2.2.1. Vật liệu
Sinh khối nấm sợi Blakeslea trispora được cung cấp bởi Viện Công
nghiệp thực phẩm.
Β-carotene chuẩn (tổng hợp) được mua từ Fluka ( Sigma- Aldrich, St. Quentir fallavier, France) độ tinh khiết 98%.
Dầu Gấc-sản phẩm của trung tâm Dầu, Hương liệu và Phụ gia thực phẩm, Viện Công nghiệp thực phẩm.
2.2.2. Các hóa chất
Các hóa chất sử dụng đều đạt tiêu chuẩn về chất lượng và của các hãng nổi tiếng như Meck (Đức), Sigma (Mỹ), Difco (Pháp), CP (Trung Quốc) và Việt Nam bao gồm:
n-Hexane Petroleum ether Chloroform KH2PO4
Ethanol tuyệt đối
K2HPO4 NaOH HCl BHT Acetal dehyde Acetone EDTA Tween 80 H2O Diethyl Ether
36
2.2.3. Các chất chuẩn
_ β-carotene chuẩn, beta-ionone, DHA (Sigma) _ Enzyme XO (Sigma)
_ nội chuẩn Methyl Isoeugenol (Sigma)
2.2.4. Dụng cụ
_ Máy đo quang phổ hấp thụ, máy cô quay chân không, máy đồng hóa, máy lắc có điều nhiệt, máy sắc ký GC, máy đo pH, Cột Cuderna, Máy khuấy từ,
_ Tủ -20ºC, -80ºC, cân phân tích, tủ hood ,
_ Các dụng cụ thủy tinh như : bình định mức các loại, bình tam giác, ống đong, phễu chiết, phễu lọc, cốc thủy tinh, … micropipet,…
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1.Tách chiết carotenoids từ các nguồn khác nhau
Chuẩn bị dụng cụ: cốc thủy tinh, bình tam giác, phễu chiết, pipet, … tất cả đều được rửa sạch và sấy khô.
2.3.1.1. Tách chiết carotenoids từ cà rốt và gấc
_ Nguyên liệu:
+ Cà rốt và Gấc được mua ở chợ Vĩnh Hải, thành phố Nha Trang.
+ Cà rốt được chọn là những củ màu đỏ cam, còn tươi, sau đó được rửa sạch và bảo quản trong tủ -20ºC
+ Gấc: 3 quả Gấc chín, độ chín và khối lượng gần tương đương nhau ( quả 1 > quả 2 > quả 3). Sau đó Gấc được bổ ra và phân tách theo từng phần ( vở quả, thịt quả, màng quả, màng hạt, và hạt) và xác định hàm ẩm.
37
+ Mẫu trước khi tách chiết để xác định hàm lượng carotene đều được xay nhuyễn bằng máy xay sinh tố.
+ Thực hiện quá trình tách chiết trên 3 dung môi: ehanol , hexane , chloroform... thực hiện trong điều kiện tránh ánh sáng, nhiệt độ thấp, hạn chế tối đa tiếp xúc với oxy…
38 3 g mẫu xay nhuyễn + 10ml dung môi +
1ml BHT 1%
Dung dịch I Bã 10ml dung môi + 1ml
BHT 1%
Dung dịch II Bã 10ml dung môi + 1ml
BHT 1% Dung dịch III Trộn đều dung dịch I, II, và III Quét phổ _ Ngâm 15 phút _ Đồng hóa 3’(24000rpm) _ Lọc _ Ngâm 15 phút _ Đồng hóa 3’ (24000rpm) _ Lọc _ Ngâm 15 phút _ Đồng hóa 3’ (24000rpm) _ Lọc
Cô quay chân không thu cặn, bảo quản quản -20ºC
39 Quét phổ _ Ngâm 15 phút _ Đồng hóa 3’(24000rpm) _ Lọc _ Ngâm 15 phút _ Đồng hóa 3’ (24000rpm) _ Lọc
Cô quay chân không thu cặn, bảo quản quản -20ºC
Dung dịch I Bã 20ml n- Hexane Dung dịch II Bã 20ml n- Hexane Dung dịch III Trộn đều dung dịch I, II, và III _ Ngâm 15 phút _ Đồng hóa 3’ (24000rpm) _ Lọc Phân pha bằng H2O
Thu pha Hexane ở trên
