Nghiên cứu ứng dụng công nghệ enzyme đế sản xuất hợp chất thơm dẫn xuất carotenoids

i LỜI CẢM ƠN Trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn, em luôn nhận được sự quan tâm giúp đỡ rất tận tình của thầy cô hướng dẫn, nhân dịp này, em xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: TS. Tạ Thị Minh Ngọc , người đã trực tiếp hướng dẫn và tận tình giúp đỡ em trong suốt quá trình em nghiên cứu, hoàn thành đề tài, đồng cảm ơn ThS. Trần Hải Đăng, người đã phụ hướng dẫn em rất nhiệt tình và tâm huyết. Em xin chân thành cảm ơn các anh chị cán bộ phòng thí nghiệm đã tạo điều kiện giúp đỡ em rất tận tình về máy móc, thiết bị trong suốt quá trình làm luận án. Qua đây, em cũng xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc Viện CHSH & MT, các thầy giáo, cô giáo bộ môn đã chỉ dẫn, giảng dạy em trong suốt 4 năm học qua và đã tạo những điều kiện thuận lợi để em hoàn thành luận văn này. Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè, những người luôn bên cạnh động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình em thực hiện đề tài. Nha Trang, tháng 6 năm 2012 An Thị Tươi ii `MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC HÌNH………………………………………………….v DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ……………………………………………… vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT……………………………………………………vii MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3 1.1. Tổng quan về carotenoid 3 1.1.1. về carotenoid 3 1.1.2. Phân loại carotenoid 4 1.1.2.1. Nhóm carotene 4 1.1.2.2 Nhóm xanthophylls 5 1.1.3 Tính chất vật lý, tính chất quang phổ………………………………….6 1.1.4. Hoạt tính sinh học và vai trò của carotenoid……………………… 8 1.1.5. Một số carotenoids điển hình 8 1.1.5.1. β-carotene 8 1.1.5.2. Lycopene 14 1.1.6. Các nguồn carotenoids trong tự nhiên 16 1.1.6.1. Nguồn carotenoids từ Gấc 18 1.1.6.2. Nguồn carotenoids từ nấm sợi Blakeslea trispora 21 1.2. Sự oxy hóa phân tử carotenoids – Hợp chất apocarotenoids……………….23 1.2.1. Sự oxy hóa phân tử carotenoids 22 iii 1.2.1.1. Một số enzyme sử dụng để chuyển hóa carotenoids thành chất thơm 27 1.2.2. Các hợp chất apocarotenoids 29 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 32 2.1. Mục tiêu nghiên cứu 32 2.2. Vật liệu, Hóa chất và dụng cụ 32 2.2.1. Vật liệu 32 2.2.2. Các hóa chất 32 2.2.3. Các chất chuẩn 36 2.2.4. Dụng cụ 36 2.3. Phương pháp nghiên cứu 36 2.3.1.Tách chiết carotenoids từ các nguồn khác nhau 36 2.3.1.1. Tách chiết carotenoids từ cà rốt và gấc 36 2.3.2. Chuyển hóa carotenoids thành chất thơm 40 2.3.2.1 Tạo hợp chất thơm nhờ quá trình tự oxy hóa của carotenoids 40 2.3.2.2. Tạo hợp chất thơm nhờ quá trình bổ sung Enzyme để oxy hóa carotenoids 41 2.4. Phương pháp phân tích 42 2.4.1. Phương pháp quang phổ hấp thụ UV-VIS 42 2.4.2. Phương pháp sắc kí bản mỏng TLC 44 2.4.3. Phân tích các thành phần chất thơm bằng sắc kí khí (GC) 46 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 47 3.1. Kết quả tách chiết carotenoids từ các nguồn khác nhau. 47 3.2. Kết quả sắc kí bản mỏng TLC 49 3.3. Sự phân rã của carotenoids/β-carotene trong quá trình tự oxy hóa. 52 iv 3.3.1. Khảo sát sự phân rã β-carotene từ các carotenoids có nguồn gốc khác nhau. 52 3.3.2. Nghiên cứu khảo sát sự tạo thành các chất thơm trong phản ứng tự oxy hóa carotenoids từ dầu gấc 54 3.4. Nghiên cứu khảo sát sự tạo thành các chất thơm từ carotenoids dầu gấc trong phản ứng đồng oxy hóa sử dụng enzyme xanthine oxydase 55 3.5. Khảo sát sự phân rã β-carotene tách chiết từ sinh khối nấm sợi B.trispora và tạo thành chất thơm trong phản ứng đồng oxy hóa sử dụng enzyme xanthine oxidase 57 3.6. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ enzyme và cơ chất đến sự phân rã β- carotene tách chiết từ sinh khối nấm sợi B. trispora và hình thành chất thơm trong quá trình đồng oxy hóa 58 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64 4.1. Kết luận 64 4.2. Kiến nghị 64 4.2.1. Nghiên cứu quá trình chuyển hóa sinh học β-carotene thành chất thơm 65 4.2.2. Nghiên cứu tách chiết, thu hồi sản phẩm 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO 66 v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của β-caroten 5 Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của Lycopene 5 Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của lutein và zeaxanthin 5 Hình 1.4. Phổ hấp thụ của một số carotenoids 7 Hình 1.7: Trái gấc 20 Hình 1.8: Các thành phần hợp chất bay hơi chính khi phân cắt β-carotene 23 Hình 1.10. Các bước trong quá trình chuyển hóa carotenoids thành chất thơm 25 Hình 1.11. Các bước cơ bản chuyển hóa carotenoids thành chất thơm: trường hợp của beta-ionone và beta-damascenone từ beta-carotene và neoxanthin 26 Hình 1.1. Cấu trúc tinh thể enzyme Xanthine oxidase tách chiết từ bò 28 Hình 1.14. Một số apocarotenoid tạo thành khi phân cắt beta-caroten 30 Hình 2.1. Sơ đồ quy trình tách chiết carotenoids từ cà rốt và Gấc. 39 Hình 2.2. Sơ đồ quy trình tách chiết carotenoids từ nấm sợi 39 Hình 2.3. Phổ hấp thụ của Lycopene trong mẫu chuẩn và mẫu dầu Gấc 43 Hình 2.4. Phổ hấp thụ của beta-carotene trong mẫu chuẩn và mẫu dầu Gấc 43 Hình 3.2. Kết quả phân tích TLC carotenoids/β-carotene từ dầu Gấc và từ Beta- carotene tinh khiết 50 Hình 3.3. Phổ hấp thụ thu được từ bản sắc kí, giống với phổ của 51 beta-carotene 51 Hình 3.4. Phổ hấp thụ thu được từ bản sắc kí, giống với phổ của Lycopene 51 Hình 3.5: Sự thay đổi hàm lượng β-carotene từ các nguồn khác nhau theo thời gian 53 Hình 3.6. Sự phân rã β-carotene tách chiết từ sinh khối nấm sợi B.trispora trong quá trình đồng oxy hóa sử dụng enzyme XO ở các nồng độ khác nhau 60 Hình 3.7. Biểu đồ hiệu suất chuyển hoá β-cyclocitral với các nồng độ enzyme và cơ chất khác nhau 61 Hình 3.8. Biểu đồ hiệu suất chuyển hoá β-ionone với các nồng độ enzyme và cơ chất khác nhau 62 Hình 3.9. Biểu đồ hiệu suất chuyển hoá DHA với các nồng độ enzyme 62 và cơ chất khác nhau 63 vi DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ Bảng 1.1. Quang phổ hấp thụ của một số carotenoids điển hình 6 Bảng 1.2. Ảnh hưởng của phương thức chế biến đến hàm lượng beta-carotene 9 Bảng 1.3: Bảng thành phần của beta-carotene trong 1 số loài thực vật phổ biến tại Việt Nam……………………………………………………………………………………17 Bảng 1.4. Hàm lượng một số carotenoids trong các mẫu thực vật…………………….18 Bảng 1.5. Lượng beta-carotene có trong 100g thực phẩm Error! Bookmark not defined. Bảng 1.6. Sản phẩm phân rã chung của carotenoid tìm thấy trong thực vật 30 Bảng 3.1. Kết quả tách chiết carotenoid tổng số (µg/g) khối lượng tươi từ ba nguồn cà rốt, Gấc và nấm sợi B.trispora 47 Bảng 3.2. Sự phân rã