1.2.1. Sự oxy hóa phân tử carotenoids
Khi oxy hóa và phân cắt carotenoid (trong quá trình chín của quả hay trong quá trình tách chiết), có thể tạo ra các thành phần hợp chất bay hơi giống như các cấu tử hương thơm của thực vật như các hương thơm dẫn xuất từ carotenoid – là nguồn cơ chất của các thành phần hương thơm của các sản phẩm từ thực vật (Wintherhalter và Rouseff, 2001). Các thành phần hương thơm chính được hình thành trong quá trình oxy hóa phân rã của β-carotene bao gồm β- cyclocitral, β-ionone, 5,6-epoxy-β-ionone (EPBI) và dihydroactinidiolide (DHA), là các tinh dầu hương thơm có sự giống với mùi của các loại quả, hoa và gỗ. Các thành phần này có thể được tạo ra khi phân rã β-carotene bởi các phân tử oxy hoạt động (Reactif Oxygen Specises – ROS) và sự phân cắt thường diễn ra tại liên kết C9-10 (Bosser và Belin, 1994; Wache và cs, 2003). ROS có thể được tạo thành khi các aldehyde bị phân cắt bởi các Enzyme có hoạt tính hydroperoxide lyase như lipoxygenase hoặc xanthine oxidase (XO) (Bosser và Belin, 1994).
23
Các thành phần bay hơi chính khi cắt mạch β-carotene được trình bày trong hình 1.7. Các sản phẩm này có trong một số loại thực vật chứa β-carotene nhưng hàm lượng của chúng rất khác nhau tùy thuộc vào từng loài và thể hiện ở các phản ứng phân cắt carotenoid trong các điều kiện rất khác nhau trong môi trường tự nhiên. Trong thực tế, một số các sản phẩm có thể được oxy hóa tiếp và tạo ra các thành phần với các cấu tử hương thơm cảm nhận khác nhau (Cao Hoàng Lan và cộng sự, 2010).
Hình 1.8: Các thành phần hợp chất bay h i chính khi phân cắt β-carotene
( Theo Cao Hoàng Lan và cộng sự, 2010)
Do sự nhạy cảm của carotenoids ở nhiệt độ cao và trong điều kiện có oxy, dẫn đến sự hình thành các hợp chất bay hơi từ carotenoids là rất dễ dàng; Mordi và cộng sự đã phân tích các sản phẩm hình thành trong thời kì thoái hóa carotene trong benzen: carotenyl và Peroxycarotenyl được hình thành và phản ứng với beta-carotene dẫn đến hình thành ionones của epoxyiones (EPBI) và dihydroactinidiolide (DHA) trong vài giờ đầu tiên. Các hợp chất này cũng được tìm thấy trong sự oxy hóa của tất cả các trans-beta - carotene trong một hệ thống nhũ tương , gốc tự do được tạo ra bởi ảnh hưởng của nhiệt độ và oxy .Crouzet et al.(8) cho thấy rằng cấu trúc của carotene bị phân cắt đầu tiên là epoxidised và sau đó tách ra trong quá trình nhiệt dẫn đến sự hình thành của 5,6-epoxyionone (EPBI ), dihydroactinidiolide (DHA), beta-ionone và beta-cyclocitral.
24
Hình 1.9: Sự tạo thành chất thơm nhờ quá trình phân rã beta-carotene
( Theo Aguedo và cộng sư, 2004)
Các chuyển hóa carotenoids bằng con đường enzyme tính đến nay vẫn chưa được hiểu rõ. Tuy nhiên, cũng đã có nghiên cứu chỉ ra rằng enzyme tách chiết từ trà
xanh
có thể chuyển hóa phân tử carotene thành beta-ionone và một số các sản phẩm bay hơi khác. Ngoài ra, enzyme lipoxygenase từ đậu tương cũng được biết đến với khả năng chuyển hóa violaxanthin thành 3-hydroxy-3-ionone epoxyde. Từ đó
cho thấy phản ứng chuyển hóa phân tử carotenoids thành chất thơm bởi enzyme có thể vừa có tính đặc hiệu vừa không có tính đặc hiệu (vị trí cắt đặc hiệu trên
chuỗi nối đôi) (Enzell và cộng sự, 2001).