10g sinh khối nấm sợi nghiền mịn + 50ml Ethanol + 2ml BHT 5%
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình tách chiết carotenoids từ cà rốt và Gấc. 2.3.1.2. Tách chiết carotenoids từ nấm sợi
40
Hình 2.2. Sơ đồ quy trình tách chiết carotenoids từ nấm sợi 2.3.2. Chuyển hóa carotenoids thành chất thơm
Nguyên liệu
Nguồn beta-carotene tinh khiết Nguồn beta-carotene từ dầu Gấc Nguồn beta-carotene từ nấm sợi Tween 80, enzyme XO, n-hexane
2.3.2.1 Tạo hợp chất thơm nhờ quá trình tự oxy hóa của carotenoids. a. Nguồn beta-carotene tinh khiết (tổng hợp) a. Nguồn beta-carotene tinh khiết (tổng hợp)
Tiến hành:
150mg beta-carotene chuẩn + 1.8ml Tween 80 đồng hóa 3’ (24000 rpm) hòa tan hỗn hợp vào 100ml Hexan khuấy từ ở tốc độ trung bình trong 5’ cô quay chân không bay hơi dung môi và thu hồi cặn (ở áp suất 550 mm Hg, 150 rpm, 40ºC) hòa tan lại cặn trong 50ml đệm Phosphate (50mM, pH 8), EDTA 0.25% lọc và thu dịch trong lắc ( 37ºC, 250 rpm) và quét phổ.
b. Nguồn beta-carotene từ dầu Gấc.
Quy trình 1:
0.5 g dầu Gấc + 6 ml Tween 80 đồng hóa 3’ (24000 rpm) hòa tan hỗn hợp vào 100ml Hexan khuấy từ ở tốc độ trung bình trong 5’ cô quay chân không bay hơi dung môi và thu hồi cặn (ở áp suất 550 mm Hg, 150 rpm, 40ºC) hòa tan lại cặn trong 1000ml đệm Phosphate (50mM, pH = 8), EDTA 0.25% lọc và thu dịch trong lắc ( 37ºC, 250 rpm) và quét phổ.
Quy trình 2:
1,6 g dầu Gấc + 1.6 ml Tween 80 đồng hóa 3’ (24000 rpm) hòa tan hỗn hợp vào 100ml Hexan khuấy từ ở tốc độ trung bình trong 5’ cô quay
41
chân không bay hơi dung môi và thu hồi cặn (áp suất 550 mm Hg, 150 rpm, 40ºC) hòa tan lại cặn trong 80ml đệm Phosphate (50mM, pH 8), EDTA 0.25% được dung dịch A chia làm 2 bình:
+ Bình 1 (không pha loãng ): 50 ml A
+ Bình 2 (pha loãng 2.5f) : 20ml dung dịch A + 30ml đệm Phosphate (50mM, pH = 8), EDTA 0.25%.
lọc và thu dịch trong lắc (37ºC, 250 rpm) và quét phổ.
c. Nguồn beta-carotene từ nấm sợi.
Tiến hành :
3.0 g cặn sinh khối nấm sợi + 2 ml Tween 80 đồng hóa 3’ (24000 rpm) hòa tan hỗn hợp vào 100ml Hexan khuấy từ ở tốc độ trung bình trong 5’ cô quay chân không bay hơi dung môi và thu hồi cặn (150 rpm, 40ºC) hòa tan lại cặn trong 100ml đệm Phosphate (50mM, pH = 8), EDTA 0.25% lấy ra 50ml dung dịch cho vào bình tam giác lọc và thu dịch trong lắc (37ºC, 250 rpm) và theo dõi phổ trong 24h (cứ 2 giờ quét phổ 1 lần)
2.3.2.2. Tạo hợp chất thơm nhờ quá trình bổ sung Enzyme để oxy hóa carotenoids carotenoids
Quá trình đồng oxy hóa được thực hiện bằng cách thêm vào môi trường tự oxy hóa acetaldehyde (48mM) và enzyme Xathine oxidase (27.10-3 IU/ml). Hỗn hợp phản ứng được lắc ở 37oC, 250 rpm và theo dõi trong 24h, lấy mẫu định kỳ để xác định tốc độ phân rã của β-carotene và sự tạo thành các chất thơm.
