniramin maleat và dextromethophan hydrobromit sử dụng chlordiazepoxit, sử dụng đầu dò photo-diode tại 203 nm Sử dụng cột BDS Hypersil C18 (250 × 4,6 mm; 5 μm) Pha động gồm axetonitril : nước (tỉ lệ 60:40 về thể tích), nước có chứa sodium dodecyl sunfat và trietylamine hydrochlorit, điều chỉnh pH = 2,5 với axit orthophotphoric 0,01M và kali dihydrogenphotphat 0.01M Tốc độ dòng chảy 1,0 mL/phút Phạm vi tuyến tính của nồng độ là 20-2000; 6-2400; 2-160 và 15-1200μg/mL với (R2> 0,9991) tương ứng pseudoephedrin hydrochlorit, clorpheniramin maleat, và dextromethophan hydrobromit và độ thu hồi 97,0-102,4% Giới hạn phát hiện (LOD) 0,33; 0,09; 0,12 và 0,03μg/ L, và giới hạn định lượng (LOQ) 1,10; 0,30; 0,40 và 0,10 μg/mL tương ứng cho pseudoephedrin hydrochlorit, clorpheniramin maleat và dextromethophan hydrobromit Các phương pháp RP-HPLC đề xuất đã được áp dụng thành công cho việc xác định các hợp chất khác nhau trong các chế phẩm dược không bị ảnh hưởng bởi các tá dược

Năm 2014, tác giả Parag Bhortake [20] đã định lượng đồng thời paracetamol, doxylamin succinat và dextromethophan hydrobromi trong dược phẩm bằng phương pháp HPLC Việc tách được thực hiện bằng cách sử dụng một pha động gồm dung dịch đệm (muối natri của axit butan sulphonic):axetonitril Tốc độ dòng là 1,5 mL/phút Phương pháp được thực hiện trên cột Shimadzu LC 2010 HPLC có detector UV phát hiện ở bước sóng

272 nm Pha tĩnh được sử dụng là Inertsil C-18, đường kính bên trong 4,6

mm, chiều dài 250 mm và kích thước hạt của 5 μm, nhiệt độ cột được duy trì

ở 30°C Thời gian lưu giữ đã được tìm thấy là 5 phút cho paracetamol, 3 phút cho phenylephrine hydrochlorit và 15 phút cho dextromethorphan hydrobromit Các đỉnh pic đẹp, tách rời nhau và không bị ảnh hưởng bởi các

tá dược Độ thu hồi của paracetamol, phenylephrin hydrochlorit và dextromethophan hydrobromit đều nằm trong giới hạn 98,0% đến 102,0%

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao đã được Hatice Caglar và cộng

sự [17] dùng để xác định đồng thời pseudoephdrin HCl, pheniramin maleat, paracetamol, guaifenisin, maleat pyrilamin, clorpheniramin maleat, triprolidin HCl, dextromethophan HBr, diphenhydramin HCl trong dược phẩm Sử dụng cột Nucleodur C18 cột (250 x 4,0 mm, 5μm) Pha động gồm metanol: hỗn hợp đệm (tỉ lệ 38:62 về thể tích) ở nhiệt độ phòng, với tốc độ dòng chảy là 0,75 mL/phút Bước sóng phát hiện ở 210 nm Tuyến tính trên một phạm vi nồng độ của 0,2-250 μg/mL cho paracetamol; 0,5-250 μg/mL cho pseudoephdrin HCl và pheniramin maleat, 1-250 μg/mL cho guaifenisin; 2,5-