Sự tấn công không đặc hiệu bởi enzyme lên phân tử carotenoids có thể được giải thích bởi sự tấn công của oxy nguyên tử. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự tấn công của oxy nguyên tử lên phân tử beta-carotene được thực hiện tại vị trí nối đôi của cacbon số 11, 12, 9, 10, 8, 9 và 6, 7; đối với phân tử zaexanthine là các nối đôi ở vị trí 9, 10, 8, 9, 7, 8 và 6, 7; đối với phân tử violaxanthin là tại các vị trí 11, 12, 9, 10, và 8, 9.
25
Hình 1.10. Các bước trong quá trình chuyển hóa carotenoids thành chất thơm
Sự chuyển hóa sinh học của phân tử carotenoids thường được cho là được xúc tác bởi hệ enzyme dioxygenase. Tuy nhiên, cơ chế của quá trình này còn chưa được hiểu biết rõ. Một cách chung nhất, quá trình chuyển hóa carotenoids thành chất thơm được chia làm 3 giai đoạn (Fleischmann và cộng sự, 2001):
- Quá trình phân cắt bước đầu với enzyme dioxygenase
- Chuyển hóa bởi enzyme phân tử carotenoids thành các phân tử tiền chất thơm phân cực
- Chuyển hóa các phân tử tiền chất thơm không bay hơi thành các sản phẩm bay hơi bởi quá tình xúc tác acid.
Hình dưới đây minh họa quá trình hình thành beta-damascenone từ neoxanthine. Dẫn xuất oxy hóa của neoxanthine là cetone grasshopper và được xúc tác chuyển hóa sau đó thành cetone odorriferous. Đối với việc tạo thành beta-ionone thì không cần tới bước xúc tác acid.
26
Hình 1.11. Các bước cơ bản chuyển hóa carotenoids thành chất thơm: trường hợp của beta-ionone và beta-damascenone từ beta-carotene và
neoxanthin
Một cách tiếp cận khác là sử dụng dịch chiết từ thực vật để chuyển hóa carotenoids thành chất thơm. Trong trường hợp này, sự phân cắt chuỗi polyterpene được thực hiện bởi sự oxy hóa đồng thời sử dụng hệ enzyme lipoxygenase (LOX) hoặc các hệ enzyme oxygenase khác như phenoloxidase, lactoperoxidase, hay xanthine oxidase (XO).
Quá trình oxy hóa đồng thời đòi hỏi sự có mặt của enzyme, acid béo không no và carotenoids trong điều kiện hiếu khí. Người ta có thể sự dụng dịch chiết thô của enzyme LOX, nguồn giàu carotenoids như dầu cọ, dịch ép cà rốt, dịch chiết từ tảo Dunaliella …. Hầu hết các phản ứng oxy hóa đồng thời đều được thực hiện trong môi trường nước sau khi phân tán carotenoids cũng như các linoleate dưới sự trợ giúp của các chất tẩy rửa. Ngày nay, một quy trình ôxy hóa đồng thời đã được áp dụng vào quy mô công nghiệp để sản xuất alpha- và beta- ionone với hiệu suất đạt được tới 200 mg/kg phản ứng. Thành phần môi trường
27
phản ứng ở đây bao gồm nước ép cà rốt (nguồn carotenoids), bột đậu tương (nguồn LOX) và dầu thực vật (nguồn acid béo không no) (Winterhalter & Rouseff, 2001).
1.2.1.1. Một số enzyme sử dụng để chuyển hóa carotenoids thành chất thơm
1.2.1.1.1. Enzyme Lipoxygenase
Lipoxygenase (LOX) là một trong những enzyme được nghiên cứu nhiều nhất và nó tồn tại trong trên 60 loài động thực vật khác nhau. LOX xúc tác phản ứng oxy hóa các axit béo không no đa chức (PUFA) chứa các hệ nối đôi liên hợp cis,cis-1,4-pentadiene để tạo thành dạng axit liên hợp hydroperoxydienoic. LOX đậu tương là enzyme được nghiên cứu nhiều nhất còn LOX khoai tây ít được nghiên cứu hơn nhưng nó lại có tính chất gần với enzyme LOX động vật do có khả năng xúc tác phản ứng oxy hóa axit béo không no 20 cabon như axit arachidonic và tạo thành axit 15-hydroperoxyeicosatetranoic. Ở động vật thì hydroperoxyde này là cơ chất của các hoạt chất sinh học thường được sử dụng trong dược phẩm.