Tách chiết chất thơm từ hỗn hợp phản ứng
Tất cả các mẫu tiến hành ở 2.3.2.1 và 2.3.2.2 sau đó được đem đi tách hương thơm bằng cách: Để tách chất thơm từ dung dịch, 4 ml mẫu phản ứng được tách chiết với diethyl ether (tỉ lệ 1:1 v/v), sau khi bổ sung methyl Isoeugenol
42
(10mg/l). Pha hữu cơ sau đó được cô đặc trong cột Cuderna ở 44oC đến thể tích 1 ml và được đem đi phân tích bằng sắc ký khí.
2.4. Phương pháp phân tích
Dịch tách chiết sau đó được định tính và định lượng β-carostene bằng hai phương pháp: phương pháp quang phổ hấp thụ UV-VIS và phương pháp sắc kí bản mỏng.
2.4.1. Phương pháp quang phổ hấp thụ UV-VIS
+ Định tính dựa trên nguyên tắc:
Thực hiện chức năng quét phổ trên máy UV-VIS: là chiếu chùm tia đơn sắc với một dãy các bước sóng qua dung dịch chất hấp thụ ánh sáng, khi đó các cấu tử trong dung dịch sẽ hấp thụ chọn lọc một số tia ở những bước sóng khác nhau tùy theo cấu trúc của mỗi chất. Bộ phận phân tích và hiển thị kết quả cho ta biết các thông tin về cực đại hấp thụ và hiển thị các phổ hấp thụ điện tử của các cấu tử trong dung dịch cần phân tích.
Nếu kết quả cho thấy cực đại hấp thụ và cường độ vân phổ hấp thụ điện tử của mẫu thử và mẫu chuẩn gần giống nhau trong khoảng bước sóng nhất định thì ta có thể định tính được mẫu nghiên cứu dựa trên mẫu chuẩn.
Ứng dụng vào định tính β-carotene và lycopene trong mẫu tách chiết bằng phương pháp quang phổ hấp thụ UV-VIS
Chuẩn bị dung dịch đo:
+ Mẫu phân tích: Là dung dịch đã tách chiết và định mức ở trên. + Mẫu chuẩn: Là mẫu β-carotene và lycopene tinh khiết.
Quét phổ:
Tiến hành quét phổ qua các dung dịch: mẫu đối chứng ( là dung môi sử dụng để pha mẫu : hexane, ethanol,...); mẫu phân tích và mẫu chuẩn trong khoảng bước sóng từ 300 – 550 nm.
43 lycopene 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 300 350 400 450 500 550 nm A b s lycopene chuan
mẫu lycopene phân tích
Hình 2.3. Phổ hấp thụ của Lycopene trong mẫu chuẩn và mẫu dầu Gấc
beta-carotene -1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 300 350 400 450 500 550 nm A b s
beta-caroten chuẩn
mẫu beta-carotene phân
tích
Hình 2.4. Phổ hấp thụ của beta-carotene trong mẫu chuẩn và mẫu dầu Gấc + Định lượng dựa trên nguyên tắc:
Từ kết quả của quá trình quét phổ trên máy quang phổ UV-VIS , ta sẽ thu được file excel, trong file excel có chứa tất cả các giá trị hấp thụ của cấu tử phân tích
44
tại từng bước sóng của dải sóng. Từ đó ta sẽ tính được hàm lượng của carotenoids dựa trên công thức sẵn có.
Công thức tính hàm lượng carotene :
[carotene] (mg/g) = ( Abs 450 * V ) / ( 2592 * m ) Trong đó :
_ Abs 450 : là độ hấp thụ quang phổ của cấu tử phân tích tại bước sóng 450 nm
_ V là thể tích mẫu _ 2592 là E 1%/ 1cm
_ m: là khối lượng mẫu tách chiết
2.4.2. Phương pháp sắc kí bản mỏng TLC
Sắc kí lớp mỏng là phương pháp sắc kí dùng chất hấp phụ như ( silicagel, nhôm oxit,… ở dạng khô hay dạng nhũ, trong suốt không hấp thụ tia tử ngoại làm pha tĩnh, trải thành lớp mỏng trên tấm kính, tấm nhựa hay kim loại.