250 μg/mL cho clorpheniramin maleat và triprolidin HCl; 5-250 μg/mL cho pyrilamin maleat và diphenhydramin HCl; 10-20 μg/mL cho dextromethophan HBr với hệ số tương quan lớn hơn 0,9993 Độ lệch chuẩn tương đối đều nhỏ hơn 4% Phương pháp này đã được áp dụng thành công cho các chất trên trong nhiều thuốc ho khác nhau và các chế phẩm như xi rô

và viên nén

Phương pháp dò HPLC-UV được tác giả Alagar Raja [15] ứng dụng để tách và định lượng paracetamol, dextromethophan hydrobromit và doxylamin succinat trong dược phẩm Máy RP-HPLC sử dụng cột Waters C18 (250x4.6mm, 5μm), pha động gồm dung dịch đệm kali dihydrogen photphat

pH được điều chỉnh đến 3,5 ± 0,05 với axit o-photphoric (A) và Axetonitril (B) A:B tỉ lệ là 85: 15 về thể tích trong 15,0 phút đầu, và sau đó nó đã được duy trì ở tỉ lệ 70: 30 về thể tích cho mười phút tiếp theo và cuối cùng trong mười phút cuối cùng nó được duy trì ở mức 85: 15 về thể tích; tốc độ dòng chảy là 1,2 mL/phút Cột nhiệt độ được đặt ở nhiệt độ môi trường, bước sóng

UV-phát hiện cố định tại 270 nm Paracetamol tuyến tính trên một khoảng 162,5μg/mL đến 487,5μg/mL và dextromethophan hydrobromit trong phạm

vi 5-15μg/mL và doxylamin succinat trong phạm vi của 3,125-9,375μg/mL Phương pháp chính xác để xác định khảo nghiệm là dưới 2,0% RSD Độ thu hồi dao động từ 98%-102% Phương pháp này rất hữu ích trong việc kiểm soát chất lượng của dược phẩm

Tác giả Zahid A.Chaudhary [22] đã ứng dụng phương pháp HPLC để định lượng dextromethophan hydrobromit và quinidin sunphat trong dược phẩm, phương pháp đã được thực hiện bằng kỹ thuật isocratic trên một pha đảo ngược: với cột ODS C18 (250mm X 4.6 mm; 5 mm kích thước hạt) và detector UV phát hiện ở bước sóng 234 nm, pha động gồm hỗn hợp đệm photphat (pH 4,5): metanol (tỉ lệ 55: 45 về thể tích), tốc độ dòng chảy 1,0 mL/phút Thời gian lưu trung bình cho dextromethophan hydrobromit và quinidin sunphat tương ứng là 3,6 và 5,5 phút Khoảng nồng độ tuyến tính là 10-30 μg/mL và 5-15μg/mL tương ứng cho dextromethophan hydrobromit và quinidin sunphat Sự tương quan hợp tác hiệu quả đã được tìm thấy là 0,995

và 0,997 cho dextromethophan hydrobromit và quinidin sunphat tương ứng

Có nghĩa là khảo nghiệm đã được phát hiện là 99,5% và 97,00% cho dextromethophan hydrobromit và quinidin sunphat tương ứng Các phương pháp phát triển đã được xác nhận theo chuẩn ICH, LOD & LOQ và các kết quả được tìm thấy là thỏa đáng, do đó phương pháp này có độ nhạy tốt cho định lượng dextromethophan hydrobromit và quinidin sunfat Các phương pháp phân tích cũng được áp dụng trong các phòng thí nghiệm thông thường

Nó cũng có thể được áp dụng cho kiểm tra, kiểm soát chất lượng cho các loại thuốc ở dạng viên nang

Chương 2

THỰC NGHIỆM

2.1 Đối tượng nghiên cứu

Áp dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử (UV-Vis) để xây dựng quy trình xác định đồng thời PRC, CPM và PNH trong thuốc Decolgen forte trên thị trường

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

2.2.1.1 Chỉ tiêu nghiên cứu

Lựa chọn điều kiện và đánh giá quy trình sắc ký đã xây dựng được:

- Chuẩn bị các dung dịch cần phân tích

- Khảo sát độ tuyến tính của thành phần cần phân tích: Nồng độ của mỗi chất phân tích đều có mối quan hệ tuyến tính với diện tích hay chiều cao của pic sắc ký (Trong một khoảng nồng độ nhất định nào đó)