của beta-carotene từ các nguồn khác nhau trong quá trình tự oxy hóa. 52 Bảng 3.3. Sự phân rã β-carotene dầu màng gấc và tạo thành chất thơm trong phản ứng tự oxy hóa 54 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ dầu màng gấc đến sự phân rã β-carotene và tạo thành chất thơm trong phản ứng đồng oxy hóa sử dụng xanthine oxidase 55 Bảng 3.5. Sự phân rã β-carotene sinh khối nấm sợi B. trispora và tạo thành chất thơm trong phản ứng đồng oxy hóa sử dụng enzyme xanthine oxidase 57 Bảng 3.6. Sự phân rã β-carotene tách chiết từ sinh khối nấm sợi B. trispora trong quá trình đồng oxy hóa sử dụng enzyme XO ở các nồng độ khác nhau 58 Bảng 3.7. Hiệu suất chuyển hóa β-carotene thành chất thơm trong quá trình đồng oxy hóa β-carotene từ sinh khối nấm sợi B. trispora với các nồng độ XO và cơ chất acetaldehyde khác nhau 60 vii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT BHT Butylated hydroxytoluene EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid GC Gas chromatography HPLC High-performmance liquid chromatography LOX Lipoxygenases OD Optical Density TLC Thin layer chromatography UV/VIS Ultraviolet-visible spectrophotometry XO Xanthine oxidase HSCH Hiệu suất chuyển hóa 1 MỞ ĐẦU Từ thời xa xưa, khi mà công nghệ sản xuất chất thơm chưa được biết đến con người đã biết dùng hoa, lá của các loại thực vật (như hoa hồng) để nấu nước tắm, gội đầu cho thơm. Ngày nay, khi đời sống ngày càng phát triển, xã hội càng văn minh thì các chất thơm được sản xuất và sử dụng ngày càng đa dạng và phong phú cả về số lượng lẫn chất lượng. Chất thơm có thể lấy từ nguồn thiên nhiên bằng cách chưng cất hoa, lá hoặc cây các loài thực vật, hoặc hoàn toàn bằng con đường hóa học. Tuy nhiên việc tách chiết chúng là một việc khó khăn đòi hỏi một quy trình phức tạp và ít hiệu quả kinh tế, bên cạnh đó với các sản phẩm được tổng hợp bằng con đường hóa học lại ít được người tiêu dùng đón nhận, người ta ưa chuộng sản phẩm tự nhiên hơn. Vì vậy nhiều nhà khoa học đã tích cực tìm kiếm các hương thơm mới cũng như công nghệ mới để sản xuất các hợp chất tự nhiên. Một trong các lĩnh vực đang nổi lên về sản xuất các hợp chất là sử dụng công nghệ sinh học, đặc biệt là sử dụng enzyme và vi sinh vật cho sự xúc tác sinh học. Sự biến đổi sinh học các hợp chất carotenoids có vẻ như là một sự lựa chọn hợp lý để sản xuất các hợp chất hương từ những nguyên liệu được gọi là tự nhiên Sinh chuyển hóa carotenoids/ β-carotene được cho là một hướng có triển vọng để sản xuất hương thơm từ khi các chất này được xếp vào danh mục các thành phần tự nhiên. Các hợp chất thơm tạo ra từ carotenoids/ β carotene là một trong những nhóm quan trọng, bao gồm các sản phẩm chất thơm thu được từ quá trình phân cắt phân tử β-carotene như β-ionone, β-cyclocitral, dihydroactinidiolide (DHA), β-damascenone, là những hợp chất có mùi hương hoa, quả và gỗ rất mạnh, là thành phần chính của nhiều tổ hợp hương thơm được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm. Các hợp chất này tồn tại trong mô tế bào thực vật nhưng với hàm lượng rất thấp, vì vậy sự tách chiết rất tốn kém, điều đó đặt ra những nghiên cứu phát triển những công nghệ khác để thu nhận chúng. 