Quá trình tách các hợp chất xảy ra khi cho pha động là dung môi di chuyển qua pha tĩnh.
Như vậy: việc tách những sản phẩm được thực hiện dựa vào sự khác biệt về tốc độ rửa giải của một dung môi thích hợp (chất rửa giải, hệ dung môi, pha động) trên một giá mang chất hấp phụ rắn (pha tĩnh) đối với các thành phần trong một hỗn hợp.
Do đó, sắc kí bản mỏng là phương pháp phân tích cho phép tách, định tính và thử độ tinh khiết (tạp chất liên quan) rất có hiệu quả và đơn giản để xác định một lượng nhỏ các hợp chất hữu cơ.
45
Vì vậy, để đánh giá khả năng phân tích trên sắc kí bản mỏng, người ta dựa vào khả năng dịch chuyển
Rf là tỉ số giữa đại lượng dịch chuyển: vết chất x (khoảng cách từ vạch xuất phát đến tâm vết chất) và đại lượng dịch chuyển của dung môi xf (khoảng cách từ tuyến xuất phát đến tiền tuyến dung môi).
Rf = x / xf
Chú ý : Rf phải không phụ thuộc vào nồng độ và các yếu tố khác ( khi Rf được xác định trong điều kiện chuẩn )
Quá trình kĩ thuật sắc kí:
+ Chuẩn bị bản mỏng: bản mỏng là sắc kí giấy TLC, bình sắc kí sử dụng là bình hút ẩm
+ Chuẩn bị dung môi: cho dung môi vào cốc thủy tinh và đặt vào bình hút ẩm đến khi bão hòa hoàn toàn
+ Chấm dung dịch lên bản mỏng:
• Đánh dấu vạch xuất phát cách mép dưới khoảng 1-2 cm (tùy vào lượng dung môi trong cốc, lượng dung môi trong cốc không được chạm vạch).
• Dùng ống mao quản hay micropipet chấm dung dịch lên bản mỏng cách hai mép bên của bản mỏng 1-2 cm, khoảng cách giữa các vết chấm cách nhau ít nhất 1cm. Khi chấm không được làm thủng bản mỏng, vết chấm phải nhỏ, gọn, chứa lượng chất thử khoảng từ 1-10µl.
+Triển khai sắc kí: Là quá trình cho pha động chạy, kéo mẫu phân tích di chuyển
trên pha tĩnh. Đặt bản mỏng đã chấm mẫu vào bình, đậy nắp bình lại.
Sau đây là phương pháp định tính beta-carotene bằng phương pháp sắc kí bản mỏng
Thuốc thử :
46 Petroleum ether
Hexane ( Ethanol )
Cách tiến hành
Dung dịch thử: cân 0.5 g dầu Gấc vào bình định mức 5ml, hòa tan trong Hexane, định mức tới vạch.
Dung dịch đối chiếu: cân 20mg beta-carotene chuẩn cho vào bình định mức 10ml và định mức tới vạch.
Hệ dung môi triển khai: Petroleum Ether.
Chấm các vết: Chấm riêng rẽ 10µl dung dịch thử và dung dịch đối chiếu. Triển khai sắc kí: để bản mỏng vào bình, những vết chấm phải được nằm trên mức dung môi khoảng 1cm. Đậy bình lại và quan sát, khi nào dung dịch đi được khoảng 2/3 bản sắc kí thì lấy ra.
Phát hiện vết: Lấy bản sắc kí ra và để khô ở nhiệt độ phòng, sau đó cạo lớp silicagel chứa vết ra, hòa lại vào Ethanol tuyệt đối rồi tiến hành quét phổ.
Quét phổ ở bước sóng từ 300 – 550 nm.
2.4.3. Phân tích các thành phần chất thơm bằng sắc kí khí (GC)
Sử dụng phương pháp sắc ký khí (Gas chromatography) (GC): Được thực hiện tại Trung tâm phân tích, Viện Khoa học hình sự, Bộ Công An.