- Khảo sát tính thích hợp của hệ thống: Kiểm tra xem các điều kiện sắc

ký ta đã lựa chọn có phù hợp không? Ta chạy một mẫu phân tích với điều kiện sắc ký đã chọn nếu các pic tách khỏi nhau hoàn toàn, pic nhỏ gọn là được

- Khảo sát độ chính xác của phương pháp: Độ chính xác thường được xác định thông qua độ lặp của phương pháp (Cách thông thường là xác định

độ lệch chuẩn tương đối của kết quả phân tích RSD)

- Khảo sát độ đúng của phương pháp: Được xác định thông qua khả năng thu hồi của kết quả phân tích khi dùng phương pháp thêm chuẩn

- Xác định đồng thời PRC, CPM và PNH trong thuốc Decolgen forte theo phương pháp HPLC

2.2.1.2 Xác định các chỉ tiêu nghiên cứu cho phương pháp HPLC

Lựa chọn các thông số của máy HPLC:

- Detector, có thể gặp một số detector sau : Detector hấp thụ tử ngoại - khả khiến (UV-Vis), detector hấp thụ tử ngoại (UV)…

- Thể tích bơm mẫu

- Cột tách

- Nhiệt độ cột tách

- Bước sóng thích hợp để phát hiện đồng thời các thành phần

- Pha động: Thành phần, tỷ lệ các thành phần của pha động, pH

- Tốc độ dòng pha động

2.2.2 Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử

- Tiến hành quét phổ từ 200 nm đến 900 nm để kiểm tra lại bước sóng hấp thụ quang cực đại của các dung di ̣ch PRC, CPM và PNH

- Khảo sát sự ổn định độ hấp thụ quang của PRC, CPM và PNH theo môi trường nền, pH, thời gian, nhiệt độ để lựa chọn khoảng thời gian, nhiệt độ

và pH thích hợp khi thực hiện các phép đo quang

- Khảo sát khoảng tuyến tính của PRC, CPM và PNH từ đó xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

- Định lượng đồng thời PRC, CPM và PNH trong các mẫu tự pha để

xác đi ̣nh các sai số khi tỷ lệ hàm lươ ̣ng PRC, CPM và PNH nhau

- Xây dựng quy trình phân tích mẫu thuốc, từ đó đánh giá độ tin cậy của phương pháp thông qua việc tính toán độ đúng và độ lặp lại của phép đo

- Định lượng đồng thời PRC, CPM và PNH trong mẫu thuốc

- Đánh giá độ tin cậy của phương pháp thông qua xác đi ̣nh độ thu hồi

- Pha chế dung dịch chuẩn PRC, CPM và PNH và hỗn hợp của chúng

- Xác định các điều kiê ̣n tố i ưu cho phép đo quang PRC, CPM và PNH

- Tiến hành xác đi ̣nh đồng thời 3 chất trong các mẫu giả tự pha

- Tiến hành xác đi ̣nh đồng thời 3 chất trong mẫu thuốc Decolgen forte

2.3 Phương pháp xử lý số liệu

2.3.1 Các phương pháp để xử lý kết quả phân tích

Đánh giá phương pháp phân tích và các kết quả phân tích: Sử dụng các phương pháp thống kê, sử dụng công cụ hỗ trợ là Microft Excel, máy tính bỏ túi Sử dụng phương pháp hồi qui tuyến tính và thuật bình phương tối thiểu để đánh giá chất chuẩn và mẫu

2.3.2 Các đại lượng đặc trưng để xử lý kết quả phân tích

2.3.2.1 Đánh giá độ tin cậy của phương pháp

- Độ lặp lại của phương pháp được đánh giá thông qua độ lệch chuẩn (S) hoặc đô ̣ lê ̣ch chuẩn tương đố i (RSD)

- Đánh giá độ đúng của phương pháp đối với các hỗn hợp PRC, CPM

và PNH tự pha chế thông qua sai số tương đối RE Sai số tương đối của các phép phân tích đối với mẫu chuẩn tự pha chế thông qua việc tính tỷ số giữa độ sai lệch của nồng độ tính toán được với nồng độ thực đã biết của mẫu theo công

thứ c: Tinh toan 0

0

C (2.3)

trong đó: RE% là sai số tương đối của phép xác định nồng độ các cấu tử.