LOX đậu tương loại 1 (LOX-1) cũng được sử dụng để tẩy trắng bột mỳ và trong sản xuất bột nhào. Mặt khác, sự mất màu cũng là một thước đo độ tươi của một số sản phẩm rau quả khác như đậu vàng hay một số loại quả mà carotenoid đóng vai trò chất màu quan trọng.
LOX loại 2 (LOX-2) có trong đậu tương, đậu hà lan hay bột mỳ có khả năng làm mất màu carotene khi có mặt axit linoleic. Tuy nhiên, hầu hết các báo cáo hiện nay đều sử dụng LOX-1 từ đậu tương. Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng dưới điều kiện yếm khí thì enzyme này hoạt động mạnh khi có mặt axit béo không no hoặc các acyl hydroperoxyde tương ứng nhưng lại không có hoạt tính trong điều kiện hiếu khí.
28
Hình 1.12. Cấu trúc phân tử enzyme lipoxigenase (Wikipedia) 1.2.1.1.2. Enzyme Xanthine oxydase
Xanthine oxidase (XO) là một enzyme có khả năng sinh các gốc oxy hóa tự do (reactive oxygen species – ROS). Đây là một đại phân tử protein, có khối lượng khoảng 270 000 Da, gồm 2 phân tử flavin, 2 nhân molypden, 8 phân tử sắt trên một đơn vị enzyme. Nó xúc tác phản ứng oxy hóa hypoxanthine thành xanthine và sau đó thành axit uric. Đây là enzyme quan trọng trong chuyển hóa purine trong cơ thể động vật và người. Cơ chất của enzyme XO có thể là purine, pterine hoặc các aldehyde.
Hình 1.13: Cấu trúc tinh thể enzyme Xanthine oxidase tách chiết từ bò (Nguồn: wikipedia)
29
Enzyme XO có khả năng bị ức chế bởi sự có mặt của các chất flavonoids. Enzyme này cũng được ghi nhận là bị ức chế bởi các dung môi hữu cơ kị nước nhưng được ổn định với các dung môi phân cực (có logP >2). Tuy nhiên, trong môi trường quá phân cực (logP > 15) thì hoạt tính của XO lại bị ức chế.
1.2.2. Các hợp chất apocarotenoids
1.2.2.1 Sự hình thành hợp chất apocarotenoids.
Các liên kết đôi trong phân tử carotene dễ bị phân cắt do quá trình oxy hóa, dẫn đến sự hình thành của các dẫn xuất gọi là apocarotenoids.
Như đã trình bày ở phần 1.1.2, hương thơm tạo thành từ carotenoids/β- carotene phụ thuộc vào số lượng cacbon và vị trí của nhóm oxy hóa. Chúng được hình thành thông qua sự oxy hóa bởi enzyme và quang oxy hóa (photo- oxidation) từ các carotenoids trong thực vật, hoa, quả. Cụ thể, các ionone được tìm thấy trong rất nhiều hương thơm của các loại quả như đào, mơ, mâm xôi và trong mùi hương của một số loại hoa như hoa violet. Đã có nhiều công trình nghiên cứu sản xuất ionone từ carotenoids sử dụng enzyme, nhiệt độ và vi sinh vật [15, 20, 21, 22].
Có rất nhiều chất thơm được tạo thành khi phân cắt phân tử β-carotene, trong đó phổ biến nhất là các chất được tạo thành khi phân cắt nối đôi tại các vị trí C9, C10, C11, C13 [11].
β - carotene
30
4-oxoisophoron Safranal β-cyclocitral
Dihydroactinidiolide β-damascenone β-ionone
Hình 1.14: Một số apocarotenoid tạo thành khi phân cắt beta-caroten
Bảng 1.6. Sản phẩm phân rã chung của carotenoid tìm thấy trong thực vật
Tên Cấu trúc phân
tử Nguồn gốc
beta-Ionone
Rose, trà đen, cà chua, Blackberries, Quả mâm xôi, trái cây Passion, Cà rốt, thuốc lá, quả mơ, quả anh đào, Mango,
quả ớt chuông, Mai
alpha-Ionone
Nho khô, trà đen, Quả mâm xôi, cà rốt, thuốc lá, chuối, anh đào, mận, cần tây,
đậu, bắp, cà chua
beta-Damascone Rose, Osmanthus, trà đen, Mountain đu đủ, Rum, thuốc lá
31
beta-Damascenone
Nho, kiwi, xoài, cà chua, rượu vang, Rum, Quả mâm xôi, quả Passion, Blackberries
Dihydroactinodiolide Trà đen, cà chua, Cassia, Cassie, long diên hương, thuốc lá
beta-Cyclocitral trà, cà chua, Dưa đỏ, Paprika, Đậu Hà Lan, quả mơ, Brocolli, dưa hấu
