Sắc kí lớp mỏng là phương pháp sắc kí dùng chất hấp phụ như ( silicagel, nhôm oxit,… ở dạng khô hay dạng nhũ, trong suốt không hấp thụ tia tử ngoại làm pha tĩnh, trải thành lớp mỏng trên tấm kính, tấm nhựa hay kim loại.
Quá trình tách các hợp chất xảy ra khi cho pha động là dung môi di chuyển qua pha tĩnh.
Như vậy: việc tách những sản phẩm được thực hiện dựa vào sự khác biệt về tốc độ rửa giải của một dung môi thích hợp (chất rửa giải, hệ dung môi, pha động) trên một giá mang chất hấp phụ rắn (pha tĩnh) đối với các thành phần trong một hỗn hợp.
Do đó, sắc kí bản mỏng là phương pháp phân tích cho phép tách, định tính và thử độ tinh khiết (tạp chất liên quan) rất có hiệu quả và đơn giản để xác định một lượng nhỏ các hợp chất hữu cơ.
45
Vì vậy, để đánh giá khả năng phân tích trên sắc kí bản mỏng, người ta dựa vào khả năng dịch chuyển
Rf là tỉ số giữa đại lượng dịch chuyển: vết chất x (khoảng cách từ vạch xuất phát đến tâm vết chất) và đại lượng dịch chuyển của dung môi xf (khoảng cách từ tuyến xuất phát đến tiền tuyến dung môi).
Rf = x / xf
Chú ý : Rf phải không phụ thuộc vào nồng độ và các yếu tố khác ( khi Rf được xác định trong điều kiện chuẩn )
Quá trình kĩ thuật sắc kí:
+ Chuẩn bị bản mỏng: bản mỏng là sắc kí giấy TLC, bình sắc kí sử dụng là bình hút ẩm
+ Chuẩn bị dung môi: cho dung môi vào cốc thủy tinh và đặt vào bình hút ẩm đến khi bão hòa hoàn toàn
+ Chấm dung dịch lên bản mỏng:
• Đánh dấu vạch xuất phát cách mép dưới khoảng 1-2 cm (tùy vào lượng dung môi trong cốc, lượng dung môi trong cốc không được chạm vạch).
• Dùng ống mao quản hay micropipet chấm dung dịch lên bản mỏng cách hai mép bên của bản mỏng 1-2 cm, khoảng cách giữa các vết chấm cách nhau ít nhất 1cm. Khi chấm không được làm thủng bản mỏng, vết chấm phải nhỏ, gọn, chứa lượng chất thử khoảng từ 1-10µl.
+Triển khai sắc kí: Là quá trình cho pha động chạy, kéo mẫu phân tích di chuyển
trên pha tĩnh. Đặt bản mỏng đã chấm mẫu vào bình, đậy nắp bình lại.
Sau đây là phương pháp định tính beta-carotene bằng phương pháp sắc kí bản mỏng
Thuốc thử :
46 Petroleum ether
Hexane ( Ethanol )
Cách tiến hành
Dung dịch thử: cân 0.5 g dầu Gấc vào bình định mức 5ml, hòa tan trong Hexane, định mức tới vạch.
Dung dịch đối chiếu: cân 20mg beta-carotene chuẩn cho vào bình định mức 10ml và định mức tới vạch.
Hệ dung môi triển khai: Petroleum Ether.
Chấm các vết: Chấm riêng rẽ 10µl dung dịch thử và dung dịch đối chiếu. Triển khai sắc kí: để bản mỏng vào bình, những vết chấm phải được nằm trên mức dung môi khoảng 1cm. Đậy bình lại và quan sát, khi nào dung dịch đi được khoảng 2/3 bản sắc kí thì lấy ra.
Phát hiện vết: Lấy bản sắc kí ra và để khô ở nhiệt độ phòng, sau đó cạo lớp silicagel chứa vết ra, hòa lại vào Ethanol tuyệt đối rồi tiến hành quét phổ.
Quét phổ ở bước sóng từ 300 – 550 nm.