C Tinh toan (µg/mL) là nồng độ tính toán được

C o (µg/mL) là nồng độ đã biết của dung di ̣ch PRC, CPM và PNH trong hỗn hợp

- Đánh giá độ đúng của phương pháp đối với các mẫu thuố c nghiên cứ u thông qua độ thu hồi bằng phương pháp thêm chuẩn Độ thu hồi (Rev) được

tính theo công thứ c sau: Re = C - T 100%

được trong mẫu khi chưa thêm chuẩn

a là nồng độ cu ̉ a PRC, CPM và PNH chuẩn thêm vào mẫu (đã biết)

2.3.2.2 Giới hạn phát hiện (LOD)

- LOD được coi là nồng độ thấp nhất của chất nghiên cứu mà hệ thống phân tích cho tín hiệu phát hiện phân biệt với tín hiệu nền Trong phân tích trắc quang LOD tính theo phương trình hồi quy có công thức như sau:

3.SDLOD =

B (2.5)

trong đó: SD là độ lệch chuẩn của tín hiệu y trên đường chuẩn

B là độ dốc của đường chuẩn chính là độ nhạy của phương pháp trắc quang

- LOQ được coi là nồng độ thấp nhất của chất nghiên cứu mà hệ thống phân tích định lượng được với tín hiệu phân tích khác, có ý nghĩa định lượng với tín hiệu nền và đạt độ tin cậy tối thiểu  95%, thông thường người ta sử dụng công thức:

10.SDLOQ =

B (2.6)

2.3.2.3 Đánh giá kết quả phép phân tích theo thống kê

Khoảng tin cậy của phép xác định nồng độ được tính theo công thức:

k được tra trong bảng (t0,95; 3 = 3,18; t0,95; 4 = 2,78; t0,95; 5 = 2,57 ) X là giá tri ̣ trung bình của tâ ̣p số liê ̣u các kết quả nghiên cứu; S là độ lệch chuẩn, được tính theo công thức (2.1); n là số phép đo

- Bộ cuvet thạch anh

- Cân điện tử có độ chính xác 0,0001g

- Máy rung siêu âm và máy đo pH

2.4.2 Dụng cụ

- Chương trình lọc Kalman tính toán đồng thời nồng độ các cấu tử [13]

- Cốc thủy tinh, phễu thủy tinh, ống nghiệm

2.4.4 Chế phẩm thuốc Decolgen forte

Thành phần mỗi viên nén chứa:

Để hòa tan các mẫu và thuốc nghiên cứu dùng để tiến hành khảo sát theo phương pháp UV- Vis chúng tôi đã sử dụng các dung môi sau

Lấy một ống chuẩn HCl pha loãng bằng nước cất 2 lần thành 1000 mL thu được dung dịch HCl 0,1M (pH = 1), sau đó pha thành HCl 0,01M và 0,001M có pH = 2 và 3

Lấy một ống chuẩn H2SO4 pha loãng bằng nước cất 2 lần thành 1000

mL thu được dung dịch H2SO4 0,1M (pH = 1) Sau đó pha thành H2SO4

0,05M và 0,005M có pH = 2 và 3

Lấy ống chuẩn HNO3 pha loãng bằng nước cất 2 lần thành 1000 mL thu được dung dịch HNO3 0,1M (pH = 1) Sau đó pha thành HNO3 0,01M và 0,001M có pH = 2 và 3 Các dung dịch pha được chuẩn độ lại xác định nồng độ