1.2.2.2. Tình hình sản xuất hợp chất apocarotenoids.
Hiện nay tình hình sản xuất hợp chất thơm dẫn xuất carotenoids ở Việt Nam là hòa toàn mới mẻ, các công trình nghiên cứu cũng rất ít, còn đang ở bước đầu trên quy mô phòng thí nghiệm, chưa có đề tài nào nghiên cứu sự chuyển hóa sinh học của β-carotene thành các thành phần chất thơm bằng ứng dụng enzyme, vì vậy mà hiện nay Viện Công nghiệp thực phẩm đang tiến hành nghiên cứu đề tài này. Tuy nhiên cũng đã có nhiều nghiên cứu thu nhận
carotenoids ở nước ta. Việc thu nhận nguồn carotenoids cũng gặp nhiều khó khăn do tính chất rất nhạy cảm với ánh sáng, nhiệt độ, oxy,… của chúng. Vì vậy việc thực hiện phải tiến hành trong điều kiện tối ưu để giảm tối đa sự thất thoát hợp chất cần thu nhận.
Việc sản xuất hợp chất thơm dẫn xuất carotenoids có thể được coi là đề tài nghiên cứu triển vọng, đem lại lợi ích sức khỏe, cũng như nguồn lợi nhuận lớn nếu như nó được nghiên cứu thành công và đem sản xuất trên quy mô công
32
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Mục tiêu nghiên cứu
Mục tiêu nghiên cứu của đề taì này là xây dựng quy trình tách chiết carotenoids từ một số loài thực vật phổ biến, sau đó chyển hóa carotenoids thành chất thơm dựa trên trang thiết bị sẵn có và điều kiện của phòng thí nghiệm.
2.2. Vật liệu, Hóa chất và dụng cụ 2.2.1. Vật liệu 2.2.1. Vật liệu
Sinh khối nấm sợi Blakeslea trispora được cung cấp bởi Viện Công
nghiệp thực phẩm.
Β-carotene chuẩn (tổng hợp) được mua từ Fluka ( Sigma- Aldrich, St. Quentir fallavier, France) độ tinh khiết 98%.
Dầu Gấc-sản phẩm của trung tâm Dầu, Hương liệu và Phụ gia thực phẩm, Viện Công nghiệp thực phẩm.
2.2.2. Các hóa chất
Các hóa chất sử dụng đều đạt tiêu chuẩn về chất lượng và của các hãng nổi tiếng như Meck (Đức), Sigma (Mỹ), Difco (Pháp), CP (Trung Quốc) và Việt Nam bao gồm:
n-Hexane Petroleum ether Chloroform KH2PO4
Ethanol tuyệt đối
K2HPO4 NaOH HCl BHT Acetal dehyde Acetone EDTA Tween 80 H2O Diethyl Ether
36
2.2.3. Các chất chuẩn
_ β-carotene chuẩn, beta-ionone, DHA (Sigma) _ Enzyme XO (Sigma)
_ nội chuẩn Methyl Isoeugenol (Sigma)
2.2.4. Dụng cụ
_ Máy đo quang phổ hấp thụ, máy cô quay chân không, máy đồng hóa, máy lắc có điều nhiệt, máy sắc ký GC, máy đo pH, Cột Cuderna, Máy khuấy từ,
_ Tủ -20ºC, -80ºC, cân phân tích, tủ hood ,
_ Các dụng cụ thủy tinh như : bình định mức các loại, bình tam giác, ống đong, phễu chiết, phễu lọc, cốc thủy tinh, … micropipet,…
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1.Tách chiết carotenoids từ các nguồn khác nhau
Chuẩn bị dụng cụ: cốc thủy tinh, bình tam giác, phễu chiết, pipet, … tất cả đều được rửa sạch và sấy khô.