2 Nguồn carotenoids/β-carotene được tìm thấy ở nhiều loài thưc vật khác nhau như cà chua, cà rốt, các loại hoa cúc có màu vàng, quả gấc…hay từ tảo Spirulina, Dunaliella salina, từ nấm mốc như Blakeslea trispora, từ nấm men đỏ Rhodotorula glutinis, R. rubra. Vì vậy, tôi đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ Enzyme đế sản xuất hợp chất thơm dẫn xuất carotenoids” Mục tiêu của đề tài gồm 2 phần: 1. Thu nhận nguồn carotenoids từ các nguồn thực vật khác nhau. 2. Chuyển hóa carotenoids thành chất thơm. 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về carotenoid 1.1.1. Các hợp chất carotenoid Carotenoid là một dạng sắc tố hữu cơ có tự nhiên trong thực vật và các loài sinh vật quang hợp khác như là tảo, một vài loài nấm và một vài loài vi khuẩn. Hiện nay người ta đã tìm được 600 loại carotenoid, sắp xếp theo hai nhóm, xanthophylls và carotene (Rao và Rao, 2007). Carotenoid thuộc nhóm tetraterpenoids (phân tử chứa 40 nguyên tử C) được tạo nên bởi 8 đơn vị isoprenne: CH2 = C – CH = CH2 | CH3 Carotenoid là nhóm chất màu hòa tan trong chất béo, không tan trong nước, có màu từ vàng nhạt tới đỏ sậm tùy cấu trúc phân tử. Khác với cây cỏ, con người không thể tự tổng hợp ra carotenoid mà sử dụng carotenoid từ việc ăn thực vật nhằm bảo vệ bản thân mình. Carotenoid giúp chống lại các tác nhân oxy hóa từ bên ngoài.Thiên nhiên có đến khoảng 600 loại carotenoid khác nhau, trong đó có 50 loại carotenoid hiện diện trong thực phẩm. Thế nhưng trong máu của người có khoảng 15 loại được tìm thấy và chúng đang được chứng minh là đóng vai trò quan trọng đối với đời sống con người. Carotenoid không phải là tên riêng của một chất nào mà là tên của một nhóm các hợp chất có công thức cấu tạo tương tự nhau và tác dụng bảo vệ cơ thể cũng tương tự nhau. Carotenoid khá quen thuộc với chúng ta là β-caroten hay còn gọi là tiền chất của vitamin A. Trong những năm gần đây người ta còn nói nhiều đến các carotenoid khác như lycopen, lutein và zeaxanthin [...]... dịch, thị giác, cơ quan sinh sản, … βcarotene đã được công nhận là hợp chất chống ung thư (Van và Goldbohm, 1995) 1.1.5.1.5 Ứng dụng và sản xuất thương mại của β-carotene Ngày nay, tác dụng phụ của chất hóa học trong thức ăn và sản xuất nông nghiệp là mối quan tâm lớn của các nhà khoa học Màu nhân tạo, hàn the và chất bảo quản trong quy trình sản xuất thực phẩm , sự phân hủy của chất bảo vệ thực vật tích... 1.2.2 Các hợp chất apocarotenoids 1.2.2.1 Sự hình thành hợp chất apocarotenoids Các liên kết đôi trong phân tử carotene dễ bị phân cắt do quá trình oxy hóa, dẫn đến sự hình thành của các dẫn xuất gọi là apocarotenoids Như đã trình bày ở phần 1.1.2, hương thơm tạo thành từ carotenoids/ βcarotene phụ thuộc vào số lượng cacbon và vị trí của nhóm oxy hóa Chúng được hình thành thông qua sự oxy hóa bởi enzyme. .. trong những enzyme được nghiên cứu nhiều nhất và nó tồn tại trong trên 60 loài động thực vật khác nhau LOX xúc tác phản ứng oxy hóa các axit béo không no đa chức (PUFA) chứa các hệ nối đôi liên hợp cis,cis-1,4-pentadiene để tạo thành dạng axit liên hợp hydroperoxydienoic LOX đậu tương là enzyme được nghiên cứu nhiều nhất còn LOX khoai tây ít được nghiên cứu hơn nhưng nó lại có tính chất gần với enzyme LOX... thời đã được áp dụng vào quy mô công nghiệp để sản xuất alpha- và betaionone với hiệu suất đạt được tới 200 mg/kg phản ứng Thành phần môi trường 26 phản ứng ở đây bao gồm nước ép cà rốt (nguồn carotenoids) , bột đậu tương (nguồn LOX) và dầu thực vật (nguồn acid béo không no) (Winterhalter & Rouseff, 2001) 1.2.1.1 Một số enzyme sử dụng để chuyển hóa carotenoids thành chất thơm 1.2.1.1.1 Enzyme Lipoxygenase... Các bước cơ bản chuyển hóa carotenoids thành chất thơm: trường hợp của beta-ionone và beta-damascenone từ beta-carotene và neoxanthin Một cách tiếp cận khác là sử dụng dịch chiết từ thực vật để chuyển hóa carotenoids thành chất thơm Trong trường hợp này, sự phân cắt chuỗi polyterpene được thực hiện bởi sự oxy hóa đồng thời sử dụng hệ enzyme lipoxygenase (LOX) hoặc các hệ enzyme oxygenase khác như phenoloxidase,... quang oxy hóa (photooxidation) từ các carotenoids trong thực vật, hoa, quả Cụ thể, các ionone được tìm thấy trong rất nhiều hương thơm của các loại quả như đào, mơ, mâm xôi và trong mùi hương của một số loại hoa như hoa violet Đã có nhiều công trình nghiên cứu sản xuất ionone từ carotenoids sử dụng enzyme, nhiệt độ và vi sinh vật [15, 20, 21, 22] Có rất nhiều chất thơm được tạo thành khi phân cắt phân... sinh vật có khả năng tạo được các chất tự điều chỉnh β-caroten được giữ lại trong hệ sợi, và nếu quá trình lên men kéo dài thì hiệu suất thu hồi các chất màu cũng bị giảm đi (Theo nguồn tài liệu: Đồ án Nghiên cứu nâng cao khả năng tổng hợp chất màu từ nấm sợi Blakeslea trispora”) 1.2 Sự oxy hóa phân tử carotenoids – Hợp chất apocarotenoids 1.2.1 Sự oxy hóa phân tử carotenoids Khi oxy hóa và phân cắt... hóa carotenoids thành chất thơm Sự chuyển hóa sinh học của phân tử carotenoids thường được cho là được xúc tác bởi hệ enzyme dioxygenase Tuy nhiên, cơ chế của quá trình này còn chưa được hiểu biết rõ Một cách chung nhất, quá trình chuyển hóa carotenoids thành chất thơm được chia làm 3 giai đoạn (Fleischmann và cộng sự, 2001): - Quá trình phân cắt bước đầu với enzyme dioxygenase - Chuyển hóa bởi enzyme. .. beta-carotene Các nghiên cứu và khảo sát tại Ý và Netherlands đã chứng minh rằng, Lycopene trong cà chua có tác dụng hiệu quả đến việc làm giảm tỉ lệ ung thư ở phần trên và phần dưới ruột như: thực quản, dạ dày, kết tràng và trực tràng, và nhất là làm giảm đáng kể nguy cơ ung thư tuyến tụy Nghiên cứu ung thư tại trường Y khoa Harward (Harward Medical School), Boston, USA (2004) có công bố về sự nghiên cứu liên... thể hấp thụ và sử dụng được Hiện tại thì các nghiên cứu chỉ ra rằng 12 khi sử dụng β-caroten tổng hợp β-caroten tự nhiên( có cả cis và trans) thì tốt hơn là sử dụng β-caroten tổng hợp theo con đường hóa học chỉ chứa dạng trans c Tính chất chống oxy hóa β- carotene là chất có hoạt tính chống oxy hóa ( Palozza và Krinsky , 1992) Tuy nhiên hoạt tính này thấp hơn Lycopene và một vài carotenoids khác Cơ . tôi đã thực hiện đề tài: Nghiên cứu ứng dụng công nghệ Enzyme đế sản xuất hợp chất thơm dẫn xuất carotenoids Mục tiêu của đề tài gồm 2 phần: 1. Thu nhận nguồn carotenoids từ các nguồn thực. thơm mới cũng như công nghệ mới để sản xuất các hợp chất tự nhiên. Một trong các lĩnh vực đang nổi lên về sản xuất các hợp chất là sử dụng công nghệ sinh học, đặc biệt là sử dụng enzyme và vi sinh. thành các chất thơm trong phản ứng tự oxy hóa carotenoids từ dầu gấc 54 3.4. Nghiên cứu khảo sát sự tạo thành các chất thơm từ carotenoids dầu gấc trong phản ứng đồng oxy hóa sử dụng enzyme xanthine