2.6 Chuẩn bị các dung dịch chuẩn cho phương pháp HPLC

Dung dịch PRC: Cân chính xác 100 mg PRC cho vào bình định mức 100

mL đem hòa tan và định mức bằng dung dịch đệm Sau đó đi rung siêu âm trong

10 phút Thu được dung dịch PRC có nồng độ là 1000 µg/mL (gọi là dung dịch PRC1) Pha loãng dung dịch PRC1 bằng dung dịch đệm thu được các dung dịch PRC có nồng độ 900 µg/mL, 700 µg/mL, 500 µg/mL, 300 µg/mL Bằng cách lấy 3 mL, 5 mL, 7 mL, 9 mL cho vào bình định mức 10 mL và định mức bằng dung dịch đệm

Dung dịch CPM: Cân chính xác 50 mg CPM cho vào bình định mức

100 mL đem hòa tan và định mức bằng dung dịch đệm Sau đó đi rung siêu

âm trong 10 phút thu được dung dịch CPM có nồng độ 500 µg/mL (gọi là dung dịch CPM1) Pha loãng bằng dung dịch đệm thu được dung dịch CPM có nồng độ là 50 µg/mL (gọi là dung dịch CPM2) Tiếp tục pha loãng dung dịch CPM2 bằng dung dịch đệm thu được các dung dịch CPM có nồng độ 2 µg/mL, 4 µg/mL, 6 µg/mL, 8 µg/mL

Dung dịch PNH: Cân chính xác 50 mg PNH cho vào bình định mức

100 mL đem hòa tan và định mức bằng dung dịch pha động Sau đó đi rung siêu âm trong 10 phút thu được dung dịch PNH có nồng độ 500 µg/mL ( gọi

là dung dịch PNH1) Pha loãng bằng dung dịch pha động thu được dung dịch PNH có nồng độ là 100 µg/mL (gọi là dung dịch PNH2) Pha loãng dung dịch PNH2 bằng dung dịch pha động thu được các dung dịch PNH có nồng độ 10µg/mL, 20 µg/mL, 30 µg/mL, 50 µg/mL

Dung dịch mẫu giả: Lấy lần lượt 25 mL dung dịch PRC1; 2 mL dung dịch CPM2 và 5 ml dung dịch PNH2 cho vào bình định mức 50 mL và định mức bằng dung dịch pha động tới vạch 50 mL được dung dịch chuẩn có nồng độ: PRC: CPM: PNH = 500: 2 : 10 (µg/mL) Các dung dịch sau khi pha song được lọc dung dịch qua màng lọc 0,45 µm

2.7 Chuẩn bị dung dịch thuốc Decolgen forte cho phương pháp HPLC

Cân chính xác 10 viên thuốc Decolgen forte (mỗi viên có chứa 500 mg PRC; 2 mg CPM và 10 mg PNH ) Sau đó tính khối lượng trung bình của viên

m = 0,62755g và nghiền thành bột mịn Cân chính xác 125,5 mg bột thuốc tương đương với 100 mg PRC; 0,4 mg CPM và 2 mg PNH cho vào bình định mức 100 mL Đem hòa tan và sau đó định mức bằng dung dịch đệm rồi đi rung siêu âm trong 15 phút ta được dung dịch chứa PRC 1000 µg/mL; CPM 4 µg/mL và PNH 20 µg/mL Lọc dung dịch qua màng lọc 0,45 µm Pha loãng 2 lần dung dịch bằng dung dịch đệm thu được dung dịch chứa PRC 500 µg/mL; CPM 2 µg/mL và PNH 10 µg/mL sau đó lọc dung dịch qua màng lọc 0,45 µm