Nguyên tắc
Mẫu được bơm vào trong và theo dòng khí mang (khí mang thường là N2) đưa đến cột sắc ký (pha tĩnh). Mẫu khi qua cột này sẽ được hấp phụ lên trên pha tĩnh đó. Sau đó, các chất lần lượt tách khỏi cột theo dòng khí ra ngoài được ghi nhận bởi đầu dò. Từ các tín hiệu nhận được máy tính sẽ xử lý và biểu hiện kết quả bằng sắc ký đồ. Các chất được xác định nhờ giá trị thời gian lưu trên sắc ký đồ.
47 Tiến hành
Sau khi cô đặc pha hữu cơ chứa cấu tử chất thơm trong cột Cuderna ở 44oC đến thể tích bằng 1 ml, đem đi phân tích.
Chất chuẩn: β-ionone, β-cyclocitral, β-damascenoce, DHA (Sigma): Pha mẫu chuẩn: 100 l /100 ml bằng n-hexane.
Phân tích bằng mấy sắc ký HP6890 với FID (tốc độ H2 30 ml/phút, không khí 300 ml/ phút) và cột mao dẫn HP-Inowax HP-1909 1N-113. Nhiệt độ của lò đốt được tăng đều từ 75oC đến 250oC với tốc độ 1,5oC/ phút. Tốc độ gas cài đặt ở 4 ml/ phút. Tiêm mẫu 1 µl trong tỉ lệ 10 :1
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả tách chiết carotenoids từ các nguồn khác nhau.
Carotenoids là một dạng sắc tố hữu cơ có tự nhiên trong các loài thực vật, chúng có khả năng giúp chống lại các tác nhân oxy hóa, làm giảm nguy cơ mắc các bệnh về tim mạch, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư phổ,… Vì vậy, việc bổ sung hàm lượng carotenoids từ trong các loại thực phẩm vào bữa ăn hàng ngày là điều quan trọng. Đặc biệt là beta-carotene, là tiền sinh tố A, giúp làm giảm các vấn đề về thiếu hụt vitamin A, đặc biệt là ở các nước kém phát triển.
Bảng 3.1. Kết quả tách chiết carotenoid tổng số (µg/g) khối lượng tươi từ ba nguồn cà rốt, Gấc và nấm sợi B.trispora
48
Tên thực vật Hàm lượng carotenoids (µg/ 100 g)
Cà rốt 2332
Gấc 39877
Nấm sợi (sinh khối khô) 10300
Hình 3.1: Biểu đồ hàm lượng carotenoids tổng số (µg/100g) trong các mẫu thí nghiệm
Nhận xét: Từ bảng so sánh trên ta thấy, hàm lượng carotenoids trong Gấc là cao nhất, cao gấp 17 lần so với cà rốt và gấp gần 4 lần so với nấm sợi. Theo các
0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000 40000 Cà rốt Gấc Nấm sợi (sinh khối khô) H à m l ư ợ n g c a ro te n o id s Tên thực vật Hàm lượng carotenoids tổng số (µg/100 g) Hàm lượng carotenoids (µg/100 g)
49
nghiên cứu trước đây, hàm lượng lycopene trong Gấc là cao nhất, tỉ lệ cao gấp 70 lần so với cà chua, và hàm lượng beta-carotene cao gấp 10 lần so với cà rốt và khoai lang. Ngoài ra, các carotenoids trong Gấc còn liên kết với các acid béo mạch dài, tạo ra kết quả là nó có hoạt tính sinh học cao hơn.
Theo các báo cáo trước đây, (đặc biệt là kết quả trong phần 3.2 dưới đây) chỉ ra rằng: trong Gấc chỉ chứa 2 nguồn carotenoids có giá trị về mặt sinh học nhất là Lycopene và β-carotene, mà theo bảng kết quả tách chiết ở trên, hàm lượng carotenoids tổng số trong Gấc là cao nhất, có thể nói là cao nhất trong các loài thực vật đã điều tra hàm lượng carotenoids ở Việt Nam. Từ kết quả trên cho thấy, việc sử dụng trực tiếp quả Gấc hay các sản phẩm từ Gấc một cách thường xuyên sẽ giúp ta chống lại được một số căn bệnh ung thư phổ biến, hơn nữa còn tăng khả năng làm chậm và ngăn ngừa quá trình lão hóa da, mang lại một làn da tươi trẻ, kéo dài tuổi thanh xuân, đây là thông tin bổ ích cho phái đẹp.