2.3.1.1. Tách chiết carotenoids từ cà rốt và gấc
_ Nguyên liệu:
+ Cà rốt và Gấc được mua ở chợ Vĩnh Hải, thành phố Nha Trang.
+ Cà rốt được chọn là những củ màu đỏ cam, còn tươi, sau đó được rửa sạch và bảo quản trong tủ -20ºC
+ Gấc: 3 quả Gấc chín, độ chín và khối lượng gần tương đương nhau ( quả 1 > quả 2 > quả 3). Sau đó Gấc được bổ ra và phân tách theo từng phần ( vở quả, thịt quả, màng quả, màng hạt, và hạt) và xác định hàm ẩm.
37
+ Mẫu trước khi tách chiết để xác định hàm lượng carotene đều được xay nhuyễn bằng máy xay sinh tố.
+ Thực hiện quá trình tách chiết trên 3 dung môi: ehanol , hexane , chloroform... thực hiện trong điều kiện tránh ánh sáng, nhiệt độ thấp, hạn chế tối đa tiếp xúc với oxy…
38 3 g mẫu xay nhuyễn + 10ml dung môi +
1ml BHT 1%
Dung dịch I Bã 10ml dung môi + 1ml
BHT 1%
Dung dịch II Bã 10ml dung môi + 1ml
BHT 1% Dung dịch III Trộn đều dung dịch I, II, và III Quét phổ _ Ngâm 15 phút _ Đồng hóa 3’(24000rpm) _ Lọc _ Ngâm 15 phút _ Đồng hóa 3’ (24000rpm) _ Lọc _ Ngâm 15 phút _ Đồng hóa 3’ (24000rpm) _ Lọc
Cô quay chân không thu cặn, bảo quản quản -20ºC
39 Quét phổ _ Ngâm 15 phút _ Đồng hóa 3’(24000rpm) _ Lọc _ Ngâm 15 phút _ Đồng hóa 3’ (24000rpm) _ Lọc
Cô quay chân không thu cặn, bảo quản quản -20ºC
Dung dịch I Bã 20ml n- Hexane Dung dịch II Bã 20ml n- Hexane Dung dịch III Trộn đều dung dịch I, II, và III _ Ngâm 15 phút _ Đồng hóa 3’ (24000rpm) _ Lọc Phân pha bằng H2O
Thu pha Hexane ở trên
10g sinh khối nấm sợi nghiền mịn + 50ml Ethanol + 2ml BHT 5%
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình tách chiết carotenoids từ cà rốt và Gấc. 2.3.1.2. Tách chiết carotenoids từ nấm sợi
40
Hình 2.2. Sơ đồ quy trình tách chiết carotenoids từ nấm sợi 2.3.2. Chuyển hóa carotenoids thành chất thơm
Nguyên liệu
Nguồn beta-carotene tinh khiết Nguồn beta-carotene từ dầu Gấc Nguồn beta-carotene từ nấm sợi Tween 80, enzyme XO, n-hexane
2.3.2.1 Tạo hợp chất thơm nhờ quá trình tự oxy hóa của carotenoids. a. Nguồn beta-carotene tinh khiết (tổng hợp) a. Nguồn beta-carotene tinh khiết (tổng hợp)
Tiến hành:
150mg beta-carotene chuẩn + 1.8ml Tween 80 đồng hóa 3’ (24000 rpm) hòa tan hỗn hợp vào 100ml Hexan khuấy từ ở tốc độ trung bình trong 5’ cô quay chân không bay hơi dung môi và thu hồi cặn (ở áp suất 550 mm Hg, 150 rpm, 40ºC) hòa tan lại cặn trong 50ml đệm Phosphate (50mM, pH 8), EDTA 0.25% lọc và thu dịch trong lắc ( 37ºC, 250 rpm) và quét phổ.
b. Nguồn beta-carotene từ dầu Gấc.
Quy trình 1:
0.5 g dầu Gấc + 6 ml Tween 80 đồng hóa 3’ (24000 rpm) hòa tan hỗn hợp vào 100ml Hexan khuấy từ ở tốc độ trung bình trong 5’ cô quay chân không bay hơi dung môi và thu hồi cặn (ở áp suất 550 mm Hg, 150 rpm,