2.8 Chuẩn bị các dung dịch chuẩn cho phương pháp UV-Vis

Cân chính xác lần lượt là 100 mg PRC, 100mg CPM và 100mg PNH và cho vào ba bình định mức 100 mL khác nhau Đem hòa tan và định mức bằng dung dịch HCl 0,1M, sau đó đem rung siêu âm trong 10 phút Thu được các dung dịch PRC, CPM và PNH có nồng độ là 100 µg/mL Pha loãng các dung dịch trên thành các có nồng độ là 1µg/mL, 2 µg/mL, 3 µg/mL, 4 µg/mL, 5µg/mL, 10 µg/mL,12 mL,15 mL ,16 mL,18 mL, 20 µg/mL, 30 µg/mL, 40µg/mL, 50 µg/mL bằng dung dịch HCl 0,1M Bằng cách lấy lần lượt 0,1 mL; 0,2 mL; 0,3 mL; 0,4 mL; 0,5 mL; 1 mL; 1,5 mL; 1,6 mL; 1,8 mL; 2 mL; 3 mL; 4 mL; 5 mL của các dung dịch PRC, CPM và PNH có nồng độ là 100 µg/mL vào bình định mức 10

mL và định mức thì thu được các dung dịch PRC, CPM và PNH có nồng độ như trên để tiến hành khảo sát

Lấy các dung dịch PRC, CPM và PNH có nồng độ là 10 µg/mL để pha loãng thành các dung dịch có nồng độ là 0,1µg/mL, 0,2 µg/mL, 0,3 µg/mL, 0,4 µg/mL, 0,5µg/mL, 0,6 mL Bằng cách lấy lần lượt 0,1 mL; 0,2 mL; 0,3 mL; 0,4 mL; 0,5 mL của các dung dịch PRC, CPM và PNH có nồng độ là 10 µg/mL vào bình định mức 10 mL và định mức

Cân chính xác lần lượt là 100 mg PRC, 100mg CPM và 100mg PNH và cho vào ba bình định mức 100 mL khác nhau Đem hòa tan và định mức lần lượt bằng các dung dịch HCl, H2SO4, HNO3 và lần lượt có HCl, H2SO4, HNO3 lần lượt có pH=1, pH=2, pH=3 sau đó đem rung siêu âm trong 10 phút Thu được các dung dịch PRC, CPM và PNH có nồng độ là 100 µg/mL trong các môi trường axit HCl, H2SO4, HNO3 và có pH khác nhau lần lượt là pH=1, pH=2, pH=3 Tiếp tục pha loãng các dung dịch PRC, CPM và PNH có nồng độ là 100 µg/mL thành 3 dãy dung di ̣ch gồ m 9 mẫu dung di ̣ch PRC có nồng độ 10 µg/mL, 9 mẫu dung dịch CPM có nồng độ 10 µg/mL và 9 mẫu dung di ̣ch PNH có nồ ng đô ̣ 10 µg/mL, trong các môi trường axit HCl, H2SO4, HNO3 có

lần lượt là pH=1, pH=2, pH=3 để tiến hành khảo sát

2.9 Chuẩn bị dung dịch thuốc Decolgen forte cho phương pháp UV-Vis

Xử lý mẫu thuốc: Cân 10 viên thuốc và tính khối lượng trung bình mỗi viên (m= 0,62755g) Đem nghiền nhỏ thành bột mịn rồi lấy chính xác một lượng bột tương đương 1/10 viên (chứa 50 mg PRC, 0,2 mg CPM và 1,0 mg PNH) cho vào bình định mức 100 mL Đem hòa tan và định mức bằng dung dịch HCl 0,1M sau đó rung siêu âm khoảng 15 phút Đem lọc và bỏ khoảng

40 mL dung dịch đầu, lấy 10 mL dung dịch lọc đem định mức thành 100 mL thu được dung dịch gốc chứa hàm lượng tương đương (PRC là 50g/mL, CPM là 0,2g/mL và PNH 1,0g/mL) gọi đó là dung dịch gốc Sau đó tiếp tục lấy các thể tích của dung dịch gốc lần lượt là 1mL, 2mL, 3mL, 4mL, 5mL vào bình định mức 10 mL và định mức tới vạch bằng dung dịch HCl 0,1M, thu được các dung dịch có tỉ lệ nồng độ PRC: PNH: CPM từ 5: 0,1: 0,02 đến 25: 0,5: 0,1 như bảng 3.25 để tiến hành khảo sát